第四章蛋白质的化学.pptx

2020年2月1日12时31分,烟台大学药学院,School Pharmacy of Yantai University,#,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,#,第四章 蛋白质的化学,第一节,蛋白质是生命的物质基础,第二节,蛋白质的化学组成,第三节,蛋白质的分子结构与合成原理,第四节,蛋白质的结构与功能,第五节,蛋白质的性质,第六节,蛋白质的分离与纯化的基本原理,第七节,蛋白质的分类,第一节 蛋白质是生命的物质基础,一 蛋白质是构成生物体的基本成分,蛋白质,(protein):,是由许多不同的,-,氨基酸按一,定的序列通过酰胺键,(,肽键,),缩合而成的,具有较,稳定的构象并具有一定生物功能的大分子,.,蛋白质存在于所有的生物细胞中,是构成生物体最,基本的结构物质和功能物质,.,蛋白质的分布,:,蛋白质是细胞中含量最丰富的高分子有机化合物,.,占人体总干重的,45%,细菌占,50-80%,干酵母,47%,高等植物大豆含,40%,二 蛋白质具有多样性的生物学功能,蛋白质在生命活动过程中有重要的作用：,生物催化,酶类，已知的有,3000,种以上,代谢调节,，,部分激素,免疫保护,，,抗体、干扰素,物质的转运和贮存,，,载体蛋白,运动与支持,，,肌肉、骨骼、鞭毛,控制生长和分化,，,基因表达调控,接受和传递信息,，,配体和受体,构成生物膜,.,第二节 蛋白质的化学组成,一 蛋白质的元素组成,蛋白质是一类含,氮,有机化合物,.,某些蛋白质还含有微量元,素,主要是磷,(P),、铁,(Fe),、铜,(Cu),、锌,(Zn),和碘,(I),等,.,N,的含量平均为,16%,：,凯氏,(Kjadehl),定氮法,的理论基础,蛋白质的含量,=,蛋白质的含氮量,100/16=,蛋白质的含氮量,6.25,化学式：,C3H6N6,二,.,蛋白质的结构的基本单位,氨基酸,(amino acids):是蛋白质水解的最终产物,是蛋白质结构的基本单位,.,所有蛋白质都由,20,种基本氨基酸组成,.,氨基酸的结构,20,种氨基酸,(aa),的结构特点,:,均为,L-,氨基酸,均为,氨基酸,脯氨酸除外,(,亚氨基酸,),-,碳原子为不对称碳原子,(,甘氨酸除外,),各种,aa,的,R,侧链各不相同,2.,不常见氨基酸,在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸,这些氨基,酸都由相应的基本氨基酸衍生而来的,.,其中重要的有,4-,羟基脯氨酸、,5-,羟基赖氨酸、,N-,甲基赖氨酸、和,3,5-,二,碘酪氨酸等,.,这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下：,三、氨基酸,可根据侧链结构和理化性质进行分类,非极性氨基酸：,丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸,不带电荷的极性氨基酸：,甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺,带正电荷的极性氨基酸：,赖氨酸、精氨酸、组氨酸,带负电荷的极性氨基酸：,天冬氨酸、谷氨酸,极性氨基酸,几种特殊氨基酸,脯氨酸,（亚氨基酸）,CH,2,CHCOO,-,NH,2,+,CH,2,CH,2,CH,2,CHCOO,-,NH,2,+,CH,2,CH,2,半胱氨酸,+,胱氨酸,二硫键,-,H,H,-,OOC,-,CH,-,CH,2,-,S,+,NH,3,S,-,CH,2,-,CH,-,COO,-,+,NH,3,-,OOC,-,CH,-,CH,2,-,S,+,NH,3,S,-,CH,2,-,CH,-,COO,-,+,NH,3,-,OOC,-,CH,-,CH,2,-,SH,+,NH,3,-,OOC,-,CH,-,CH,2,-,SH,+,NH,3,HS,-,CH,2,-,CH,-,COO,-,+,NH,3,HS,-,CH,2,-,CH,-,COO,-,+,NH,3,四、氨基酸其他重要的概念,必需氨基酸,(essential amino