GenerationofNaive-LikePorcine-Induced翻译.doc

原始态像猪诱导产生的多能干细胞能够促进胚胎和胎儿发育

多能干细胞（PSCs），有2种类型： naive and primed 原始态多能性(naive pluripotency)和始发态多能性(primed pluripotency),只有原始态有能力产生嵌合后代，鼠的PSC是原始态，人的是始发态，先前有报道说猪PSC出现在始发态，本研究中，假定原始态猪iPS细胞能产生
猪胚胎成纤维细胞用山中弥伸的4因子转导用逆转录病毒载体表达山中的4个基因。 克隆繁殖在猪白血病抑制因子(pLIF)和forskolin.存在下。细胞表达多能性标记并且形成胚胎体，胚胎体从所有3个胚层生成细胞型，细胞的原始态被由pLIF依赖要求，活跃的2个X染色体（雌性），缺少MHC 类 I表达，特征基因表达配置。猪iPS细胞的体外胚胎发育（11/24，45.8％），评估由荧光标记物。他们也推动了在子宫内胎儿的发育（11/71，23日的15.5％，1/13，7.7％在第65天）。这是第一个宏观示范来自原始态像猪的PSC的荧光嵌合体，虽然成年嵌合体仍然需要等待产生。

简介.
PSC的两种细胞类型：原始态和始发态（图1）,Ontogenetically, 原始态PSC对应着床前囊胚的内细胞团（ICM）细胞，始发态PSCs对应外胚层的着床后。只有原始态的PSCs能发育成嵌合体当注入到异体胚胎中。另外，原始态的PSCs有结构紧凑的特征，圆形的克隆，依赖于白血病抑制因子（LIF），活跃的x染色体(XaXa)，和没有或者非常低水平的MHC类I抗原表达。在这种背景下，鼠的PSCs，两者 (ESCs)和 鼠的(iPSCs)都是在原始状态。

相反，始发态的PSCs有非常有限的能力对于生成嵌合体后代。他们来自于平板克隆。他们有一个增殖反应对于基本成纤维增长因子(bFGF)和激活代替LIF，并且有一个灭活的X染色体(XaXi)。他们是阳性的对于MHC类I抗的表达。人PSCs, both ESCs 和iPSCs，有共同的特征伴随着鼠epistem上皮干细胞来自外胚层的着床前，并且他们出现在始发态。先前的报到PSCs either ESCs or iPSCs，来自于其他动物的如猴子，猪，兔子也出现在始发态，因为这些动物PSCs通常有非常有限的能力对于产生嵌合体的后代。然而，已经有报道说非原始态或者甚至非多潜能细胞也能有助于胚胎和成体的发育在猪中。

在鼠和非许可的鼠中，原始态的PSCs能被产生通过LIF和2信号转导抑制剂（2i，丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶抑制剂PD0325901和糖原合成酶激酶的3b抑制剂CHIR99021）最近的研究也显示出人PSCs (ESCs and iPSCs)在始发态能被转换为原始态通过和2i,LIF,和腺苷酸环化酶激活剂。外源的Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, and Nanog基因的持续表达也能诱导人PSCs类似原始态。因为是不可能的去检测人PSCs发育成嵌合体的能力，在其他动物的模型中检测是被需要的。这里，假定的原始态的猪iPSCs,的分离已经被展示出来，假定的原始态的猪iPSCs和鼠原始态的PSCs,有非常相似的特征。此外，他们有能力提供胚胎发育。

