贝类中沙门氏菌、阪崎肠杆菌双重RT-PCR检测方法研究.pdf

质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING0引言食源性致病菌是引起食品安全问题的主要因素之一袁新鲜水产品中往往带有大量微生物袁多种致病菌可同时长期存活于水体环境中袁增加水产品在养殖过程中被致病菌污染的可能性袁进而造成人类食物中毒1-4遥 沙门氏菌尧阪崎肠杆菌等致病菌可导致许多严重疾病袁沙门氏菌是一种广泛分布于自然界中的危害极大的肠道致病菌袁人类感染沙门氏菌可引起伤寒尧副伤寒尧感染性腹泻尧食物中毒尧败血症尧胃肠炎和菌血症等症状1-2袁4袁感染阪崎肠杆菌主要表现为败血症尧致死性小肠结肠炎尧脓毒症尧脑膜炎和菌血症等4遥随着人们对食品安全的重视程度与食品安全监督监测需求的不断提高袁以及进出口贸易的需要袁传统的微生物检测方法通过增菌培养尧分离纯化尧生化鉴定等进行鉴定17袁因检测步骤繁琐尧检测周期长尧效贝类中沙门氏菌尧阪崎肠杆菌双重 RT-PCR 检测方法研究田立杰1聂丹丹1丁旭2闫聪1李玲1孙玉3罗雁非1*渊1.长春海关技术中心 吉林长春130062曰2.吉林国际旅行卫生保健中心曰3.吉林省中医药科学研究院冤摘要院旨在建立一种快速尧高效尧经济尧实用的双重实时荧光 PCR 方法袁能同时快速尧灵敏尧特异地检测贝类中沙门氏菌尧阪崎肠杆菌的双重实时荧光 PCR 体系遥 本研究以水产品中贝类为目标袁根据特定基因序列袁设计特异性扩增引物和 TaqMan 荧光探针袁通过优化反应体系和条件袁每种引物探针体系均可以特异性检测目标致病菌类型遥 2 套引物探针体系组合可同时检测沙门氏菌尧阪崎肠杆菌遥双重 RT-PCR 方法的最低检测限可低至 0.002 ng 或 0.02 ng 基因组/反应袁变异系数均小于 2%遥利用建立的双重 RT-PCR 方法检测 14 份贝类产品样本袁样品实测结果与国家标准方法的检测结果一致袁符合率为 100%遥 结果表明袁本研究建立的双重 RT-PCR 方法具有特异性尧敏感性高尧重复性好等优点袁为贝类产品中沙门氏菌尧阪崎肠杆菌的快速检测提供了新的技术方法遥关键词院双重实时荧光 PCR曰贝类曰沙门氏菌曰阪崎肠杆菌中图分类号院Q93-331Study on dual RT-PCR detection method for Salmonellaand Enterobacter sakazakii in shellfishTIAN Lijie1袁NIE Dandan1袁DING Xu2袁YAN Cong1袁LI Ling1袁SUN Yu3袁LUO Yanfei1*渊1.Changchun Customs Technical Center袁Changchun Jilin袁130062袁China曰2.Jilin International Travel Healthcare Center曰3.Jilin Province traditional Chinese Medicine Institute冤Abstract院The aim is to establish a fast袁efficient袁economical袁and practical dual real-time fluorescent PCR method that cansimultaneously袁sensitively袁and specifically detect Salmonella and Enterobacter sakazakii in shellfish.This study targets shell-fish in aquatic products and designs specific amplification primers and TaqMan fluorescent probes based on specific genesequences.By optimizing the reaction system and conditions袁each primer probe system can specifically detect the targetpathogen type.The combination of two primer probe