酶失活动力学.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,酶的失活动力学,酶是一种不稳定的物质，常因温度，pH等因素的影响而,产生不可逆的活力下降。,一般胞外酶较为稳定，而胞内酶在外部环境中容易失活。,酶在保存和参与反应时均可能失活；酶在保存过程中的失,活又称为酶的稳定性,，失活越快，说明酶的稳定性降低。,酶的,热失活,是最重要的一种酶失活形式，下面主要讨论此,种失活的动力学。,一、未反应时的热失活动力学,测定酶未反应时的热失活动力学方法,：在一定条件下，使酶溶,液恒温保持一定时间，然后在最适宜的pH和温度下测定残存的,酶活力，即残存酶活力。在不同温度下反复测定，即可得到一,条曲线。该曲线可以表示酶的失活特性，称为,酶的热失活曲线,。,若改变保温时间，则会得到不同的热失活曲线（图1-1)。,如果要了解酶在未反应时的失活速率，可将残存的酶活力对其,失活时间作图，则又可得到一条曲线（图1-2）。,图1-1 不同温度下的酶失活曲线,图1-2 不同时间下的酶失活曲线,这些曲线反应了酶的生活规律。酶的热变性失活很复杂，一般,将其分为可逆失活与不可逆失活两类，并提出了多种失活动力,学模型。下面主要介绍一步失活模型。,1.一步失活模型,（one step model),式中：,E活性酶,D失活酶,k,d,正反应的速率常数,k,r,负反应的速率常数,则活性酶的浓度随时间的净减少率或失活反应方程式可表示为：,系统中酶的总浓度若以c,E,0,表示，则存在下述关系式：,c,E,0,=c,E,t,+c,D (a),(b),将式(b)代入式(a)，并利用边界条件t=0，c,E,0,=c,E,t,积分，经整理可得下式：,(c),对不可逆失活反应，k,r,=0,可得,c,E,t,=c,E,0,exp(-k,d,t),(d),多数酶的热失活服从式(d)，k,d,可称为,一步失活常数,或,衰变常数,，单位,为(时间),-1,。k,d,的倒数称为时间常数t,d,。当c,E,t,为c,E,0,的一半的时间称为,半,衰期,，用t,1/2,表示。k,d,、t,d,和t,1/2,之间的关系为：,2.多步失活模型,（multi-step model),A,多半串联失活模型,：酶的失活经历多步，即D,F,E。,B,同步失活模型,：全部酶分子可划分为热稳定性不同的若干,个组分，每个组分均符合一步失活模型。该模型全部酶中残,存酶活力的比率为：,式中：c,E,0,表示酶的初始浓度；x,i,表示失活速率常数为,ki,的酶组,分的分率。因此，,3.温度对酶失活的影响,对一级失活模型，有失活反应Arrihenius方程,式中：kd表示衰变常数；Ad表示失活反应Arrihenius方程的前指因子；,Ed表示失活反应活化能。,一般蛋白质的变性或失活的活化能为125kJ.mol-1，高于一,般化学反应的活化能（2083kJ.mol-1）,这意味着酶失活对,温度十分敏感。同时考虑温度和时间对酶失活影响的关系式,二、反应时的酶热失活动力学,酶在反应中的稳定性称为,操作稳定性,，可通过分批测定、,连续测定及圆二色谱分析等方法测定。作不同温度下反应,转化率随时间的变化曲线，即,反应过程曲线,，如图2-1所示。,图2-1 不同温度下酶促反应过程曲线,(a)以温度T为参数，转化率X与时间t的关系曲线；,(b)以时间t为参数，转化率X与温度T的关系曲线,由图(a)知时间一定时，随着温度的升高，反应速率增大，,因而转化率增大；但当温度高到某一值时。其转化率反而,减少。因为当温度升高到某一值时，酶的热失活速率也在,加速，致使有活力酶的量在减少，因而反应速率下降，最,终为零。,由图(b)知：对于某一反应时间，存在一转化率最高的温度，,该温度称为,最佳温度,。不同的反应时间，有不同的最佳温度。,最佳温度是温度对酶催化速率和酶失活速率双重作用的结果。,就底物浓度的变化对酶失活的影响，提出了下述模型：,从上述机制看出，无论是游离酶，还是酶的复合物，均有可能,失活，其失活速率方程可表示为:,式中：,表示底物对酶失活的影响系数；c,Ef,表示游离酶浓度。,根据上述模型可知：,（1）当,=0时，反应时酶失活速率达到最低。从反应机制中可以看出，复,合物ES完全不失活，或者说,酶完全被底物所保护,。,（2当=1时，反应时与未反应时酶的失活速率完全相同。从反应机制中,可以看出，复合物ES与游离酶E失活速率常数完全相同，或者说,底物对酶,失活没有影响。,（3）01时，反应时酶失活速率高于未反应时酶失活速率。从反应机制中,可以看出，复合物ES失活速率常数大于游离酶E，或者说,底物加速酶的失活,。,由上述分析可见，,反映了底物对酶失活速率的影响，因此称为,底物对酶,失活影响系数,（也称为,稳定性影响系数,）。,若只有游离酶失活时，其分批反应的动力学方程为,对于零级不可逆反应，cs值趋于无穷大，因此有：,对该式积分，得到,当cs值足够大时，可简化为：,进行积分得到：,代入式中积分得,式中，k,2,k,d,均为温度的函数。,三、失活动力学研究实例,以青蟹N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在甲醛溶液中的失活动力学的研究为例，,通过在酶活力测定体系中加入不同浓度的甲醛，检测酶的剩余活力(2-2)。,研究显示酶在甲醛溶液中的失活作用是一种可逆过程。建立失活动力学,模型，可以测定游离酶(E)和结合酶(ES)的微观失活速度常数(表d)。,图2-2 酶在不同浓度甲醛中的失活作用动力学,(,a)动力学过程；(b)半对数作图。04代表不同浓度的甲醛,表d 青蟹N-乙酰氨基葡萄糖苷酶在甲醛溶液中的失活速度常数,从表d中可以看出，在相同浓度的甲醛溶液中，游离酶的正向微观失活速度,常数(k,+0,)是酶底物络合物的失活速率常数(k,+0,)的35倍，表明游离酶比,结合酶更容易失活；此外正向微观失活速度常数(k,+0,)随着甲醛浓度的增加,而增加，说明其变性越来越快，逆向反应的微观速度常数k,-0,相反地随着甲,醛浓度的增大而下降，表明酶复活的过程越来越慢。,The end,thanks,