Notch1介导有氧运动改善阿尔茨海默病小鼠海马超微结构与空间记忆能力.pdf

885基础研究2023年，第38 卷，第7 期中國广复医学集志Notch1介导有氧运动改善阿尔茨海默病小鼠海马超微结构与空间记忆能力张业廷1魏翠兰2李垂坤3袁琼嘉4.5摘要目的：观察DAPT抑制Notch1后，有氧运动对阿尔茨海默病（Alzheimersdisease，A D)小鼠海马组织病理学的改变，探究有氧运动能否通过Notch1改善AD小鼠的病理学特征及学习记忆能力。方法：将3月龄APP/PS1双转基因AD小鼠随机分为4组：对照组（ADv）、运动对照组（ADv+E）No t c h 1抑制组（ADp）和运动中Notch1抑制组（ADp+E），每组2 0 只。对照组自然喂养，运动组进行有氧运动干预，自然喂养或运动干预均为2 0 周。在第18 周注射溶剂或Notch1抑制剂，第19 周进行为期1周的Morris水迷宫实验，第2 0 周进行为期1周的八臂迷宫实验，评估小鼠的学习记忆能力。随后取脑组织，采用电镜技术检测神经元及其突触损伤等病理变化，采用实时PCR、免疫荧光及WesternBlot技术分别检测A沉积及Notch1表达。结果：在MWM水迷宫实验的过程中，ADv+E组的表现显著优于AD组小鼠（P0.05），A D p+E组与AD,组小鼠表现没有显著差异,ADp组与ADv组小鼠表现没有显著差异,ADv+e组的表现显著优于ADp+e组小鼠(P0.05)。在八臂迷宫的最终测试实验中，ADv+e组的表现显著优于ADv组小鼠（P0.05）,A D p+E组与ADp组小鼠表现没有显著差异，ADp组与ADv组小鼠表现没有显著差异，ADv+组的表现优于ADp+E组小鼠（P0.05）。通过电镜发现，与ADv组相比，ADv+e组突触的数量显著增加,其PSD厚度相较于ADv组也有显著增加(P0.05);ADp+E组与ADp组之间在突触的数量、PSD厚度及突触间隙之间的距离没有显著差异AD,组与ADv组之间在突触的数量、PSD厚度及突触间隙之间的距离没有显著差异；与ADv+e组相比,ADp+E组突触的数量显著降低,其PSD厚度相较于ADv组也有显著降低（P0.05）。通过实时PCR、免疫荧光及WesternBlot研究发现与ADv组小鼠相比，ADD组小鼠海马DG区Notch1的表达显著降低（P0.05），A 1-42没有显著差异；ADv+组小鼠海马DG区Ai-42、No t c h 1表达显著低于ADv组（P0.05）；ADp+E组小鼠海马DG区Ai-42、No t c h 1的表达与ADp组相比没有显著差异。结论：抑制Notch1会抑制运动对AD小鼠病程及学习记忆能力的改善作用。因此，Notch1可能是运动改善AD小鼠的病理学特征及学习记忆能力的重要影响因子。关键词阝阿尔茨海默病；有氧运动；Notchl；学习记忆中图分类号：R493，R7 49.1文献标识码：A文章编号：10 0 1-12 42(2 0 2 3)-0 7-0 8 8 5-0 13Notch1 mediates aerobic exercise-induced improvements of hippocampal ultrastructure and spatial memo-ry in Alzheimers disease mice/ZHANG Yeting,WEI Cuilan,LI Chuikun,et al./Chinese Journal of Reha-bilitation Medicine,2023,38(7):885897AbstractAbstractObjective:To observe the changes of aerobic exercise on hippocampal histopathology of Alzheimers disease(AD)mice after inhibiting Notch1 signaling pathway by DAPT,and explore whether aerobic exercise can im-prove the pathological characteristics and learning and memory ability of AD mice through Notch1.Method:Three months old APP/PS1 double transgenic