systems can simultaneously detect Salmonella and Enterobacter sakaza鄄kii.The minimum detection limit of the dual RT-PCR method can be as low as 0.002 ng or 0.02 ng genome/reaction袁withcoefficients of variation less than 2%.The established dual RT-PCR method was used to detect 14 samples of shellfish 袁and the measured results of the samples were consistent with the detection results of the national standard method袁with acompliance rate of 100%.The results indicate that the dual RT-PCR method established in this study has the advantages ofspecificity袁high sensitivity袁and good repeatability袁providing a new technical method for the rapid detection of Salmonella andEnterobacter sakazakii in shellfish.Keywords院Dual real-time fluorescence PCR曰Shellfish曰Salmonella曰Enterobacter sakazakii第一作者 E-mail院曰*通信作者 E-mail院基金项目院长春海关科技计划项目渊CCHG2023KY14冤曰长春海关科技计划项目渊CCHG2023KY13冤收稿日期院2023-09-01窑83窑QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期率低尧对人员要求高袁同时因低灵敏度和低特异性导致容易错判等问题5-7袁难以满足现代贸易快速检测的要求和食品安全监督监测的需要遥 水产品中致病菌检测的现行标准 GB 4789.208仍要求使用传统方法袁检测步骤繁琐尧检测时间长袁难以满足新鲜水产品的贸易和检测需求袁因此袁开发更加快速高效的检测水产品中沙门氏菌和阪崎肠杆菌的方法具有实际意义遥如今袁有许多免疫学尧分子生物学尧生物传感器等新检测方法被应用于水产品中致病菌的检测鉴定11-13袁16遥目前袁对于水产品中沙门氏菌的检测袁有多重PCR 方法尧实时荧光 PCR尧微滴数字 PCR 方法11-13袁16袁例如院麻丽丹等2建立了 Taqman MGB PCR 定量检测水产品中沙门氏菌的方法曰麻春阳等14建立了多重实时荧光串联 PCR 技术高通量检测生蚝中 9 种致病菌的方法曰李亚茹等15采用免疫磁珠分离实时荧光 PCR 快速检测虾中沙门氏菌遥但对于水产品中阪崎肠杆菌的分子生物学等快速检测方法并不多见袁尚未有一种简单高效的多重检测方法袁能在短时间内同时快速地检测水产品中沙门氏菌和阪崎肠杆菌这 2 种致病菌遥本研究以水产品中常见的贝类产品为目标袁设计引物探针袁 建立双重实时荧光 PCR 检测方法袁可用于水产品中沙门氏菌和阪崎肠杆菌的同时快速检测袁对指导水产品中致病菌的检测尧加强食品安全监督监测工作尧保护水产品养殖业尧促进水产品进出口贸易发展具有重要意义遥1材料与方法1.1材料研究中所需海虹尧扇贝尧蚬子尧鲍鱼尧牡蛎尧毛蚶尧血蚶尧凤螺尧乌贼尧蛏子袁10 种贝类产品均采购于当地市场遥对实验室样品渊红贝尧黄贝尧纹贝尧象贝冤4 种贝类产品进行本底实验袁每种平行 3 次遥对未添加标准物质的样品进行本底测试实验袁检测样品本底是否有含有目标菌遥确定阴性样品后袁将已购置的待检测 2 种标准菌院 沙门氏菌渊ATCC12011冤和阪崎肠杆菌渊JL.2046冤袁以及本研究选用的非目标菌株如上处理进行特异性实验袁 选用的菌株如下院金黄色葡萄球菌渊ATCC 12600冤尧蜡样芽胞杆菌渊ATCC 