材料和方法
猪
humanized Kusabira-orange（huKO）转基因猪（Porco Rosso）饲养在明治大学（神奈川县，日本）[28]。近交系Clawn小型猪（Porco Clawn）购自日本农场（日本鹿儿岛市）。杂交（大型白/长白猪，杜洛克）青春期母猪作为异基因胚胎的代孕妈妈猪。所有的研究都涉及猪和老鼠被批准了由动物护理和使用委员会在Jichi医疗大学和明治大学。
猪LIF
从猪胚胎成纤维细胞（PEFs）分离总RNA，并通过使用SuperScript III逆转录酶（Invitrogen，Rockville，MD）和oligo（dT）引物（Takara Bio, Shiga, Japan），以产生cDNA。聚合酶链反应（PCR），然后，进行扩增猪LIF（PLIF）cDNA使用的Ex Taq酶试剂盒（Takara Bio公司）和特异性引物；引物（5¢-GCC CTCTGG AGT TCA GCC CAT AAT G-3¢) and 反向引物(5¢-GGT GCT AGG GGA CCT TCC ATC TAG-3¢)）被设计基于pLIF cDNA序列(GenBank accession no. AY585336.1)。扩增的cDNA片段(609 bp)被插入到TA克隆载体。用EcoRI and SacI (Takara Bio)消化后，cDNA被插入到鸡β-肌动蛋白基础的启动子（CAG）的下游，在pPyCAG创建PLIF表达载体。此载体转染293FT细胞通过使用脂质体Lipofectamine2000（Invitrogen公司）和条件培养基是收集，过滤，并贮存于 - 70℃直至使用。 “使用条件培养基1:200对应于5000U/mL LIF (Supplementary Fig. S1; Supplementary Data are available online at 猪LIF与人类和鼠LIF氨基酸序列同源性大约分别88% and 79%。猪LIF与人类和小鼠LIF的cDNA同源性分别为约88％和80％，(www.ebi.ac.uk/tools/clustalw2/)。
猪iPSCs
山中的四个因子表达的逆转录病毒结构提供由S.山中。逆转录病毒的产生如前所述 。PEFs伴随逆转录病毒被转导和培养在灵长类动物ESC培养基（ReproCELL，Kanagawa，日本），添加人碱性成纤维细胞生长因子bFGF (4 ng/mL) (Wako, Osaka, Japan)，小鼠ESC培养基里含有鼠LIF（1000U/mL）(ESGRO, Chemicon, Temecula, CA), or PiPSM。 PiPSM是敲除Dulbecco’s的改良的Eagle’s培养基（DMEM）（Invitrogen）中包含15％牛胎儿血清（FBS）（Invitrogen公司），1％glutamax-L（Invitrogen公司），0.1mM的2 - 巯基乙醇（Invitrogen公司），1％的非必需氨基酸（NEAAs）（Invitrogen公司），50U/mL青霉素（Invitrogen公司），50毫克/毫升链霉素（Invitrogen）中，10mM forskolin（Biomol (Biomol, Farmingdale, NY), 和 pLIF (1:200所含培养基)。对于血清无饲养繁殖的猪iPS细胞培养在Ⅰ型胶原涂层板(Iwaki，东京，日本）被培养在无血清培养基（SFM）;基因敲除的DMEM的含20％敲除血清替代品（Invitrogen公司），1％的glutamax-L，0.1mM的2 - 巯基乙醇，1％NEAAs，50U /mL青霉素，50毫克/毫升链霉素，10mM的forskolin，和0.5％PLIF上清。
为了建立iPS细胞稳定表达增加绿色荧光蛋白（EGFP）(Porco Clawn Verde iPSCs)，Porco Clawn iPSCs被转染用质粒表达EGFP（pPyCAG-EGFP-IP）通过使用Lipofectamine 200试剂（Invitrogen）并进行选择用嘌呤霉素puromycin(2 mg/mL) (Sigma, St. Louis, MO)。抗性克隆被分离和培养在PiPSM。为了发育到胚体，iPSCs克隆被分离用胰蛋白酶和分散在未涂覆烧瓶PiPSM中。经过7天的培养，聚集的细胞放置在明胶包被的组织培养皿中DMEM含有10％FBS和在进行7天培养。
Porcine embryos and fetuses
猪胚胎和胎儿
详细的程序被描述在补充程序。简单地说，孤雌激活和体外受精猪桑椹胚被准备好。iPS细胞的小团块（10至20个细胞）被注入桑椹胚中。 “桑椹胚在体外培养到囊胚阶段，并被检测由检测荧光。孵化的囊胚被转移到青春期母猪的子宫。怀孕母猪被杀死和胎儿被分离。分离的胎儿在荧光显微镜下观察。
Sodium bisulfite genomic sequencing
亚硫酸氢钠基因组测序
纯化基因组DNA，使用DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)和消化用HindIII（Takara Bio）。消化基因组DNA的纯化使用QIAquick凝胶提取试剂盒Qiagen），和亚硫酸氢盐进行反应，直接使用EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Research, Irvine, CA)。亚硫酸氢盐处理的DNA被扩增使用BioTaq HS DNA聚合酶(Bioline, London, United Kingdom)和Oct3 / 4的引物（Oct3/4-Bis-F，5¢-GGG GGT TTA GTA AAA TTA GGG TTT T-3¢; Oct3/4-Bis-R，CAC AAA5¢-AAA ACT TAA CAC CAA ACC T-3¢）。引物序列被设计基于对猪基因组组装的版本Sscrofa9.2（2009年11月建立）从UCSC基因组数据库。 PCR反应在下列条件下进行：95℃加热10min，40个循环，95℃30秒，30秒60℃和72℃1分钟，随后在72℃2分钟的最后延伸步骤。 扩增的PCR产物克隆到pGEM T- Easy载体(Promega, Madison, WI)，和10至16个克隆被测序，以确定的DNA的甲基化状态。
Statistical analysis
数据分析
Data are expressed as means – SD. The significance was
tested by the Student’s t-test.
数据被表示为装置 - 的SD。的意义
通过Student的t-检验测试。
Results
Novel porcine iPSCs
新的猪iPS细胞
LIF是不可缺少的对于原始态naive PSCs，虽然是可有可无的对于primed PSCs。然而，鼠LIF未能产生naive-like猪iPSCs。另外，人LIF对于猪细胞的影响较弱。因为这将是更好的使用猪LIF（PLIF）产生naive猪iPS iPSCs，重组PLIF被生产（补充图。S1）。