AD mice were randomly divided into four groups:con-D0I:10.3969/j.issn.1001-1242.2023.07.004D01:10.3969/j.issn.1001-1242.2023.07.004*基金项目：四川省科技计划项目（2 0 2 0 YFH0184)；中央高校基本科研业务费资助项目-博士创新能力提升计划项目（PHD2023-003）1中国民用航空飞行学院航空安全保卫学院，四川省广汉市，6 18 30 7；2 成都理工大学体育学院；3成都大学体育学院；4成都体育学院运动医学与健康学院；5通讯作者第一作者简介：张业廷，男，博士，讲师；收稿日期：2 0 2 2-0 4-2 886Chinese Journal of Rehabilitation Medicine,Jul.2023,Vol.38,No.7trol group(ADv),exercise control group(ADv+E),Notch1 inhibition group（A D p)a n d e x e r c i s e No t c h 1 i n h i b i-tion group(ADp+E),20 mice in each group.The control group did not receive exercise intervention,while theexercise group received aerobic exercise intervention.Natural feeding or exercise intervention lasted for 20weeks.solvent or Notchl inhibitors were injected at 18 weeks.To assess the learning and memory abilities,Morris Water Maze(MWM)was tested at 19 weeks,and eight-arm maze was tested at 20 weeks.Subsequent-ly,brain tissue was taken and pathological changes were detected by electron microscopy.Real time PCR,immu-nofluorescence and Western Blot were used to detect A deposition and Notchl expression,respectively.Result:In the MWM testing,the ADv+E group had better performance than that the ADv group(P0.05),there was no significant difference between ADp+E group and ADp group,as well as between ADp group andADv group,and the performance of ADv+E group was better than that of the ADp+group(P0.05).In the 8arm maze testing,the performance of ADv+E group was btter than that of the ADv group(P0.05),andthere was no significant difference between ADp+e group and ADp group,as well as between ADp group andADv group,and the performance of ADv+E group was better than that of the ADp+E group(P0.05).The re-sults of electron microscopy showed that the mitochondrial morphology of mice in ADv+E group was significant-ly better than that of the mice in AD