果胶酶在果汁生产中的作用”的实验设计和实施.docx

· “果胶酶在果汁生产中的作用”的实验设计和实施
Experimental Design and Practice of the Experiment : “The Application of the Pectinase in the Fruit Juice Production”
陆奇(Lu Qi)
（江苏省扬州市新华中学 225009）
摘要   “果胶酶在果汁生产中的作用”这一课题要求学生尝试利用酶活力测定的一般原理和方法探讨酶在食品制造方面的应用，本文提供的案例介绍了如何在普通高级中学实验室允许的条件下开展此定量实验，还对课题的实验步骤及设计、实验结果分析等具体问题进行讨论。
关键字： 果胶酶  酶的最适用量 最适温度 最适pH值
中国图书分类号：G633.91   文献标识码：C
1、简介
在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁混浊。果胶酶是分解果胶的一类酶的总称，它可以使榨取果汁更容易，得到的果汁更澄清。
“果胶酶在果汁生产中的作用”是人教版普通高中课程标准实验教科书《生物技术实践》（选修一）专题四“酶的研究与应用”中的课题一，课题要求学生能设计实验探究温度和pH对果胶酶活性的影响以及果胶酶的最适用量，此内容与学生的日常生活联系紧密，并且又有必修一“探究影响酶活性的条件”作基础，因此对于学生来说并不困难，适合进行实际动手操作。但是，课题比较偏重实验方案的设计，考虑的变量相对较多，还涉及到实验变量的梯度设计，要想获得理想的结果，必须进行反复多次的实验和摸索。学生在探究过程中，对教材和参考资料中的实验设计、方案进行了讨论和实际操作，提出了不同的问题和改进措施，笔者选取了一个较合理的案例，小结如下，仅供参考。
2、实验材料与实验方法
2.1 实验材料
本实验选用苹果作为实验材料，榨成汁后使用；实验中使用的果胶酶购自上海蓝季生物技术有限公司，配成质量分数为2%溶液后使用。
2.2 实验方法
2.2.1 实验总体设计

图1 本实验设计方案
2.2.2 制备果汁的方法
选取一个中等大小的苹果（约200g左右）洗净后，不去皮切成小块，放入榨汁机中，加入约200mL水，榨取2min，制得苹果泥。量取一定体积的苹果泥，不同条件下处理后，用滤纸进行过滤即可得到果汁。
2.2.3 果胶酶活性的检测指标
果胶酶能将果胶分解成小分子物质，小分子物质可以通过滤纸，苹果汁的体积大小反应了果胶酶催化分解果胶的能力。通过测定滤出的苹果汁的体积大小作为果胶酶活性的检测指标。
2.2.4 确定果胶酶的最适用量
取五支试管，编号后各加入10mL苹果泥，依次加入水、0.5mL、1mL、2mL、4mL2%的果胶酶溶液，加水使每支试管反应体系的终体积皆为14mL，室温下作用足够长时间，过滤15min，量取滤出的苹果汁的体积，确定果胶酶的最适用量。
2.2.5 确定果胶酶的作用时间
取六支试管，编号后各加入10mL苹果泥，一支加入1mL水作为空白对照，另五支各加入1mL2%的果胶酶溶液，加酶的五支试管依次在室温下处理1min、5min、10min、15min、20min。处理完用沸水浴使酶失活，过滤15min，量取滤出的苹果汁的体积，确定果胶酶的作用时间。
2.2.6 探究不同温度对果胶酶活性的影响
设定温度梯度：10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，取7支试管，编号后各加入10mL苹果泥，另取7支试管，编号后各加入1mL2%的果胶酶溶液，先将苹果泥和果胶酶溶液分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴保温10min，然后将相同温度处理的苹果泥和果胶酶溶液混匀后在相应的温度下再保温5min，处理完用沸水浴使酶失活，过滤15min，量取滤出的苹果汁的体积，确定不同温度对果胶酶活性的影响。