猪iPSCs被产生从Porco Rosso的PEFs，转基因猪表达huKO荧光基因，伴随着逆转录病毒载体表达4种重编程基因(human Oct3/4, Sox2, Klf4, and c-Myc)。用pLIF 和 forskolin培养两周后，紧凑型，圆顶形克隆，和鼠的ESC克隆相似，以0.02%的效率出现。他们中的3个被选出和传代为了进一步分析。细胞被平稳的传代超过40代。在这个研究中，2i是可有可无的对于维持这些细胞。他们表达huKO荧光（图2A）。细胞阳性对于碱性磷酸酶AP激活。他们有一个正常的核型（补充图。S2A）。细胞分化成所有3胚层细胞在体外在胚体中作为评估通过免疫细胞化学法（补充图。S2B）假定naive猪iPSCs，然而，在免疫缺陷（NOD/ SCID）小鼠只发育成未成熟畸胎瘤。它不是猪特有的，但它也有这种情况伴随着naive-like human iPSCs（未发表的数据）。其他研究者也声称naive-like human iPSCs发育成熟畸胎瘤是很困难的。

红猪Porco RossoiPSCs表达与多能性相关的基因，包括内源性OCT3 /4，Nanog，ERas，SOX2，LIN28，和Stella，作为评估通过免疫细胞化学法或反转录PCR（RT-PCR）（补充图S3）。然而，四个转基因仍然通过RT-PCR检测（补充图。S3A）。的转基因和内源基因的表达水平进行了比较，通过定量RT-PCR，但任何一致的，令人信服的结果不能得到。转基因是人类，但内源基因的猪。用于RT-PCR的引物是设计的来区分的人和猪的同源基因，并且他们是不同的，（补充表S1S2）。在不同的引物这样的条件下，2个外源性人与内源性猪同源基因不能定量相比较。另一方面，如果相同引物对被使用，两个就没有任何区别。因此，唯一可能得出结论它们均在猪iPSCs中表达，转基因在更高的水平表达在猪的iPSCs比人类iPSCs，山中已产生的human iPSCs。

iPSCs表达SSEA-1，-3和-4（1=3>4）。 RT-PCR 表明内源性Klf4和c-Myc基因的表达只是略有增强，这是与Okita等人的发现一致。E-钙粘蛋白E-Cadherin在小鼠ESCs中大量表达，也在高水平表达。另一方面，N-cadherin 几乎不表达，指出在小鼠ESCs。细胞表达的Tra-1-60和 - 81，虽然在低的水平（数据未示出）。定量RT-PCR结果显示，这些iPS细胞表达的内源性Oct3/ 4，Nanog，Sox2基因以高浓度（补充图。S4）。