11176冤尧李斯特菌渊ATCC 19119冤尧普通变形杆菌渊ATCC 33420冤尧小肠耶尔森菌渊ATCC 23715冤尧大肠杆菌渊ATCC 11229冤尧克雷伯氏菌渊ATCC 43086冤尧粪肠球菌渊ATCC 14500冤尧单核细胞增生李斯特氏菌渊ATCC 19111冤尧阴沟肠杆菌渊ATCC10146冤尧志贺氏菌渊JL 08036冤遥1.2试剂除另有规定外袁所有试剂均为分析纯遥实验用水符合 GB/T 6682 中二级水的要求遥缓冲蛋白胨水渊BPW袁见 GB 4789.4 中 A.1冤院2伊Taq PCR Master Mix渊批号院N20630冤尧2%CTAB渊批号院HC28172940冤尧10伊Tris/Tricine/SDS Buffer渊批号院20200510冤曰蛋白酶 K渊批号院No.160020444袁QIAGEN冤曰三氯甲烷渊氯仿冤 CHCl3渊批号院20161225袁北京化工厂冤曰异戊醇 C5H12O渊批号院20000805袁沈阳市水丰化学试剂冤曰无水乙醇 C2H5OH渊批号院20180518袁北京化工厂冤曰TIANamp Genomic DNA Kit 血液/细胞/组织基因组 DNA 提取试剂盒渊批号院#S7628冤曰实时荧光 PCR 2 倍预混液渊批号院00699230袁ABi冤遥1.3仪器Milli-Q-Integral 5 型纯水/超纯水系统渊美国密理博冤曰AL104IC 型电子天平 渊中国梅特勒冤曰MLS-3780 型高压灭菌器 渊日本三洋冤曰7A0-0052 型核酸蛋白检测仪渊日本日立公司冤曰Elf-Pad 型金属浴渊中国北京佰欧创投生物科技有限公司冤曰FORCE 7 型离心机渊美国丹法冤曰E-centrlfuge 型离心机渊美国威泰克冤曰MICRO ONE 型离心机渊日本 TOMY冤曰S20K型酸度计渊中国上海梅特勒冤曰Vortex.Genie 2 型漩涡混合器渊美国 SI 公司冤曰SLM-140AY65 型制冰机渊日本三洋冤曰QuantStudio 7 荧光定量 PCR 仪 渊美国ABI冤曰0.12.5 滋L 型移液器尧220 滋L 型移液器尧20200 滋L 型移液器尧1001 000 滋L 型移液器渊德国 ep鄄pendorf 公司冤遥1.4样品处理对红贝尧黄贝尧纹贝尧海虹尧扇贝尧蚬子尧象贝 7种常见水产品进行本底实验袁每种平行 3 次遥 取样方法院使用无菌剪刀打开至少 10 个贝类袁取出贝类消化腺置于无菌培养皿中袁收集 2.0 g袁将消化腺匀浆后装入无菌离心管中袁在无菌条件下对贝类进行取样并均质遥 对未添加标准物质的样品进行本底测试实验袁检测样品本底是否含有目标菌遥 确定阴性样品后袁将已购置的待检测 2 种标准菌复壮袁制成阳性对照品袁制成一定浓度的菌悬液袁按照浓度 0.5尧1尧5尧10 CFU/mL对原样品进行添加尧均质袁做灵敏度实验及特异性实验遥沙门氏菌按照 GB 4789.4要2016 方法进行9曰阪崎肠杆菌培养按照 GB 4789.40要2016 方法进行10曰非目标菌株增菌采用 LB 培养液 36益培养 24h 的方法遥1.5细菌模板 DNA 的提取对于上述方法培养的增菌液袁各取增菌液 1 mL窑84窑质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING均加至 1 个 1.5 mL 无菌离心管中袁8 000 r/min 离心5 min袁尽量吸弃上清液袁加入 500 滋L CTAB尧40 滋L蛋白酶 K袁震荡均匀袁65益温浴 30 min曰加入 500 滋L三氯甲烷院异戊醇渊24颐1冤袁震荡袁12 000 r/min 离心15 min曰吸取上层水相至 1.5 mL 离心管中袁加入等体积的异丙醇袁震荡均匀袁12 000 r/min 离心 10 min曰弃上清液袁用预热至 65益 TE 缓冲液溶解 DNA渊TE 量视 DNA 沉淀的多少而定冤曰加入 5 滋L RNA 酶溶液袁37益温浴 30 min曰 加入 200 滋L 三氯甲烷院 异戊醇渊24颐1冤袁震荡袁12 000 r/min 离心 15 min曰吸取上层水相至新的 1.5 mL 离心管中袁 加入等体积的异丙醇袁震荡均匀袁12 000 r/min 离心 10 min曰弃上清液袁加入70%乙醇洗涤沉淀 DNA袁12 