若实验室没有恒温水浴锅，可在水浴的大烧杯加入不同比例的冷水和热水，用温度计来控制水浴温度（不时添加适量热水维持温度），当室温大于10℃时，可用冰块或冰箱的冷藏室来控制10℃的水浴温度。
2.2.7 探究不同pH值对果胶酶活性的影响
设定pH值梯度：2、3、4、5、6、7、8、9，取8支试管，编号后各加入10mL苹果泥，另取8支试管，编号后各加入1mL2%的果胶酶溶液，用0.1moL/L的HCl溶液和质量分数为1%的NaOH溶液分别将苹果泥和果胶酶溶液pH值设置成：2、3、4、5、6、7、8、9等八种pH值梯度，用pH试纸或pH计确定pH值，然后将相同pH值的苹果泥和果胶酶溶液混合，得到八种不同pH值梯度的反应体系，用蒸馏水将八支试管中溶液的体积调成一致（本实验反应溶液总体积为16mL），室温下保温5min，处理完用沸水浴使酶失活，过滤15min，量取滤出的苹果汁的体积，确定不同pH值对果胶酶活性的影响。
3、实验结果
3.1 完全处理10mL苹果泥大约需要1mL的2%果胶酶溶液
设置2%果胶酶溶液体积梯度，分别催化相同体积的苹果泥（10mL），催化后过滤，得到的苹果汁的体积及澄清度如表Ⅰ所示。
表Ⅰ. 酶量对苹果汁滤出量的影响
试管编号
1
2
3
4
5
2%的果胶酶溶液
0
0.5mL
1mL
2mL
4mL
过滤后苹果汁的体积
5.4 mL
8.5 mL
9.3 mL
9.5 mL
9.5 mL
过滤后苹果汁的澄清度
混浊
澄清
澄清
澄清
澄清
由表Ⅰ和图2（A）可知，用不同量的果胶酶在室温下处理10mL苹果泥足够长时间，在1～4支试管中，随着果胶酶量的增加，所得苹果汁的体积随之增加，但当2%的果胶酶溶液达到1mL后，继续增加酶的量，所得苹果汁的体积几乎不再增加，说明底物已经耗尽，而处理10mL苹果泥的果胶酶溶液最适用量应为1mL左右。
3.2 室温下，1mL2%的果胶酶溶液完全处理10mL苹果泥只需要5～10min
取1mL2%的果胶酶溶液催化相同体积的苹果泥（10mL），分别作用不同的时间，得到的苹果汁的体积及澄清度如下表所示。
表Ⅱ. 酶的作用时间对苹果汁滤出量的影响
试管编号
1
2
3
4
5
6
果胶酶作用时间
0
1min
5min
10min
15min
20min
过滤后苹果汁的体积
4.5mL
5.9 mL
7.8 mL
8.0 mL
8.0 mL
8.1 mL
过滤后苹果汁的澄清度
混浊
澄清
澄清

澄清
澄清
澄清
由表Ⅱ和图2（B）可知，在1～4支试管中，随着果胶酶作用时间的增加，所得苹果汁的体积随之增加，但当酶作用时间增加到10min后，继续增加酶的作用时间，所得苹果汁的体积几乎不再增加，说明底物已经耗尽，而当酶作用时间为5min（试管3）时，苹果汁的体积几乎到达到最大值，所以1mL2%的果胶酶溶液完全处理10mL苹果泥大概需要5～10min。
3.3   果胶酶最适作用温度在30℃左右
取1mL2%的果胶酶溶液催化相同体积的苹果泥（10mL），在不同梯度的温度下反应，得到的苹果汁的体积及澄清度如下表Ⅲ所示。
表Ⅲ  温度对酶活性的影响
试管编号
1
2
3
4
5
6
7
果胶酶的作用温度
10℃
20℃
30℃
40℃
50℃
60℃
70℃
过滤后苹果汁的体积/mL
6.8
7.5
8.0
7.0
5.5
4.8
4.8
过滤后苹果汁的澄清度
澄清
澄清
澄清
澄清
半混浊
混浊
混浊