Evidence of the naive-like state
naive-like状态的证据
接着，novel Porco Rosso iPSCs进行检查，以确定它们是否是naive状态。 LIF-依赖是一个标志性的naive状态。猪iPSCs依赖PLIF的依赖性清晰地显示出，通过培养细胞在PLIF缺席情况下，也就是说，细胞停止生长。另外，对于PLIF的反应，STAT3是酪氨酸磷酸化的，并转移到细胞核（补充图。S1C），和PLIF受体的表达是上调在细胞中（补充图。S3A）。值得一提的是，与bFGF培养的细胞在没有PLIF和forskolin的情况下，允许它们转换为epistem上皮干细胞样细胞（图2B）。

没有或低水平的MHC I类表达是另一个naive状态标志。猪iPS细胞为阴性对于MHC I类分子评估的由RT-PCR，免疫细胞化学和流式细胞术（图2C-E），这意味着细胞 是naive状态。另一方面，epistem类似的上皮干细胞状常规的猪iPSCs转向阳性对于MHC class I（图2C）。

雌性iPSCs， X染色体（XaXa）的激活应该是一个naive状态的标志性。激活的X染色体与Xist基因抑郁症下降有关。据RT-PCR分析，Xist mRNA 在猪iPSCs中几乎不表达，虽然它在epistem类-上皮干细胞的猪iPSCs中表达，当然，在雌性PEFs（图3A）。此外，组蛋白H3K27三甲基化斑点与失活X染色体的相关性被观察在primed iPSCs中，但不在naive-like iPSCs（图3B）。

naive and primed PSCs基因的表达谱是不同的。值得注意的是，KLF家族（KLF2，4，和5）和Stella基因的表达在高的水平在naive PSCs，但在primed PSCs表达式低水平的。相反，FGF5基因的表达是高的水平在primed PSCs，但在低水平在naive PSCs。这些基因的表达谱在猪iPSCs与那些naive-type细胞是兼容的相容的（图3C）。ESC-expressed Ras (ERas)， Ras在小鼠ESCs/iPSCs表达但不在human ESCs中表达，ESC-expressed Ras (ERas)也表达在猪iPSCs（图3C）。总结在一起，猪iPS细胞的基因表达图谱更相似于那些naive PSCs比那些primed PSCs。

因此，红猪Porco Rosso iPSCs的是在假定的naive状态。Naive-like猪iPS细胞可以很容易地传代与胰蛋白酶，不像人PSCs，不再需要Rho激酶（ROCK）抑制剂进行传代或亚克隆。2倍增时间naive-like porcine iPSCs平板plating效率与鼠PSCs（补充表S3）相近。Naive-like porcine iPSCs可以生存效率很高（50％以上），冷冻和解冻后。 细胞可以培养在无血清和饲养层上在Ⅰ型胶原涂层的盘（补充图。S3Bd）。Porcine iPSCs从的的自交系Clawn微型猪的PEFs（Porco clawn）也被产生。Porco Clawn iPSCs显示与Porco Rosso iPSCs的那些非常相似的特性（补充图S1和S2）。

Chimera formation
嵌合体的形成
Porco Clawn iPSCs表达EGFP（Porco Clawn Verde iPSCs）被注射到猪孤雌桑椹胚 检测他们是否被纳入猪胚胎的正常发育（图4A）。注射1至2天后，iPSCs的成功地纳入到ICM被观察到。一些囊胚孵化，表明其发育（图4BA）。得到相似的结果，当Porco Rosso iPSCs（huKO荧光基因表达）被注射（图4BB）。值得一提的是，荧光供体细胞（尤其是Porco Rosso iPSCs）中也检测到在滋养外胚层（TE）（图4C）。编入到TE也经常观察到（80％），猪ICM细胞注入异体桑椹胚后（图4D）。虽然ESCs or iPSCs加入到TE一直没有被观察到在小鼠，观察是一致的与一份报告，显示，快速TE分化发生在小鼠相比牛。猪iPSCs在体外发育总结于表1。