acid,EAA),：,人体体内自身不能合成,必须从食物中获,成人有,8,种必需氨基酸：,赖氨酸,(Lys),缬氨酸,(Val),色氨酸,(Try),亮氨酸,(Leu),异亮氨酸,(Ile),苏氨酸,(Thr),苯丙氨酸,(Phe),甲硫氨酸（蛋氨酸）,(Met),婴儿时期所需,:,精氨酸,(Arg),、组氨酸,(His),食物蛋白质的互补作用,:,营养价值较低的食物蛋白质合理搭配、混合食用,从而互补必需氨基酸的不足,提高营养价值,.,2.,紫外吸收,色氨酸、酪氨酸,和,苯丙氨酸,在,280nm,附近有一定的吸收,.,原因：分子中含有苯环,(,共轭双键,).,据此可以通过测定蛋白质溶液,280nm,的吸光值测定蛋白质含量,3.,茚三酮反应,氨基酸与水合茚三酮一起加热,生成蓝紫色化合,物,在,570nm,处有最大吸收,.,可用作,aa,含量分析,.,氨基酸与水合茚三酮共热,发生氧化脱氨反应,生成的,NH,3,与还原吲三酮及水合茚三酮脱水缩合,生成,蓝紫色,化合物,4.,两性解离及等电点,不同,pH,时氨基酸以不同的离子化形式存在：,氨基酸所带静电荷为零时,溶液的,pH,值称为该氨基酸,的,等电点,(isoelectric Point),以,pI,表示,pI,的用途：分离、纯化和鉴定蛋白质制剂、,AA,制剂，在药物,使用上可改变,PI,方法延长疗效,五、氨基酸的分离与分析,1.,自动氨基酸分析仪,2.,高效液相色谱,(,high performance liguid chromatography,，,HPLC,),3.,离子交换层析,4.,质谱,(MS),第三节 蛋白质的分子结构与合成原理,蛋白质的分子结构分为一级结构和空间结,构,(,二、三、四级结构,).,一 蛋白质的一级结构,(primary structure),一级结构指蛋白质分子中氨基酸残基的种,类、数量及排列顺序,.,包含的共价键主要指肽,键和二硫键,(disulfide bond).,(,一,),肽键,(peptide bond),和肽链,(polypeptide),肽键：,一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基,之间失水形成的酰胺键称为肽键,.,肽键特点：,组成肽键的原子处于同一平面,肽键中的,C-N,键具有部分双键性质,不能自由旋转,肽健,C-N:0.133nm,C,N:0.125nm,C,N:0.145nm,肽,(peptide):,氨基酸借肽键相连而形成的化合物,.,二肽,三肽,蛋白质与多肽并无严格的界线,通常将分子量在,6kDa,以上的多肽称为蛋白质,寡肽,(oligopeptide):,由,10,个以内氨基酸连成的小肽,肽链,:,氨基酸之间通过肽键连接形成的链,.,有链状、环状和分支状,.,氨基酸残基,(amino acid residue):,组成多肽的氨基酸单元,.,氨基酸在形成肽链时丢失一分子水,分子已,不完整,.,二硫键：,两分子半胱氨酸残基的巯基脱氢生成的，可存在肽链内部和肽链之间,.,多肽链的一端含有一个游离的,-,氨基，称为,氨基端,或,N-,端,；在另一端含有一个游离的,-,羧基，称为,羧基端,或,C-,端,.,氨基酸的顺序是从,N,端的氨基酸残基开始，以,C,端氨基酸残基为终点的排列顺序,.,如上述五肽可表示为,:Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,SVYDQ,Ser-Val,和,Val-Ser,是相同的二肽吗？,多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位,生物活性肽:,1.,谷胱甘肽,(glutathione，GSH),功能：GSH是体内重要的还原剂,构成第一个肽键的羧基是,谷氨酸的,羧基,2.,促甲状腺素释放激素,由下丘脑分泌,促进腺垂体释放促甲状腺素(调节糖代谢),3.,牛胰岛素结构：,(,二,),蛋白质一级结构测定的原理,一级结构测定目的,:,知道氨基酸的组成和排列顺序,一级结构确定的原则,：将大化小,逐段分析,制成两套肽片段,找出重叠位点,排出肽的前后位置,最后确定蛋白质的完整序列,.,2.1 N-,末端氨基酸的分析,(1),二硝基氟苯法,(DNFB),分离,DNP-,氨基酸，用纸层析、,HPLC,进行分析,该方法已过时,首先由,Sanger,应用，,确定了胰岛素的一级结构,(2),丹磺酰氯法,(DNS-Cl):,此法优点,丹磺酰,-,氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度比,DNFB,高,100,倍，产物不必提取直接分析,(3),Edman,降解法,(,苯异硫氰酸酯法、,PITC,法、,PTC,法、,PTH,法,),Edman,于,1950,年首先提出,(4)氨肽酶法：一种肽链外切酶.