重组基因导入受体细胞.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,受体细胞,能摄取外源,DNA,并使其稳定维持的细胞。,受体细胞应具有的特性：,1.,便于导入,2.,能使重组,DNA,分子稳定存在于细胞中,3.,便于筛选,4.,密码子使用没有明显的偏倚,5.,安全性高,并不是所有的细胞都可以用来做受体细胞,原核受体细胞,1.,没有核膜,2.,基因组简单,便于对引入的外源基因进行遗传分析,3.,容易获得一致性的实验材料,单细胞,原核受体细胞,大肠杆菌（,E.coli,）,优点：,1.,研究背景清楚,2.,繁殖迅速培养简单,缺点：,1.,可引起人体致病,2.,缺少加工后修饰,目前商品化的基因工程产品多数是大肠杆菌生产的,人胰岛素、生长素、干扰素,原核受体细胞,枯草芽孢杆菌,能将基因表达产物分泌到培养基中,一般可表达真核蛋白,无致病性,可以形成芽孢，方便培养和保存,原核受体细胞,蓝细菌,含叶绿素，能进行光合作用，营养要求低。,基因组简单，遗传背景清楚。,可以成为植物基因表达的宿主。,真核受体细胞,酵母菌,结构最为简单的真核生物，背景清楚,具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统,使用历史悠久，不产生毒素，安全有保障,培养简单,能将外源基因表达产物分泌到培养基中,真核受体细胞,植物受体细胞,有细胞壁，但可通过纤维素酶降解,原生质体在特定条件下培养，可再生细胞壁，进行细胞分裂植物细胞具有全能性，可以通过一个细胞培养出稳定的植株。,真核受体细胞,动物受体细胞,全能性较差，多采用胚胎细胞作为受体细胞。,优点：,能识别内含子,有翻译后加工修饰功能,真核受体细胞,人体胚胎干细胞,（,Stem cell,）,高度未分化的细胞，是受精卵分裂到囊胚时的细胞，具有体外培养无限增殖和多向分化的特性。几乎可以被诱导成所有的细胞类型。,出于社会伦理的原因，一些国家禁止人类胚胎干细胞的研究。,转化,转化：,重组,DNA,分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。,是一种自然现象,感受态,感受态：,细胞处于能吸收周围环境中,DNA,分子的生理状态。,细胞培养与收集,CaCl,2,处理,50100mmol/L CaCl,2,10mmol/L Tris-HCl,PH8.0,冰水浴,15min,。,转 化,革兰氏阳性菌转化过程,1.,细菌感受态的形成。受体细胞分泌激活蛋白，使细胞壁部分溶解，暴露细胞膜上的,DNA,结合蛋白。,2.,细胞膜上的,DNA,结合蛋白等因子激活核酸酶，降解,DNA,分子的一条链，将另一条链转入到受体菌内部。,转 化,革兰氏阳性菌转化过程,3.,单链,DNA,与其保护蛋白结合，转移到受体菌染色体,DNA,处。,4.,单链,DNA,同源重组到受体菌染色体,5.,转化子,形成。,DNA,转化感受态细胞,在感受态细胞中加入缓冲液和,DNA,，,1,小时以上，期间轻摇几次。,迅速转移至,42,摄氏度水浴,2min,，促使感受态吸收,DNA,分子。,转移到,37,摄氏度温浴,5min,，加入,LB,培养基,筛选转化子,转化率及其影响因素,转化率,1.,转化子数,/,用于转化处理的,DNA,分子数,2.,转化子数,/,受体细胞数,转化率及其影响因素,影响转化率的因素,1.,分子质量小，转化效率高,大于,30kb,的重组质粒很难进行转化,2.,载体类型,闭合双螺旋,DNA,要比线性,DNA,转化率高,对细胞亲和性强的载体转化率高,3.,重组,DNA,分子的浓度与纯度,转导,转导：,病毒感染细胞并将外源,DNA,分子导入到受体细胞并稳定遗传的过程。,具有感染能力的噬菌体颗粒,重组,DNA,头部蛋白、尾部蛋白,转染,转染：,将重组的,噬菌体,DNA,直接导入受体细胞的过程。,效率很低,辅助噬菌体对受体细胞预感染，提高转染率，但会给操作带来很多不方便,实际操作中很少使用,电激穿孔,原理：,利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上形成可逆瞬间通道，从而促进外源,DNA,的有效吸收。,电压增高和作用时间延长，有助于提高转化率，但细胞存活率降低。,三亲本杂交,基于非结合型质粒的迁移作用而建立的一种转化方式。,接合型质粒、非接合性质粒,将接合质粒转移到含有重组质粒的供体细胞中，然后将供体细胞与受体细胞混合，促使转化。,三亲本：受体菌、含重组质粒的供体菌、含有结合型质粒的辅助菌。,重组,DNA,分子导入酵母细胞,聚乙二醇（,PEG,）,/,乙酸锂,乙酸锂可使酵母细胞产生短暂的感受性状态。,PEG,可以在高浓度乙酸锂环境中保护细胞膜，减少乙酸锂对细胞膜的过度损伤，同时促进质粒与细胞膜的结合。,重组,DNA,分子导入酵母细胞,用溶菌酶剥去酵母菌的细胞壁，形成原生质体。,酵母细胞壁主要由,D-,葡聚糖和,D-,甘露聚糖两类多糖组成，含有少量的蛋白质、脂肪、矿物质,Thank You,