Porco Clawn Verde 在体内的命运 和 在孤雌胚Porco Rosso iPSCs进行追踪在转移胚胎到代孕妈妈子宫后。胎儿恢复在妊娠23天（足月妊娠，114天）和荧光（huKO or EGFP）被检测到在71个胎儿中的11个（图5A和补充图。S5A高分辨率）。猪iPSCs最终分化成各种组织。在胎儿在图。 5A，相对强荧光被观察到在头，臂弓，心房，心室，肝，和胚胎肢芽（用箭头表示）。

因为孤雌胚胎不能进一步发育，在体外受精的桑椹胚，然后被使用作为东道主胚胎进行长期的观察。桑椹胚注入与iPSCs一起被转移到代孕妈妈子宫，胎儿在65天的妊娠时恢复。荧光观察了从13例胎儿中1个（图5B和补充图。 S5B高分辨率）。在胎儿，荧光被观察到在外胚层皮肤头部，颈部和蹄周围（箭头在图5B）。荧光蛋白的表达(huKO)被确认由免疫组织化学法（图5B）。荧光中未被检测到在胎儿的其他部分。

猪的iPSCs中的在子宫内发育的贡献被总结于表2中。荧光阳性嵌合体和荧光区域频率减少在妊娠天。任何注入iPSCs的贡献对于生殖细胞没有被观察到在65天妊娠。在我们的实验室，iPSC的类iPSC-like候选细胞被库存，一直被宣扬的建立猪的iPS细胞的过程，但最终还是没能满足一些iPSCs的标准，也就是说，它们不iPSCs。当这些细胞被转移到4或8细胞期，他们不能编入成囊胚（0/13），因此不能有助于胚胎发育。

The reprogramming status
重新编程状态
Oct3 / 4启动子的甲基化状态在猪iPS细胞被检测通过亚硫酸氢钠测序法。在2 lines检测（Porco Rosso 4和图6），甲基化状态是异质的，只有一部分的克隆是完全的去甲基化的，即，重新编程（图6）。这可能是产生嵌合体的一个效率低的原因。总是有的一个huKO-negative部分（4％-5％）在Porco Rosso iPSCs（图7A）。考虑到huKO基因由逆转录病毒长末端重复序列驱动，它可能是这种情况huKO基因的沉默与逆转录病毒转基因沉默相关，即
完全重新编程的状态。的huKO阳性和阴性细胞被排序，和基因的表达谱进行了检测（图7B）。值得注意的是，huKO阴性细胞表达多能性相关的内源性基因以高水平（图7C），但很少little表达转基因（图7D）。转基因沉默iPSCs富集在huKO阴性部分。这是可能的，完全重编程的猪iPSCs富集在部分。

Discussion
讨论
推定naïve猪 iPSCs生成的使用PLIF和forskolin。pLIF and forskolin是必不可少的对于建立和维持推定naïve猪 iPSCs。事实上，naïve特征丢失没有他们时（图2B）。另一方面，2i的是可有可无的对于维持的假定naive state状态在培养中。这是可能的，转基因的持续表达将有助于保持假定naive状态没有2I。在假定的naive猪iPS细胞表现出有助于正常胚胎和胎儿的发育的能力，（图4和图5）。然而，考虑到猪的non-naive，甚至非多能性的细胞，如神经干细胞可以促进胚胎和胎儿的发育，发育嵌合体能力可能不是很好的标准对于naivety in pigs。在小鼠的情况下常常确实是这样。据报道，小鼠神经干细胞有助于嵌合体鼠胚胎的形成，并在所有生殖胚层产生细胞，但它目前被认为是不可能的。据推测，他们看到了细胞融合[48]。在另一方面，在体外特性已经被显示出 在这项研究中包括LIF-依赖性生长“，阴性MHC I类，活性X染色体，和不同的基因的表达谱（图2和图3）可能会明确标准对于naivety。本论文第一时间显示猪iPSCs，满足所有在体外的标准，因此这种猪的iPS细胞可以被称为naive。要显示这些细胞是真正的naive，这些细胞的生殖能力应该得到证实。