能从肽链,N,端开始逐个切掉氨基酸,2.2,C,-末端氨基酸的分析,羧肽酶法：,羧肽酶是一种肽链,C,-端外切酶，目前常用的羧肽酶：A,B,C和Y.,种类,作用类型,A,脂肪族或芳香族氨基酸（脯氨酸除外）,B,碱性氨基酸,C,C,末端的脯氨酸,Y,几乎所有类型氨基酸（最适用）,(2),肼解法,:,也称联氨法,.,多肽与肼在无水条件下加热,C-,端氨基酸即从肽链上解离出来,其余的氨基酸则变成肼化物,.,肼化物能够与,苯甲醛缩合,成不溶于水的物质而与,C-,端氨基酸分离,.,3.大分子多肽氨基酸顺序的确定,采用两种或多种不同的断裂方法将长肽断裂成两套或多套小肽,并将其分离纯化、分别测序.,多肽的选择性降解的方法有：,化学法：,溴化氰,水解法,它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键.,酶解法:,利用重叠肽确定肽段在多肽链中的次序,：,利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的,交错重叠,拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序,.,5.,从核酸顺序推导氨基酸顺序,原理：通过核酸的氨基酸顺序（三个核苷酸确定一个氨基酸的密码）。,优点：对经典化学法难以测定的大分子蛋白质或生物体含量很低的蛋白质很适用,缺点：无法提供二硫键的位置等信息,二 蛋白质的构象,(conformation),蛋白质的一级结构不具有功能,只有形成正确的结构才具有功能二级结构以上的结构叫高级结构,高级结构是指各原子或基团在空间上的分布,所以又叫空间结构,或三维结构,可分为,:,二级结构,三级结构,四级结构,(,一,),蛋白质的二级结构,(,secondary structure,),蛋白质的二级结构是指肽链的主链在空,间的排列,或规则的几何走向、旋转及,折叠,.,只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键,.,主要有,-,螺旋、,-,折叠、,-,转角,.,1.-,螺旋,(,-helix,),由肽键平面盘旋形成的螺旋状构象,Pauling,和,Corey,于,1965,年提出,结构要点：,天然蛋白质中螺旋的方向大都为,右手螺旋,(仅在嗜热菌蛋白酶中发现了一段左手螺旋).,每,3.6个氨基酸,螺旋上升一圈,每圈螺旋的高度为0.54 nm,每个氨基酸残基沿轴上升,0.15nm,肽键平面与中心轴平行.,主链,原子构成螺旋的,主体,侧链,在其,外部,肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的-CO基与第四个氨基酸残基的-NH基形成氢键.,是稳定螺旋的主要作用力,影响,-,螺旋稳定性的因素：,在多肽链中连续的出现带,同种电荷,的极性氨基酸，阻止氢键形成，,-,螺旋就不稳定,Pro,的,N,上缺少,H,，不能形成氢键，它改变多肽链的方向并,终止螺旋,Gly,的,R,基太小，难以形成,-,螺旋所需的两面角，也是螺旋的最大,破坏者,肽链中,连续出现带庞大侧链的氨基酸,如,Ile,，由于空间位阻，也难以形成,-,螺旋,pH,的影响,（,4,条,-,螺旋）原纤维,微原纤维,巨原纤维,纺锤体型皮质细胞,角质膜,皮质,髓质,头发,头发结构,烫发的生物化学过程,2.-,折叠,(,-pleated sheet,),-,折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列,通过链间氢键交联形成,.,肽链的主链呈锯齿状折叠构象,.,-,折叠的结构要点：,肽键平面呈,锯齿状,排列,侧链基团交错分布在片层平面的两侧,由,氢键维持,稳定,.,其方向与折叠的长轴接近垂直,.,有两种类型,:,平行式,，即所有肽链的,N-,端都在同一边,:,反平行式,，即相邻肽链的方向相反,每一个氨基酸在主轴上所占的距离，平行的是,0.325nm,，反平行的是,0.35nm,.,反平行式更稳定,.,3.,-,转角,(-turn),也称,-,回折或发夹结构，存在于球状蛋白中,在,-,转角部分，由,四个氨基酸残基,组成,弯曲处的第一个氨基酸残基的,-C=O,和第四个残基的,N-H,之间形成氢键，维持构象,.,经常出现在连接反平行,-,折叠片的端头,.,4.,无规卷曲,(random