由表Ⅲ和图2（C）可知，在1～3试管中，随着果胶酶作用温度间的升高，苹果汁的体积随之增加，说明在10℃～30℃温度区间内，酶的活性随着温度的增加而升高，当酶作用温度增加到30℃时，苹果汁的体积达到最大值，说明此时果胶酶的活性最强。在3～6试管中如果继续升高温度，苹果汁的体积随之减少，说明在30℃～60℃温度区间内酶的活性随温度的升高而降低。当温度达到60℃，继续升高温度，苹果汁的滤出量不再改变，说明此时酶已经完全失活。
3.4   果胶酶作用pH值较广泛，最适pH值约在3～5之间
取1mL2%的果胶酶溶液催化相同体积的苹果泥（10mL），在不同梯度的pH值下反应，得到的苹果汁的体积及澄清度如表Ⅳ所示。
表Ⅳ  pH值对酶活性的影响
试管编号
1
2
3
4
5
6
7
8
果胶酶的作用pH值
2
3
4
5
6
7
8
9
苹果汁的体积/mL
10
10.5
10.5
10.5
8
5.8
5.7
5.8
苹果汁的澄清度
澄清
澄清
澄清
澄清
半混浊
混浊
混浊
混浊
由表Ⅳ和图2（D）可知，在1～4试管中，滤出的苹果汁的体积都较大，说明在pH值在2～5时果胶酶都有较大活性，果胶酶适宜的pH值范围较广泛。其中2～4试管中滤得的苹果汁的体积最大，说明果胶酶的最适pH值约在3～5之间。在4～6试管中，随着pH值的增加，苹果汁的体积随之减少，说明pH值在5～7时，酶的活性随着pH值的增大而升高，pH值达到7时，继续升高pH值，苹果汁的滤出量不再改变，说明此时酶已经失活。
4、讨论
4.1 实验设计上的顺序问题
在人教版教材和参考书上，顺序上都是先探究果胶酶的最适温度和最适pH值，再进一步研究果胶酶的最适用量，而本案例顺序有所调整，原因是学生在探究果胶酶的最适温度和最适pH值时，考虑到实验中应使用多少酶量，酶作用多长时间等问题，因此学生提出应该先摸索出酶的用量和作用时间，然后探究果胶酶的最适温度和最适pH值，故此，本案例设计了图1所示的实验设计方案。
4.2 中学实验室条件下本实验的实施
在正常状况下，本课题的实验操作需要恒温水浴锅、pH计、分光光度计等仪器，但是如果中学实验室缺乏这些仪器，如何用现有的实验室资源来克服仪器的缺乏也是锻炼学生创造性和动手能力的一个课题，可以使用大烧杯中加入不同比例的冷水和热水，通过温度计来控制温度，用此装置替代恒温水浴锅；用pH试纸多次测试的方法替代pH计通过这样的锻炼，虽然实验结果可能不会很精确，但却可以提高学生解决问题的能力。
4.3 本实验中容易忽略的无关变量及其控制
本实验的实验步骤较多，由多个小实验构成，每个小实验需要考虑的变量都不一样，比较容易忽略的无关变量有如下几个：（1）苹果泥的批次及粘稠度；本实验的大部分步骤及实验数据有逻辑上的关联，因此所有的实验都应该使用同一批次的苹果泥，同时果胶泥是粘稠物，进行每组实验时，都应该充分搅拌，减小实验误差。（2）同组对照实验反应体积的一致性；加入不同酶量或调节pH值梯度时都会影响反应体系的体积，而不同体积的反应体系会影响苹果汁的滤出量，为控制无关变量，应用蒸馏水将每组对照实验的总体积调至相同。（3）酶的作用时间；注意酶作用完要失活，否则过滤时，苹果泥中酶还在起作用，不能精确设定酶的作用时间。（4）过滤的时间。过滤时间不同也会影响苹果汁的滤出量，同组对照实验中酶作用完后，应保证过滤时间相同。
4.4 实验结果分析
通过探究果胶酶的最适温度和最适pH值实验，我们发现该果胶酶的最适温度和最适pH值都较广泛，究其原因，果胶酶不是单一的一种酶，它是分解果胶的一类酶的总称，包括半乳糖醛酸酶、果胶分解酶、果胶酯酶等，因此果胶酶的最适温度和最适pH值是多种酶综合的适宜温度和适宜pH值。具体地说，温度在10℃～40℃时其活性都较强（表Ⅲ和图2（C）），在实际生产中，这样的特性可以使果胶酶适应几乎所有的季节。果胶酶的最适pH值约在3～5之间，大多数的水果榨汁液都偏酸性，如苹果泥pH值在4左右，恰好在其最适pH值范围内，果胶酶因有这样宽泛的作用条件，用于实际生产时，可以大大节约生产成本。