group(P0.05).Compared with the ADv group,the number of synaps-es and the PSD thickness were significantly increased(P0.05).There were no significant differences in thenumber of synapses,the thickness of PSD and the distance between synaptic gaps between ADp+E group andADp group,as well as between ADp group and ADv group.Compared with the AD+E group,the number ofsynapses in the ADp+e group was significantly decreased,and the PSD thickness in the ADp+e group was alsosignificantly decreased compared with the ADv group(P0.05).The results of real time PCR,immunofluores-cence and Western blot showed that compared with the ADv group,the expression of Notchl in the ADpgroup was significantly decreased(P0.05),while the expression of Ai-42 showed no significant difference.The expressions of Ai-2 and Notchl in the ADv+E group were significantly lower than those in the ADv group(P0.05).The hippocampal expressions of Ai-42 and Notch1 in the ADp+E group had no significant differenceswith those in the ADp group.Conclusion:Inhibiting the expression of Notchl perhaps can inhibit the exercise-induced improvement of thedisease course and learning and memory ability of AD mice.Therefore,Notchl signaling pathway may be animportant factor in the exercise-induced improvement of pathological characteristics and learning and memoryability of AD mice.Authors address China Civil Aviation Flight University,Guanghan,Sichuan,618307KeywordAlzheimers disease;aerobic exercise;Notchl;learning and memoryNotch信号通路是一种高度保守的信号通路，在细胞的分化、增殖、突触可塑性和细胞存活中发挥关键作用。在成年中枢神经系统损伤后，其Notch信号通路能够调控神经干/祖细胞向神经元/胶质细胞分化,从而参与和调控神经系统的修复过程2 。而有研究表明，阿尔茨海默病（Alzheimers dis-ease，A D)患者脑部多存在Notch信号通路异常，但这些信号通路在成熟神经系统中的功能和阿尔茨海默病发病中的作用尚未完全明确3。淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，A PP)被分泌酶(-secretase)裂解，产生一种神经毒性淀粉样蛋白肽（A my l o i d -protein，A），被认为与AD患者的神经变性有关4-5。早老素(presenilin，PS)是分泌酶蛋白水解复合物的催化分子，它的突变是早发型家族性AD的主要原因。