coil),自由回转,无规律的松散肽链结构,.,常常是酶的活性部位,(,二,),超二级结构,指二级结构的基本结构单位,(-,螺旋,-,折叠等,),相互聚,集,形成有规律的在空间上能辨认的聚集体已知的超二,级结构主要有,-,曲折和,-,折叠筒等,.,是氨基酸侧链相互作用的结果,.,超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集,成具有功能的结构域,又称基序或模块（,motifs,）,(,三,),结构域,(,structural domain,),结构域是球状蛋白质的折叠单位,.,多肽链在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球行的结构,具有部分生物功能,.,结构域一般由,100-200,个,aa,组成,氨基酸可以连续,也可以不连续,结构域之间常形成裂隙,比较松散,往往是蛋白质优先被水解的部位,.,酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上,可作为结构单位进行,相对独立的运动,水解后仍能维持稳定的结构,甚至保留某些生物活性,对于较小的蛋白质分子,结构域与三级结构等同,即这些蛋白为单结构域,.,结构域有时也称,功能域,功能域是指有功能的部分,.,功能域可以是一个结构域,也可以是两个或两个以上的结构域组成,.,(,四,),三级结构,(,tertiary structure,),蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构,的基础上进一步盘旋、折叠,从而生成特,定的空间结构,.,包括主链和侧链的所有原子,的空间排布,一般非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核，极性侧链在分子表面,(,四,),四级结构,(,quarternary structure,),蛋白质的四级结构是指由多条各自具有一、二、三,级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式,内,容包括,各个亚基在蛋白质中的空间排列方式及亚基,之间的相互作用关系,.,这种蛋白质分子中，每一个具有独立三级结构的肽链,称为亚基,(Subunit),它一般由一条肽链构成,无生理活性,只有当这些亚基聚合成一个完整的蛋白质分子后,才具有生物活性,由,2-10,个亚基组成的蛋白称为,寡聚体,oligomer,更多亚基组成的蛋白称,多聚体,(polymer),(,五,),维持蛋白质构象的化学键,1,氢键,(,hydrogen bond,):,一个电负性大的原子上的氢和另一个电负性大的原子相互作用形成的键,.,2,疏水键,(,hydrophobic bond,):,由两个非极性基团因避开水而聚在一起的作用力,.,3,盐键,(,ionic bond,):,蛋白分子中正电荷基团和负电荷基团之间的静电吸引所形成的化学键,.,4,范德华引力,(,Van der Waals,):,原子,分子,基团间的一种弱作用力,.,5,二硫键,(,disulfide bond,),维系蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键,维系蛋白质分子的二级结构：氢键,维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键,维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键,三 蛋白质空间结构测定,1.,二级结构测定,通常采用圆二色光谱,(circular dichroism,，,CD),测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量,.,-,螺旋的,CD,峰有,222nm,处的负峰、,208nm,处的负峰和,198 nm,处的正峰三个成分；而,-,折叠的,CD,谱不很固定,2.,三级结构测定,X,射线衍射法,(X-ray diffraction),和核磁共振技术,(nuclear magnetic resonance,NMR),是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法,四 