然而，Nanog基因的表达水平中primed PSCs，实际上是较高的比假定的putative naive（图S4）。关于猪Nanog基因，有一个令人困惑的的情况。首先，在猪，Nanog基因几乎不表达在ICM，但在较高水平在外胚层。其次，Nanog启动子显着脱甲基化即使在猪肝脏中（未发表的数据）。这也是一个原因，即为什么甲基化状态的数据提出
仅在Oct3 /4启动子，而不是在Nanog的启动子在图。 6。第三，所谓的Nanog基因是位于染色体NO。 1猪，但它无内含子和lies between LINE sequences（http://genome.ucsc.edu/）的。在另一方面，还有另一种假定Nanog的区域上在染色体no. 5，猪，但围绕它的基因组序列（约2百万个碱基）目前不知道。因此，它是目前还不清楚是否目前的猪Nanog基因在染色体no. 1上是真正的猪对应的Nanog，相关基因，或只是一个假的。考虑到这些问题，它是
难以解释的数据表达水平较高的Nanog在primed猪PSCs比假定的naive ones。

重要的是要确定对于naivety of PSCs替代标记。虽然鼠标PSCs和naive-like porcine iPSCs表达阶段特异性胚胎抗原（SSEA-1），常规primed porcine iPSCs or human PSCs不表达它。在小鼠和猪，SSEA-1是个体发育表达在ICM，然而，在人类中，它不表达在ICM，除了在桑椹胚和滋养细胞，因此，SSEA-1是一个候选标记对于naivety，至少在老鼠和猪中，但它仍然需要进一步阐明是否在人类也有这样的情况。ERas是另一位候选，因为它是表达在naive，但不是在primed PSCs。在这种情况下，这将是有趣的，检查是否Eras也表达在人PSCs，人的PSCs已经转向naive-like随着被Hanna et al描述。

猪iPS细胞到嵌合体的整合是低的，特别是在妊娠65天。这是可能的，这是因为它们是不完全重新编程，可能与细胞中转基因的持续表达相关的。持续表达会减慢iPSCs体内分化和发育当它们被注入胚胎。 使用Tet-on/off慢病毒载体和温度敏感的仙台病毒载体对于转基表达因的条件正在探索之中。

将Oct3 /4基因启动子区的甲基化状态，也可以解释低纳入猪iPSCs到嵌合体（图6）。在该图中，它表明该区域还没有完全脱甲基化。虽然甲基化状态不是一个标准，以评估是否细胞是naive or primed，他是一个标准it is rather a criterion，以评估他们是否完全重新编程。在这方面，它是可以说，猪iPSCs的是putative naive,，虽然他们是只有部分去甲基化。因此，这是必要的，这些启动子区去甲基化，去实现全面的重新编程。在小鼠PSCs，能够产生成嵌合体的鼠PSCs，这些区域是去甲基化的。猪iPS细胞是如何转换为完全重新编程的状态，以至于他们能够有效地发展成成年嵌合体（chimera）？一种方法是Porco Rosso iPSCs的huKO-negative部分的富集，作为建议从实验图7。然而，这种方法是不适用于其他猪IPSCs lines。其他的方法是需要的，例如，附加猪的iPSCs的转导用Oct3 / 4或Klf4基因，它可脱甲基化Oct3 / 4基因的启动子区域，如图由Buecker等和Telugu等。