除了APP外，分泌酶底物还包括Notch1同源物、Notch配体Delta和Jagged以及其他I型膜蛋白。分泌酶对Notch1蛋白水解的改变可能参与AD的发病机制4。因此,对AD中Notch1信号通路的研究对于阐明AD的多种发病机制以及治疗和预防AD具有重要意义。1材料与方法1.1实验动物及分组SPF级健康3月龄APP/PS1双转基因AD小鼠，体重2 5g一30 g，购于“南京大学一南京生物医药研究院”，许可证号：苏ICP备10 0 7 39 18 号-3。动物的8872023年，第38 卷，第7 期中國广复医学集志饲养条件：环境清洁安静，室温2 0 一2 8，相对湿度为40%一6 0%，模拟自然光照条件，每日光照12 h，自由摄取动物饲料和饮用纯净水，每周换经过紫外线严格消毒的垫料、食物及饮用水。将AD小鼠适应性喂养1周后随机分为4组：对照组（ADv），运动对照组（ADv+E）,No t c h 1抑制组（ADp）与运动中Notch1抑制组（ADp+E），每组2 0 只。ADv组及AD,组不进行运动，ADv+E组及ADp+e组进行有氧运动干预。在自然喂养或运动干预17 周后，在第18 周注射溶剂或Notch1抑制剂(DAPT)溶于DMSO中，在第18 周，ADp组ADp+组连续7 天以10 mg/kg/d的剂量对小鼠进行腹腔注射;ADv组ADv+e组注射连续7 天以相同的剂量对小鼠进行DMSO溶剂腹腔注射,在第19周进行为期1周的Morris水迷宫实验（Morriswa-termaze，M W M），在第2 0 周进行为期1周的八臂迷宫实验，第18 周一2 0 周同样对运动组小鼠进行运动干预。随后取材进行相关指标的检测（图1）。1.2有氧运动方案在运动训练开始前，所有的运动组小鼠适应跑步机环境10 min，连续两天（第一天5m/min，第二天8m/min）。适应结束后，各运动组进行跑台运动，每周5天，每天30 min，持续5个月。在每次训练过程中，以10 m/min的速度开始跑5min，然后以15m/min跑2 0 min，最后以10 m/min的速度跑5min结束8-9 。在这种强度下，当小鼠停止不运动时，不对小鼠进行电刺激，只轻柔地触摸尾巴让小鼠继续运动。1.3Morris水迷宫实验在小鼠自然喂养或运动干预最后1周进行为期7天的Morris水迷宫实验。包含定位航行实验与空间探索实验两个部分。定位航行实验中，按照分组及编号的顺序将小鼠头朝下、面朝池壁依次从圆形水池I至IV象限的边缘中点放入水池里，视频采集的同时松开小鼠，此时采集分析系统会自动追踪小鼠在水池中的轨迹，记录游泳速度，并分析记录小鼠从每个象限入水至爬上水下平台的时间，这段时间我们称之为“逃避潜伏期”。小鼠爬上水下平台，并保持10 s后，系统将自动停止录像分析。如果超过120s后，小鼠还未找到水下平台，则由实验者用木棍将其轻轻地引导至平台并让其在平台上停留10s,此时的逃避潜伏期记录为12 0 s。计算每只小鼠每天从4个象限人水点入水后的平均游泳速度和平均逃避潜伏期，并绘制折线图以观察变化趋势。最后1次定位航行实验结束2 4h后进行空间探索实验，小鼠在拆除了平台的圆形水池中会寻找记忆中的平台位置，主要用来评估小鼠的空间记忆保持能力。记录其在6 0 s内的运动轨迹、穿越原平台所在区域的次数以及在目标象限中的游泳时间。1.4八臂迷宫实验小鼠在第2 0 周进行八臂迷宫实验，实验前先称重，禁食2 4h)。此后每天训练结束后限制性地给予正常食料（据体重不同，喂食约2 一3g），以使体重保持在正常进食时小鼠体重的8 0%一8 5%。第二天，迷宫各臂及中央区分撒着食物颗粒（每只4一5粒，直径约3一4mm）。然后，同时将4只小鼠置于迷宫中央（通往各臂的门打开）。让其自由摄食、探究10min，每天训练两次，其间间隔1h以上。第三天，重复第二天的训练。第四天起，动物单个进行训练：在每个臂靠近外端食盒处各放一颗食粒，让动物自由摄食。食粒吃完或10 min后将动物取出。第五天,将食物放在食盒内，重复前一天的训练。第六天图1动物实验程序时间轴腹腔注射MWM八臂迷宫DAPT或溶剂实验1周实验1周对照组：3月龄开始，自然喂养5个月2448hOw1718W19W20W内取材田运动组：3月龄开始，运动干预5个月八腹腔注射MWM八臂迷宫DAPT或溶剂实验1周实验1周888ChineseJournaloffRehabilitationMedicine,Jul.2023,Vol.38,No.7以后，随机选4个臂，每个臂放一颗食粒；各臂门关闭，将动物放在迷宫中央；30 s后，臂门打开，让小鼠在迷宫中自由活动并摄取食粒，直到小鼠吃完所有4个臂的食粒。