蛋白质和多肽合成的基本原理,(,一,),化学合成法的基本原理,氨基酸的基团保护,氨基保护基,Y,：,Cbz-Cl(,苄氧碳酰氯,),：,H2/Pd,或,Na-,液氨法去除,Boc-Cl(,叔丁氧碳酰氯,)稀盐酸法去除,2.,缩合剂：,N,N-,二环己基碳二亚胺,(,N,N-dicyclohexyl carbodiimide,缩写,DCCI,),多肽的液相合成,(1),氨基酸的基团保护,(2),接肽缩合反应,(3),除去保护集团,循环反应，合成顺序,N,端到,C,端,多肽的固相合成,常用固相载体：聚苯乙烯树脂,羧基与载体相连,.,合成方向：,C,端到,N,端,(,二,),生物技术合成蛋白质,1.,基因工程,(,genetic engineering,)(DNA,重组,),2.,细胞工程,(cell engineering),3.,酶工程,(enzyme engineering),第四节 蛋白质的结构与功能,一 蛋白质一级结构与功能的关系,1.,一级结构不同,生物学功能各异,不同蛋白质有不同功能的根本原因是一级结构的不同,.,一级结构决定高级结构进而决定功能,.,2.,一级结构中关键部分相同,功能也相同,ACTH,：促肾上腺皮质激素,垂体前叶分泌,3.,一级结构中关键部分变化,其生物活性也改变,4.,一级结构的变化与疾病的关系,如镰刀贫血病,(sickle-cell anemia),其不正常,的血红蛋白,(Hb-S),与正常的血红蛋白,(Hb-A),的差,别：仅仅在于,链的,N-,末端第,6,位残基发生变化,CTTCAT,糖尿病是胰岛素,51,个氨基酸中仅有一氨基酸残基,异常,:,这类由遗传突变引起的在分子水平上仅存在微观差异而导致的疾病称作,分子病,二 蛋白质的空间构象与功能的关系,蛋白质分子特定的空间构象是其具有生物活,性所必需的,.,1.,蛋白质前体的活化,有些蛋白在体内是以无活性的蛋白质原形式,合成和分泌的,经过裂解之后才表现出活性,.,一些酶原和蛋白质,.,例：胰岛素,在刚合成时为前胰岛素原,其的,N-,末端有一段肽链,称为信号肽,.,信号肽被切去,变成胰岛素原,.,其由,84,个,aa,组成,仅有,10%,活性,经水解成一条,21,个,aa,的,A,链,一条,30,个,aa,的,B,链，才有完整的生物活性,.,2.,蛋白质的变构现象,变构作用,(,allosteric effect,),：,又称别构效应,指含,亚基的蛋白质分子由于一个亚基构象的改变而引,起其余亚基以至整个分子构象、性质和功能发生,变化,.,以血红蛋白为例：,血红蛋白,(Hb),四聚体,(22),与氧的亲和力很,弱,但当氧与,Hb,分子中一个亚基的血红素辅基的,铁结合后,.,即引起该亚基构象的改变,一个亚基构,象的改变又会引起其余亚基的构象相继发生改变,易于与氧结合,使,Hb,与氧结合的速度大大加快,.,3,蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象病,比如：朊病毒蛋白（,PrP),三 蛋白质的结构与生物进化,同源蛋白,：在不同有机体中实现同一功能的蛋白质,.,同源蛋白中的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称为,不变残基,；其他位置的氨基酸称,可变残基,.,不同种属的可变残基有很大变化,.,可用于判断生物体间亲缘关系的远近,.,例：细胞色素,C,80,个物种中,有,26,个位置上的氨基酸残基完全不变,是维持其构象中发挥特有功能所必要的部位,属于不变残基,.,可变残基可能随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素,C,氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关,.,亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多,(,进化树,),第五节 蛋白质的性质,蛋白质是由氨基酸组成，因此蛋白质的性质与氨基酸相似,但由于蛋白质是由许多氨基酸通过肽键形成了大分子化合物,也就出现了一些新的性质,.