总之，putative naive porcine iPSCs产生用猪LIF和forskolin。putative naïve 猪 iPSCs共同特征和鼠iPSCs，但不与人类iPSCs。putative naive 猪iPSCs可以促进到猪胚胎和胎儿发育。他们也编入TE以及ICM。这是第一个宏观的示范，荧光嵌合体来自naive-like 猪 PSCs。生产成嵌合体的是在下一个步骤有待于实现。
Acknowledgments
We thank Shin-ichi Nishikawa (RIKEN CDB), Kazutoshi Takahashi, Keisuke Okita (Kyoto University), Masahito Sato (Kagoshima University), Jun Ohgane, and Masaki Nagaya (Meiji University) for helpful discussion. We acknowledge Jun-ichi Tottori ( Japan Farm), Kasumi Honda (Meiji University), and Hiroshi Kadoi (Kadoi Ltd.) for technical help. This study was in part supported by Yamanaka iPSC special project of JST.
致谢
我们感谢新一西川（RIKEN CDB），高桥俊，冲田圭介（京都大学），佐藤正人（鹿儿岛大学），Ohgane军和正树长屋（明治大学）的有益讨论。我们承认军第一鸟取（日本农场），霞本田（明治大学），和：：宏Kadoi（Kadoi有限公司）的技术的帮助。这项研究是支持部分由山中的IPSC的特殊项目，JST。
Author Disclosure Statement
S.Y. is a member without salary of the scientific advisory boards of iPierian, iPS Academia Japan, Megakaryon Corporation, and Retina Institute Japan.
作者披露声明
S.Y.是无薪的iPierian，日本的iPS学术，Megakaryon公司，和视网膜研究所，日本的科学顾问委员会的成员。

FIG. 1.
Naive and primed多能性干细胞。在小鼠中，ESCs是来自囊胚的内细胞团（ICM）的着床前，并且能够产生嵌合体伴随着生殖系的传递(naive state)。上皮干细胞是来自于外胚层着床后。上皮干细胞也是多能的，但他们没有反应对白血病抑制因子leukemia inhibitory factor（LIF），或有助于到嵌合后代（primed state）。在人类中，虽然ESCs都来源于囊胚着床前，它们是和上皮干细胞类似的在特性上。关于诱导性多能干
细胞（iPSCs），鼠标是naive，但人类和其他动物是primed。然而，在猪，non-naive，或者甚至
非多能性细胞也能促进胎儿和成年的发育由于某种原因。

FIG. 2.
Putative naive porcine iPSCs是LIF-依赖性的并且MHC类I-阴性（A）。Porco Rosso红猪iPSCs的形成紧凑，圆形菌落，并表达人源化Kusabira -orange（huKO）荧光蛋白（a）。细胞是阳性的碱性磷酸酶（ALPase）活动（b）。比例尺= 25毫米。（B）iPS细胞停止生长跟随着猪白血病抑制因子（PLIF）和forskolin撤出。细胞转换为上皮干细胞样细胞epistem-like跟随着撤出PLIF和forskolin并且碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的增加。比例尺= 200毫米。 （C）MHC class I的表达评估采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。巷 1猪胚胎成纤维细胞（PEF）2，putative naïve porcine iPSCs; 3, primed porcine iPSCs;4，丝裂霉素C（MMC）处理过的STO饲养层细胞（小鼠胚胎成纤维细胞系）;图5，缓冲液buffer单独使用用于RT-PCR。 （D）流式细胞仪分析猪MHCⅠ类抗原。Porco Clawn iPSCs是阴性的作为抗原，虽然PEFs呈阳性。 （E）免疫细胞化学染色用anti-porcine MHC class I。Porco Clawn iPSCs and PEFs被培养用anti-MHC class I antibody并用Hoechst 33342复染。 iPS细胞没有染色用抗-MHC I类，但PEFs被强烈的染色用它。比例尺= 200毫米。

FIG. 3.
Putative naive porcine iPSCs有XaXa和基因表达的独特的配置。 （A）Xist基因的表达进行评估RT-PCR。巷1号，雌PEFs；2，雄PEFs；3，naive-like female porcine iPSCs;4，primed female porcine iPSCs;5，MMC-处理的STO饲养细胞；图6，缓冲单独使用用于RT-PCR。 （B）组蛋白H3K27三甲基化点被观察在primed porcine iPSCs，但不在naive-like iPSCs。比例尺=100毫米。 （C）Klf-family, Stella, Eras，FGF5基因的表达作为评估通过定量RT-PCR。数据表示的意思 - SD，* P <0.01，+P <0.05（n = 3 对于Porco Rosso-4，Rosso-6，n = 2对于epistem-like porcine iPSCs B9-2-5）。