如经10 min食粒仍未吃完，则实验终止。记录工作记忆错误及参考记忆错误等。1.5脑组织取材和相关指标检测脑组织取材于八臂迷宫实验结束后2 4h一48 h内进行。每组随机取6 只用于制作冰冻切片以备免疫荧光观察分析，6 只用于制作超薄切片进行电镜技术观察分析，6 只用于提取mRNA及蛋白进行实时PCR及Western Blot检测。1.5.1切片的取材与制备：经心脏快速灌注生理盐水及慢速灌注预冷至4的4%多聚甲醛后,用眼科剪、镊子迅速剥开颅骨取出脑组织，并放入4%多聚甲醛溶液中固定2 4h，然后将脑组织依次放人10%、20%、30%的蔗糖溶液中进行梯度脱水5一7 d。在冰冻切片机中制作厚度为5um的切片，置于-2 0 冰箱中保存备用。1.5.2样品制备及透射电镜检测海马神经细胞超微结构：经心脏快速灌注生理盐水及慢速灌注预冷至4的4%多聚甲醛后，用眼科剪、镊子迅速剥开颅骨取出脑海马组织，选择海马DG区，将其修成1mm3组织块放人装有3%戊二醛的EP管中，4条件放置24h,PBS溶液洗涤3次10 min。将海马DG区组织经四氧化钱固定、丙酮梯度脱水和树脂包埋后，用超薄切片机对其进行切片（10 0 nm），贴附于铜网格上。经醋酸铀及枸橡酸铅双重染色后,在H一6 0 0 IV型透射电镜下观察、照相。1.5.3免疫荧光染色观察海马蛋白表达：通过免疫荧光实验检测相关蛋白表达量。取出事先切好保存于2 0 冰箱的冰冻脑组织切片，在4环境下于4%多聚甲醛中固定10 min。用PBS清洗两次后，在组织切片上滴加3%的过氧化氢溶液封闭，避光室温孵育2 5min，于4环境下孵育一抗过夜。第二天，PBS清洗后，用荧光抗体（1:10 0，R&DSystemsUSA)37C环境下避光孵育1h。采用DAPI进行核染色。利用OLYMPUS显微镜获得荧光图像，使用Image-Pro+6.0软件分析荧光强度(AU/m)。1.5.4实时PCR检测海马神经发生相关基因的mRNA表达：提取海马组织mRNA，将提取的mRNA于当天反转录为cDNA(PCR引物见表1,反转录反应条件见表2)。在PCR管中配置qPCR反应体系，加人12.5l的MaximaSYBRGreenqPCRMasterMix试剂，加人上下游引物（5M）,D NA模板（10 0 0 ng），用不含核酸酶的ddH,0配至2 5l（q PCR反应条件见表3）。完全混合预混液，分配至八联管中。将八联管放人CFX96实时荧光定量仪中，按三步法循环方案进行反应。反应结束后，分析PCR产物的熔解曲线,确定反应特异性。数据处理采用2-ACT(Livak)方法。1.5.5WesternBlot技术分析观察海马蛋白相对表达水平：通过WesternBlot实验检测海马组织中相关蛋白表达量。用湿转方法将蛋白质转至PVDF膜上（15一2 0 mA电流转膜30 min）。去脂牛奶封闭目的蛋白条带1h,之后用一抗分别将带有相应目的蛋白的PVDF膜在4C环境中孵育过夜。第二天，TBST液洗涤PVDF膜，然后用二抗室温孵育1h;洗涤后进行化学发光、显影、定影，获得蛋白印迹图像。扫描胶片，利用Gel proplus软件对内参蛋白和目的蛋白进行光密度(OD)值的分析。1.6统计学分析所有定量数据用均数土标准差表示，并运用SPSS统计分析软件进行分析处理。Morris水迷宫实验中定位航行试验包含三个因素进行2（运动干预方表1PCR引物序列及扩增产物长度产物指标引物序列长度-actinF:5-GTG CTA TGT TGC TCT AGA CTT CG-3174R:5-ATG CCA CAG GAT TCC ATA CC-3A1-42F:5-TGA ATG TGC AGA ATG GAA AGT G-3224R:5-AAC TAG GCA ACG GTA AGG AAT C-3NotchlF:5-GTG CTG GAA GTA TTT TAG CGA C-3130R:5-GTC CTT GCA GTA CTG GTC ATA C-3表2反转录反应条件步骤温度()时间(min)循环数孵育42601加热7051表3qPCR反应条件步骤温度()时间循环数预变性9510min1变性9515s退火57.530s40延伸7230s保持条件65955s/8892023年，第38 卷，第7 期中國席复医学集志式)2(注射药剂)6(时间)的三因素混合设计重复方差分析；空间探索实验包含两个因素进行2（运动干预方式)2(注射药剂)的两因素被试间方差分析(two-way between-subjects ANOVA)。