一 蛋白质分子的大小、形状及分子量的测定,1.,蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量一般大于,110,4,.,最高可达,410,7,(,烟草花叶病毒,),2.,球形 不对称常数接近,1,纤维状 不对称常数远大于,10,椭圆形 不对称常数介于中间,3.,分子量测定的方法,1),估算分子量方法：,a),根据化学成分测定最小相对分子质量,首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分的百分含量,假定蛋白质分子中该成分只有一个,据其百分含量可计算出最低相对分子质量：,最小分子量,=,原子量,/,组成百分数,100,如：细胞色素,C,铁,=0.45%,，其最小分子量,=12237,b),根据氨基酸的数目,20,种氨基酸的平均分子量为,128,肽键个数,=,缩合失水分子数,=,氨基酸分子总个数肽链条数,已知,20,种氨基酸的平均分子量是,128,，现有一,蛋白质分子由两条多肽链组成，共有肽键,98,个,问此蛋白质的分子量最接近于（）,2),较精确测定分子量的主要方法有,超速离心法,、,分子筛层析法,、,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,、,生物质谱法,等,.,11036,a,）超速离心法,在,60000,80000rpm,的高速离心力作用下,蛋白质分子会,沿旋转中心向外周方向移动,用光学方法测定界面移动,的速度即为蛋白质的离心沉降速度,.,蛋白质的沉降速度,与,分子大小和形状,有关,.,沉降系数,是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度,用,S,表示,.,一个,S,单位为,110,-13,秒,相对分子质量越大,S,值越大,蛋白质的沉降系数：,1,200S,由沉降系数,S,可根据斯维得贝格,Svedberg,方程计算蛋白质分子的相对分子质量：,b),分子筛层析法,也叫凝胶过滤法,所用介质为凝胶珠,其内部为多孔网状结构,.,一定型号的,凝胶网孔只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部,大分,子则被排阻在外,.,洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下,来,洗脱液体积小,;,小分子在颗粒网状结构中穿来穿去,历,程长,后洗脱下来,洗脱体积大,.,测定蛋白质分子量一般用葡聚糖,商品名,:Sephadex先测得几种标准蛋白质的洗脱体积,Ve,以相对分,子质量对数,(logM),对,Ve,作图,得一标准曲线,再测出未知样品洗脱体积,Ve,从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量,一定范围内,:,Ve,K,1,K,2,logM,c)SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳法,(SDS-PAGE),SDS:,十二烷基硫酸钠,变性剂,普通蛋白质电泳的泳动速率取决于,荷质比,:,净电荷,大小,形状,用,SDS,和巯基乙醇,(,打开二硫键,),处理,蛋白质变性并与,SDS,结合,形成,SDS-,蛋白质复合,物,使蛋白质分子均带负电,.,0.4g,-1.4g SDS/1g,此方法只能测得 亚基肽链的相对分子质量,十二烷基硫酸钠,Sodium dodecyl sulfate,分子式：,CH,3(,CH,2,),11,OSO,3,Na,分子量：,C,12,H,25,NaO,4,S=288.38,性状：白色或浅黄色结晶或粉末,.,熔点：,180,（分解）,.,十 二 烷 基 磺 酸 钠,Dodecyl sulfonic acid sodium salt,分子式：,CH,3,(CH,2,),11,SO,3,Na,分子量：,C,12,H,25,NaO,3,S=272.38,性状：白色或浅黄色结晶或粉末,.,熔点：,300.,水平式电泳装置,垂直式电泳装置,用几种标准蛋白质,相对分子质量的对,数值对它们的迁移,率作图测出待测,样品的迁移率，从,标准曲线上查出样,品的相对分子量,.,d),生物质谱法,更准确的分子量测定方法,二 蛋白质的变性,(denaturation),变性,是指蛋白质受物理或化学因素的影响,使蛋,白质分子原有的特定的空间构象发生改变,从而,导致蛋白质性质的改变以及生物活性的丧失,.,但,一级结构未遭破坏,.,1.,变性蛋白质的特性：,变性蛋白质主要标志是,生物学功能的丧失,溶解度降低,易形成沉淀析出,粘度增加而扩散系数减小结晶能力丧失,分子形状改变,肽链松散,反应基团增加,易被酶消化,2.,变性的因素,物理因素,:,加热、紫外线、,X-,射线、超声波等,.,化学因素,:,酸、碱、有机溶剂、蛋白变性剂,(,尿,素、盐酸胍,),、重金属盐等,.,3.,蛋白质的复性,(renaturation),除去变性因素后,有的变性蛋白质又可恢复其天,然构象和生物活性,这一现象称为蛋白质的复性,蛋白质的一级结构决定高级结构,三 