000 r/min 离心 1 min曰弃上清液袁干燥袁加 50 滋L 预热至 65益 TE 缓冲液溶解DNA遥取适量 DNA 溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后袁 使用核酸蛋白检测仪测定 260 nm 和 280 nm 处的吸收值袁从而确定 DNA 浓度最优浓度范围袁以便PCR 扩增遥1.6引物探针参考了国内外学者相关研究论文和试验结论袁引物的序列见表 1遥 沙门氏菌特异性基因序列尧阪崎肠杆菌的特异性基因序列遥沙门氏菌和阪崎肠杆菌得到如下的反应体系和扩增参数院沙门氏菌模板 DNA 5 滋L袁上尧下游引物各 1 滋L袁 探针 1 滋L曰 阪崎肠杆菌模板 DNA 5 滋L袁上尧下游引物各 0.5 滋L袁探针 0.5 滋L曰2伊dd PCR 预混液 15 滋L袁反应体积为 20 滋L渊见表 2冤遥1.7目的基因片段 PCR 扩增实时荧光 PCR 循环参数院50益预变性 2 min袁94益预变性 10 min曰95益变性 15 s袁60益退火 60 s袁循环 40 次遥1.8PCR 扩增产物测序及数据处理将剩余的 PCR 产物送至上海生工生物工程有限公司进行双向测序袁应用 EditSeq 软件编辑整理袁在 GenBank 上进行 Blast 比对验证物种遥1.9统计学分析应用 SPSS 17.0 软件对数据进行统计学分析袁计量资料已均数依标准差渊x依s冤表示袁数据符合正态分布袁多组间比较采用单因素方差分析袁两两比较采用 LSD 法检验袁检验水准渊双侧冤袁P约0.05 表示差异具有统计学意义袁P约0.01 表示极差异具有统计学意义遥2结果与分析2.1特异性试验本研究采用双重实时荧光 PCR 方法对沙门氏菌和阪崎肠杆菌的引物进行特异性研究 渊见图 1冤遥阴性菌为院副溶血弧菌渊ATCC 17802冤尧霍乱弧菌渊JL.08108冤尧单核细胞增生李斯特氏菌渊ATCC 19111冤尧李斯特菌渊ATCC 19119冤尧普通变形杆菌渊ATCC 33420冤尧金黄色葡萄球菌渊ATCC 12600冤尧小肠耶尔森菌渊ATCC23715冤尧克雷伯氏菌渊ATCC 43086冤尧粪肠球菌渊ATCC14500冤尧蜡样芽胞杆菌渊ATCC 11176冤尧奇异变形杆菌渊JL08017冤遥沙门氏菌和阪崎肠杆菌均在 35 个循环表 1PCR 检测的靶基因尧引物序列Table 1Target Gene and primer sequence of PCR检测基因引物序列沙门氏菌特异性基因上游引物院5爷-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3爷下游引物院5爷-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3爷探针院5爷-渊NED冤-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-渊TAMRA冤-3爷阪崎肠杆菌特异性基因上游引物院5爷-GGCGAGCGGCGAATATTAT-3爷下游引物院5爷-CGGGTTTTCCCAGTTGAGATC-3爷探针院5爷-渊FAM冤-CACCAGTTTTCGGTGCGCCAGC-渊BHQ冤-3爷表 2双重 PCR 反应体系Table 2Dual PCR reaction system试剂成分体积/滋L2伊dd PCR 预混液15上游引物渊10 滋mol/L冤阪崎0.5下游引物渊10 滋mol/L冤阪崎0.5上游引物渊10 滋mol/L冤沙门氏菌1.0下游引物渊10 滋mol/L冤沙门氏菌1.0探针渊10 滋mol/L冤阪崎0.5探针渊10 滋mol/L冤沙门氏菌1.0样品 DNA渊1耀100 ng/滋L冤5.0注院空白对照实验时袁用双蒸水替代样品 DNA曰阴性对照实验时袁用非目标源性成分替代样品 DNA曰阳性对照实验时袁用沙门氏菌和金黄色葡萄球菌阳性成分 DNA遥窑85窑QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期2.3灵敏性试验将测得浓度为 108CFU/mL 的 DNA 溶液按照10 倍浓度依次稀释袁 取浓度为 108耀103CFU/mL 的基因序列进行检测袁前 