其余实验包含两个因素进行2（运动干预方式)2(注射药剂)的两因素被试间方差分析(two-way between-subjectsANOVA。整个分析过程中,对不满足球形检验的统计量采用GreenhouseGeisser法矫正，事后比较采用Bonferroni，显著性水平设定为P0.05。使用GraphPadPrism8及Photoshop软件进行图片制作。2结果2.1小鼠Morris水迷宫检测结果在Morris水迷宫定位航行训练实验的过程中，随着训练实验天数的增加，各组小鼠的平均逃避潜伏期出现逐渐减小的趋势。通过重复方差分析逃避潜伏期结果，以注射药剂和时间为主效应量，分析运动干预方式对小鼠潜伏期的影响：ADv+组从第四天开始每天的逃避潜伏期显著低于ADv组（P0.05）。以运动干预方式和时间为主效应量，分析注射药剂对小鼠潜伏期的影响：AD,组与ADv组小鼠的平均逃避潜伏期之间没有显著差异(P0.05）；A D v+e 组与ADp+E组小鼠的平均逃避潜伏期在第六天出现显著差异（P0.05);ADv+组小鼠从第三天开始潜伏期逐渐降低，在训练实验的第6 天开始表现出最短逃避潜伏期降(P0.05);ADp+E组小鼠的平均逃避潜伏期出现逐渐减小的趋势，但是它们之间并没有显著的差异(P0.05)（图2 A）。以上的数据能够说明ADv组小鼠的空间参考学习能力最差；ADp+E组小鼠的空间参考学习能力与AD,组相似,均未有显著改善；而ADv+e组小鼠的空间参考学习能力较强，并且随着训练实验次数和天数的增加，能够通过参照水迷宫内壁的标记物建立寻找水下隐藏平台位置的记忆。通过重复方差分析泳速，各组之间无显著差异（P0.05）（图2 B）,这表明各组小鼠并无游泳运动障碍，且在MWM定位航行训练实验中的逃避潜伏期差异并非由运动障碍所造成。通过两因素被试间方差分析小鼠在目标象限中所用时间，各组之间无显著差异（P0.05）（图2 C、E),表明运动干预方式与注射药剂为主效应量均不能对小鼠在目标象限停留时间产生显著改变，且它们的交互作用不显著。通过两因素被试间方差分析小鼠穿越原有平台区域的次数，其中ADv+E组小鼠穿越原有平台区域的次数显著高于ADv组，ADp+组小鼠穿越原有平台区域的次数与ADp组相比没有显著差异（P=0.001,P=0.858)；A D p 组小鼠穿越原有平台区域的次数与ADv组相比没有显著差异，ADp+E组小鼠穿越原有平台区域的次数显著低于ADv+E组(P=0.736,P0.0005)(图2 D、E)。2.2小鼠八臂迷宫检测结果在八臂迷宫的最终测试实验中，记录了工作记忆错误次数、工作记忆错误率、参考记忆错误次数、参考记忆错误率四项指标。通过两因素被试间方差分析工作记忆错误次数发现，ADv+E组小鼠的工作记忆错误次数显著低于ADv组，ADp+E组小鼠的工作记忆错误次数与ADp组相比没有显著差异(P=0.013，P=0.793）；A D p 组小鼠的工作记忆错误次数与ADv组相比没有显著差异，ADp+E组小鼠的工作记忆错误次数与ADv+E组相比没有显著差异（P=0.082;P=0.527）（图3A）。通过两因素被试间方差分析工作记忆错误率发现，ADv+E组小鼠的工作记忆错误率显著低于ADv组，ADp+E组小鼠的工作记忆错误率与AD,组相比没有显著差异（P=0.005,P=0.574);ADp组小鼠的工作记忆错误率与ADv组相比没有显著差异，ADp+e组小鼠的工作记忆错误率与ADv+E组相比没有显著差异（P=0.054;P=0.672）（图3B）。通过两因素被试间方差分析参考记忆错误次数发现,ADv+E组小鼠的参考记忆错误次数显著低于ADv组，ADp+E组小鼠的参考记忆错误次数与AD,组相比没有显著差异（P=0.001,P=0.782);ADp组小鼠的参考记忆错误次数与ADv组相比没有显著差异,ADp+E组小鼠的参考记忆错误次数显著高于ADv+E组（P=0.657;P=0.004)（图3C）。