蛋白质的两性电离与等电点,等电点,(,pI,):,在某一,pH,值溶液中,蛋白质酸性基团,和碱性基团的解离程度相当,蛋白质分子所带正,负电荷相等,净电荷为零,.,此时溶液的,pH,值称为蛋,白质的等电点,(,pI,).,四 蛋白质的胶体性质,蛋白质分子颗粒大小,1-100nm,之间,属胶体颗粒范围,在溶,液中能形成稳定的胶体,具有胶体溶液的典型性质如布郎,运动、丁达尔现象、不能透过半透膜、具有吸附能力等,.,蛋白质的亲水胶体溶液相当稳定：,1.,表面亲水基团吸引周围的水分子,使水分子定,向排列在它的周围,形成,“,水化层,”,.,2.,蛋白质在非等电点时带有,同种电荷,同种电荷相斥,使蛋白质分子保持一定,的距离而不聚合,.,+,+,+,+,+,+,+,带正电荷的蛋白质,五 蛋白质的沉淀反应,(pre-cipitation),当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质,的构象时,蛋白质就会从溶液中析出,这种现象,称为蛋白质的沉淀,使蛋白质沉淀的方法,:,盐析法,(salting out),向蛋白质溶液中加入大量中性盐,低浓度中性盐：,盐溶,作用,高浓度中性盐盐析,作用,常用的中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等,作用原理,:,盐离子与水亲和力极强,夺去蛋白质的,水化层,减少分子间静电斥力,特点：不破坏蛋白质的构象,蛋白质不发生变性,分段盐析：调节盐浓度,可使混合蛋白质溶液中,的几种蛋白质分段析出,.,如 血清球蛋白,(50,硫酸铵饱和度,),清蛋白,(,饱和硫酸铵,),(2),有机溶剂沉淀法,原理,:,使蛋白质脱去水化层,又能降低溶液的介电,常数使蛋白质表面电荷减少,导致蛋白质分,子聚集而沉淀,.,常用有机溶剂,:,甲醇、乙醇、丙酮,缺点：常会使蛋白质变性,注意事项,:,必须低温下操作,尽量缩短处理的时间,重金属盐沉淀法,原理,:,重金属离子如,Hg,2+,、,Ag,+,、,Pb,2+,等带有正电荷,能与蛋白质分子中带负电基团结合,生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀,.,若溶液,pH,大于蛋白质的,pI,沉淀更易发生,缺点：此法常使蛋白质变性失活,(4),加热,:,变性导致沉淀,(5),生物碱试剂和某些酸类沉淀法,原理,:,生物碱试剂,(,如鞣酸、苦味酸、钨酸等,),某些酸类,(,三氯乙酸、磺酰水杨酸和硝酸等,),与带正电的蛋白质结合生成不溶性的盐而沉淀,注意事项,:,反应溶液的,pHpI,确保蛋白质以阳离,子形式存在,缺点：此法常使蛋白质变性失活,六 蛋白质的颜色反应,七 蛋白质的免疫学性质,1.,抗原,(antigen,Ag):,外源和非自身的能被免疫系统识别并产生免疫应答的物质,.,免疫原性,(Immunogenicity):,能刺激生物体产生免疫应,答并产生抗体或免疫淋巴细胞的特性,.,免疫反应性,(Specific reactivity):,能与所产生免疫应,答产物进行结合并发生反应的能力,.,半抗原,(Hapten)-,不具免疫原性只具免疫反应性的物质,.,抗原决定簇,(Determinant):,是抗原引起免疫应答,和与抗体结合反应的基本结构单位,.,常位于抗原分子的表面,由,3-8,个氨基酸构成,.,分为,a.,构象决定簇,b.,顺序决定簇,2.,抗体,(antibody,Ab):,能与抗原特异性结合,并,具免疫功能的球蛋白,.,免疫球蛋白,(,immunoglobulin Ig,),抗体活性及和抗,体结构类似的球蛋白家族,多克隆抗体,(,polyclonal antibodies,),：,针对各种抗原决定簇的许多不同的抗体,.,单克隆抗体,(,monoclonal antibody McAb,),：,针对单一抗原决定簇,抗原抗体反应具有高度特异性,3,蛋白质免疫性的应用,疾病的免疫,预防,免疫,诊断,免疫,治疗,免疫分析,:,放射免疫分析,(RIA),酶联免疫分析,:(EIA),免疫分离纯化,:,免疫亲和层析,BACK,第六节 蛋白质分离与纯化的基本原理,一 