4 个梯度设置 8 个重复袁后 4 个梯度设置 4 个重复袁其结果见图 3 和图 4遥从浓度 103CFU/mL 开始袁各梯度均出现明显扩增曲线袁可判断该引物探针的检出限为浓度 103CFU/mL遥实验结果表明袁 引物探针对沙门氏菌和阪崎肠杆菌的扩增有较好的灵敏性遥图 2沙门氏菌和阪崎肠杆菌重复性实验Fig.2Repeatability experiment of Salmonella and Enterobacter sakazakii2.2重复性试验本研究对沙门氏菌和阪崎肠杆菌设定 30 次重复性实验渊见图 2冤袁实验结果表明袁实时荧光 PCR对其扩增稳定且重复性良好袁实验数据可信遥内发生显著扩增袁而对照菌株均无显著性检测信号袁亦未出现非特异性扩增信号袁表明设计的 2 对引物特异性好尧识别度高尧无干扰现象遥 实验结果表明袁引物对沙门氏菌和阪崎肠杆菌的扩增具有特异性遥图 1沙门氏菌和阪崎肠杆菌双重引物特异性实时荧光 PCRFig.1Dual primer specific real-time fluorescent PCR of Salmonella and Enterobacter sakazakii窑86窑质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING图 3沙门氏菌和阪崎肠杆菌双重灵敏性实验Fig.3Double sensitive experiment of Salmonella and Enterobacter sakazakii图 4沙门氏菌和阪崎肠杆菌 6 个连续稀释度标准曲线Fig.4Standard curves for six consecutive dilutions ofSalmonella and Enterobacter sakazakii2.4本底试验本实验采用 14 种贝类进行本底实验袁每种平行3 次袁进行本底实验袁经实验验证均未检出沙门氏菌和阪崎肠杆菌遥3讨论按照我国食品安全国家标准要求袁 沙门氏菌和阪崎肠杆菌在水产品中均不得被检出袁 这 2 种致病菌的快速检测方法开发也成为食品安全检测中的研究热点遥传统的水产品中沙门氏菌和阪崎肠杆菌的检测方法袁对检验人员的经验要求较高袁且耗时长尧效率低袁容易造成检测结果误判遥 而实时荧光 PCR 技术成本低尧准确性高尧灵敏度高尧操作简单尧自动化程度高袁可同时检测大量样品袁提高了检测效率袁缩短了检测周期袁实用性强袁而且不易出现结果误判遥与传统培养法相比袁RT-PCR 技术鉴定病原菌具有较高的灵敏度袁且检测周期明显缩短袁因可同时检测 2 种致病菌袁 比单一 RT-PCR 检测更迅速尧简便袁且更节约成本遥 双重 RT-PCR 虽在时效性及操作简便等方面有明显优势袁 但其要求多个不同靶基因片段同时扩增袁 因而在引物设计尧 反应条件的优化尧反应体系的配置等环节均需反复试验袁建立最佳反应条件袁 以期最大程度上避免非特异性扩增及片段间的竞争性扩增袁实现高效灵敏尧特异性强的扩增反应袁具有一定难度遥传统水产品中致病菌检测方法耗时较长袁 在国际贸易中形成时间障碍袁 应用有效的分子生物学等快速检测方法有助于解决主要问题遥 本研究开发出了一种可用于贝类中沙门氏菌和阪崎肠杆菌的双重实时荧光 PCR 检测方法袁 可在一个 PCR 管内特异灵敏地检测 2 种目标致病菌袁 适用于沙门氏菌和阪崎肠杆菌的鉴定袁 在食品和水源的卫生监测和流行病学调查方面也有一定的应用潜力遥 该方法具有成本低尧可靠性高和检测快速的优点袁易于推广使用袁在食源致病菌同时多重检测平台的建立中具有广泛的应用前景遥4结论综上所述袁本研究建立的双重实时荧光 PCR 检测方法具有快速高效尧灵敏度高尧特异性好尧重复性好的优点袁 可用于贝类中沙门氏菌和阪崎肠杆菌的同时快速检测袁本研究为贝类中沙门氏菌尧阪崎肠杆菌的快速鉴定探索了有效的检测方法袁 为控制贝类产品致病菌污染提供了有效手段遥窑87窑QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期参考文献1黎财慧袁游淑珠袁王小玉袁等.食品中沙门氏菌活菌的TaqMan 实时荧光 PCR 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