通过两因素被试间方差分析参考记忆错误率发现，ADv+E组小鼠的参考记忆错误率显著低于ADv组，ADp+E组小鼠的参考记忆错误率与890Chinese JournaloffRehabilitation Medicine,Jul.2023,Vol.38,No.7图2小鼠在Morris水迷宫实验中的表现AB150147ADvADv+E13-7ADD100-ADD+E12-王ADv11ADv+E50-ADD10-ADD+E09123456(d)123456(d)DC2.07(s)iueupenb 1.535-1.030-0.5250.020ADvADv+EADDADD+EADvADv+EADDADD+EEVTVVVADvADv+EADDADD+E注：（A)Morris水迷宫实验平台；(B)平均逃避潜伏期；(C)小鼠平均游泳速度；(D)小鼠穿越平台平均次数；(E)小鼠穿越平台路线图。与AD组对比P0.05：与ADv+组相比AP0.05,AD组相比没有显著差异（P0.0005,P=0.53）A D p组小鼠的参考记忆错误率与ADv组相比没有显著差异，ADp+组小鼠的参考记忆错误率显著高于ADv+E组(P=0.415,P=0.006)(图3D)2.3小鼠海马电镜检测结果图4为小鼠海马DG区神经细胞超微结构图，图中红色箭头指向细胞核核膜，蓝色箭头指向线粒体。在电镜下可观察到,AD各组小鼠海马DG区神经锥体细胞细胞核核膜有一定程度的皱缩、内陷及溶解断裂现象，图中为紫色箭头所示（图4）；细胞的胞质中细胞器数量（如线粒体、内质网、高尔基复合体等)较少，其中部分线粒体出现肿胀与空泡现象，而有些线粒体溶解消失，高尔基囊泡出现扩张，内质网则出现轻度扩张和液泡化现象；细胞核核膜皱缩，呈锯齿样内陷，染色质固缩边聚（图4）。虽然ADv组及ADp组小鼠海马DG区神经细胞细胞核核膜都出现了一定程度的皱缩、内陷、溶解断裂现象，但是ADv+e组小鼠的线粒体形态明显优于其余其他AD组小鼠。以上这些变化表明有氧运动可能在一定程度上预防APP/PS1双转基因小鼠的海马DG区神经细胞受损以及退化的现象，而注射DAPT对这种受损及退化过程似乎没有显著改善作用。本研究以海马DG区为关注点，采用电镜分析技术对海马DG区的突触结构进行观察,并对突触数量、突触间隙（synaptic gap，SG)宽度、突触后致密物(postsynaptic densities，PSD)厚度、突触囊泡(synaptic vesicles，SV)等突触结构参数进行了定量分析。图5A为小鼠海马DG区突触超微结构8912023年，第38 卷，第7 期中國广复医学集志图3小鼠在八臂迷宫实验中的表现AB107507840-630-420-2-10-00ADvADv+EADADD+EADvADv+EADDADD+ECD107807860-640-420200ADvADv+EADDADD+EADvADv+EADDADD+EEADvADv+EADDADD+E注：（A)工作记忆错误次数；（B)工作记忆错误率；(C)参考记忆错误次数；(D)参考记忆错误率；（E)小鼠八臂迷宫路线图。与ADv组对比OP0.05:与ADv+组相比AP0.05）。通过两因素被试间方差分析小鼠海马DG区突触间隙距离发现，各组之间没有显著差异(P0.05）。以上数据可以表明，APP/PS1转基因AD小鼠海马DG区突触出现了受损、退化的情况（图5B-D）。长期有氧运动可以显著增加APP/PS1转基因AD小鼠海马突触的数量，但是注射DAPT并不能起到同样的效果，甚至还可能会抑制运动带来的益处2.4小鼠海马A检测结果图6 A为小鼠海马A1-42mRNA表达情况。通过两因素被试间方差分析小鼠海马Ai-42mRNA表达结果：ADv+E组Ai-42mRNA表达显著低于ADv组，ADp+E组Ai-42mRNA表达与AD,组相比没有显著差异(P=0.655）;A D 组Ai-42mRNA表达与ADv组相892Chinese Journal of Rehabilitation Medicine,Jul.2023,Vol.38,No.7图4小鼠海马DG区神经细胞超微结构2000倍电镜下的神经细胞6000倍电镜下的神经细胞ADADADb-1AD注：左列图中标尺为5m；右列图中标尺为2 m。比没有显著差异，ADD+E组Ai1-42mRNA表达显著高于ADv+E组（P=0.013）。图6 B为小鼠海马Ai-42蛋白表达情况。通过两因素被试间方差分析小鼠海马Ai-42蛋白表达结果：ADv+E组Ai-42蛋白表达显著低于ADv组，ADp+E组Ai-42蛋白表达显著低于ADp组(P0.0005,P=0.022);ADp组Al-42蛋白表达与ADv组相比没有显著差异，ADp+E组A1-42蛋白表达显著高于ADv+组(P=0.102,P0.0005)。