蛋白质的提取,1.,材料的选择,.,含目的蛋白多,来源方便,注意处理过程,2.,组织细胞破碎,.,有机械方法、超声法等,3.,提取分离,.,合适的溶剂和方法、防止酶解,.,二 蛋白质的分离与纯化,(,一,),根据,溶解度,不同的分离纯化方法,1,等电点沉淀法,2,盐析沉淀法,3,低温有机溶剂沉淀法,4,温度对蛋白质溶解度的响,(,二,),根据,分子大小,不同的分离纯化方法,1,透析,(,dialysis,),和超滤法,(,ultrafiltration,),透析,:,将蛋白质溶液放在半透膜袋内,置于适当的,缓冲液中,小分子杂质,(,如硫酸铵等,),可从袋中透出,而蛋白质保留于袋中,从而将蛋白质纯化,.,超滤法：,利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通过超滤膜,(,一种半透膜,),除去,而蛋白质留在膜上,.,2,分子筛层析,(,molecular-sieve hormatography,),也叫凝胶过滤,(,gel-filtration,),常用的凝胶：,葡聚糖凝胶,(,商品名,Sephadex),聚丙烯酰胺凝胶,(,商品名,Bio-GelP),琼脂糖凝胶,(,商品名因生产厂家而 不同,),3,密度梯度离心,(density gradient centrifugation),(,三,),根据,电离性质,不同的分离方法,电泳法和离子交换层析,1.,电泳法,:,带电颗粒在电场中向着所带电荷相反方,向移动称为电泳,.,原理,:不同的蛋白质因结构、形状和带电量的不同,而有不同的泳动速度,从而可以进行分析和分离,.,分类：,根据支持物的不同，可分为：薄膜电泳，凝胶电泳,.,等电点聚焦电泳,：形成,pH,梯度,不同蛋白质聚集到,各自等电点位置,.,等电点聚焦电泳,（,IFE,）,：形成,pH,梯度,不同蛋白质聚集到各自等电点位置,.,双向电泳,第一向,：等电聚焦电泳,第二向,：SDS-PAGE,双向电泳后的凝胶经染,色后蛋白呈现二维分布图：,水平方向反映出蛋白在pI上的差异，,垂直方向反映出它们在分子量上的差别,.,2.,离子交换层析,(,Ion-exchange chromatography,),常用的阳离子交换剂为羧甲基纤维素,(CM-C),阴离子交换剂为二乙氨基乙基纤维素,(DEAE-C),2.,离子交换层析,(,Ion-exchange chromatography,),常用的阳离子交换剂为羧甲基纤维素,(CM-C),阴离子交换剂为二乙氨基乙基纤维素,(DEAE-C),(,四,),根据,配基特异性,的分离纯化方法,亲和层析法,(,affinity chromatography,):,蛋白质和,相应配基的亲和力具有高度特异性和可逆性特点,.,抗原、,Protein A,和抗体，酶与底物等,.,三 蛋白质的纯度鉴定和含量测定,(,一,),蛋白质的纯度的鉴定,1.,层析法 高压液相层析法,(HPLC),2电泳法 高压毛细管电泳法,(HPCE),3.,免疫化学法,放射免疫分析,(RIA),酶标记免疫分析法,(EIA),4.N,末端测序,(,二,),蛋白质的含量测定,1.,凯,氏定氮法,(Kjedahl),2.,福林,-,酚试剂法,(Lowry),，,25,250 g/mL,3.,紫外分光光度法,280nm,有最大吸收,蛋白质浓度,(mg/mL)=(1.55A,280,-0.75A,260,),稀释倍数,4.,双缩尿法，,0.5,10 mg/mL,5.BCA,法,.,蛋白质将,Cu,2+,还原为,Cu,+,再和,BCA(4,4-,二羧酸,-2,2-,二喹啉钠,),反应生成紫色物质,.562nm读数,.10-1000g/mL,6.Bradford,法,.,考马斯亮蓝,G-250,与蛋白质结合后由淡红色变成蓝色化合物,595nm,读数,.25-200g/mL.,速度快重复性好,读数法都要做标准曲线,BACK,第七节 蛋白质的分类,一根据分子形状分类,1.,球状蛋白：功能蛋白,2.,纤维状蛋白：结构蛋白,二根据化学组成分类,碱性蛋白质，存在与细胞核中,存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中,色素物质,糖类物质,脂类结合,核酸,磷酸,血清,-,，,-,脂蛋白,核糖核蛋白,胃蛋白酶,三,.,根据溶解度分类：,1.,可溶性：溶于水、稀酸、中性盐,2.,醇溶性：一定浓度的乙醇,3.,不溶性：都不溶,.,如角蛋白，胶原蛋白,四,.,根据功能分类,BACK,