FIG. 4.
猪iPS细胞注射到桑椹胚和他们的体外发育。 （A）猪iPS细胞分别注入猪孤雌桑椹胚。 （B）猪的iPSCs纳入孵化囊胚的ICM (a,Porco Clawn Verde and b, Porco Rosso）注射后在1或2天。 （C）猪iPSCs也被纳入到滋养层（TE，三角）以及到ICM（箭头）。 （D）纳入到TE后也被观察到在猪ICM细胞染色后用DiI被注射到猪孤雌桑葚胚。比例尺=50毫米。

iPSCs, induced pluripotent stem cells; huKO, humanized Kusabira-orange; EGFP, enhanced green fluorescence protein; ICM, inner cell mass; TE, trophectoderm.
iPS细胞，诱导多能干细胞，huKO，humanized Kusabira-orange，EGFP绿色荧光蛋白，enhanced绿色荧光蛋白; ICM，内细胞层； TE，滋养层。

FIG. 5.
在猪的iPS细胞在子宫内的发育。 （A）嵌合体胚胎在妊娠23天来自于Porco Clawn Verde (EGFP-positive) and Porco Rosso (humanaized Kusabira-orange-positive) iPSCs在亮的区域（a，c），并在暗视野（b，d）。荧光-阴性胎儿在23日也呈现，作为阴性对照(for EGFP, e, f; and for humanized Kusabira-orange, g, h)。 （B）嵌合体胚胎在妊娠65天来自Porco Rosso iPSCs.。在胎儿2，IPSC衍生iPSC-derived荧光被观察到在有限的区域（箭头）。没有检测到荧光在胎儿7（阴性对照）。荧光颗粒在 d组（箭头）在管内的是红Porco Rosso iPSCs。从一个样品的荧光组织的胎儿样品从胎儿2的是阳性的对于humanized Kusabira-orange (huKO)荧光蛋白的表达的，作为评估通过免疫化学法immunohistocemistry与anti-huKO antibody (e)，但是胎儿7的样品为阴性（阴性对照，f）。

FIG. 6.
内源性Oct3 / 4启动子区在猪iPS细胞的DNA甲基化状态。甲基化单独的序列克隆的Oct3 / 4的上游区域的甲基化模式被检测在猪的iPS细胞(Porco Rosso-4, -6, and epistem-like B9-2–5)，在体外受-派生囊胚，和PEFs通过使用亚硫酸氢盐的测序方法。开放和封闭的圆圈表示非甲基化和甲基化状态。 甲基-CpG岛的数目在所有CpG岛和整体甲基化的CpG岛的百分比被展示在右侧。

FIG. 7.
huKO-荧光基因的沉默意味着完全重新编程状态。有一个huKO-阴性区域在Porco Rosso-4 iPSCs箭头（A）所示。huKO-阳性（R1）和-阴性（R 2）细胞被排序，基因的表达概况进行了检查（B）。huKO-阴性细胞表现出较高水平的表达对于多能性相关的基因（C），但非常低的表达水平对于转基因（D）。

LIF:抑制分化
BFGF：促进成纤维细胞生长的物质
三个胚层的marker都有哪些？哪些抗体比较好用啊？外胚层，nestin；原始内胚层，Gata4，Sox17；内胚层，AFP；中胚层，Flk1。
细胞表达的Tra-1-60和 Tra-1- 81，虽然在低的水平（数据未示出）。
STAT3：STAT3活性明显升高；JAK激酶抑制剂AG490处理后导致细胞凋亡，STAT3活性降低，伴有凋亡抑制基因Mcl 1表达下降。Takemoto等【１０】在12名T细胞白血病患者的PBMC中也发现有STAT3的活化，且持续时间最长为6个月。上述结果都提示了STAT3的活化与白血病细胞的复制与增殖有关。
ESC-expressed Ras (ERas)， Ras在小鼠ESCs/iPSCs表达但不在human ESCs中表达，ESC-expressed Ras (ERas)也表达在猪iPSCs
doubling time: 倍增时间