利用荧光显微镜对免疫荧光切片进行扫描成像，并利用CaseViewer软件选取所需区域图片。图7中蓝色代表DAPI标记的细胞核，红色代表Ai-42免疫阳性产物表达。采用Image-ProPlus6.0软件进行荧光强度测量。通过两因素被试间方差分析小鼠海马DG区的Ai142免疫阳性产物荧光强度：ADv+E组Ai-42免疫阳性产物荧光强度显著低于ADv组，ADp+e组Ai-42免疫阳性产物荧光强度与ADp组相比没有显著差异（P0.0005,P=0.196);ADb组Ai-42免疫阳性产物荧光强度与ADv组相比没有显著差异，ADp+组Ai142免疫阳性产物荧光强度显著高于ADv+E组(P=0.498,P0.0005)（图8 A)。通过两因素被试间方差分析小鼠海马CA3区的Ai-42免疫阳性产物荧光强度：ADv+E组A1-42免疫阳性产物荧光强度显著低于ADv组，ADp+E组Ai-42免疫阳性产物荧光强度与AD,组相比没有显著差异(P0.0005,P=0.519);ADp组Ai-42免疫阳性产物荧光强度与ADv组相比没有显著差异,ADp+E组Ai-42免疫阳性产物荧光强度显著高于ADv+组（P=0.581,P0.0005)（图8 A）。通过两因素被试间方差分析小鼠海马CA1区的Ai-42免疫阳性产物荧光强度：ADv+E组Ai-42免疫阳性产物荧光强度显著低于ADv组，ADp+组Ai-42免疫阳性产物荧光强度与AD,组相比没有显著差异（P0.0005,P=0.828);ADp组Ai-42免疫阳性产物荧光强度与ADv组相比没有显著差异,ADp+e组Ai-42免疫阳性产物荧光强度显著高于ADv+E组（P=0.834,P0.0005）（图8C)。这表明AD转基因小鼠海马组织中出现了大量的A沉积，而长期有氧运动似乎可以减少其海马组织中A142的沉积,但是注射DATP并不能显著降低9月龄AD小鼠A1-42的沉积。2.5小鼠海马Notchl检测结果图9 A为小鼠海马Notch1mRNA表达情况通过两因素被试间方差分析小鼠海马Notch1mRNA表达结果：ADv+E组Notch1mRNA表达显著低于ADv组,ADp+组Notch1 mRNA表达与AD,组相比没有显著差异（P=0.003，P=0.331）；A D p 组Notch1mRNA表达与ADv组相比没有显著差异，ADp+E组Notch1mRNA表达与ADv+E组相比没有显著差异（P=0.193,P=0.304）。图9 B为小鼠海马Notch1蛋白表达情况。通过两因素被试间方差分析小鼠海马Notch1蛋白表达结果：ADv+E组Notchl蛋白表达显著低于ADv组，ADp+E组Notch1蛋白表达与ADp组相比没有显著差异（P0.0005，P=0.198）A D,组Notch1蛋白表达显著低于ADv组，ADp+E组Notch1蛋白表达显著低于ADv+E组（P0.0005,P0.0005）。图10 中蓝色代表DAPI标记的细胞核，红色代表Notchl免疫阳性产物表达。图8932023年，第38 卷，第7 期中國广复医学集志图5小鼠海马DG区突触超微结构4000倍电镜下的突触结构15000倍电镜下的突触结构AB25201510ADVADV-250ADvADv+EADDADp+E4020-0ADvADvEAD,ADD+EDAD-1AD.-22015-10-5AD.OADvAD+EADDADD+E注：(A)小鼠海马DG区突触超微结构图,左列图中标尺为2 m，右列图中标尺为1um;(B)突触数量；(C)PSD厚度；(D)突触间隙距离。与ADv组对比OP0.05;与ADv+组相比 P0.05。图6小鼠海马A1-42基因及蛋白表达ABAi-424kDa11.07-actin42kDatrigvedueooddiH0.81.00.61edueooddiH0.4+0.5+0.2+0.00.0ADvADv+EADDADD+EADvADv+EADDADD+E注：（A)小鼠海马A1-42mRNA表达情况；（B)小鼠海马A1-2蛋白表达情况。与ADv组对比P0.05;与ADv+组相比P0.05。894ChineseJournaloff Rehabilitation Medicine,Jul.2023,Vol.38,No.7图7小鼠海马A1-42表达荧