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1、免疫多聚酶链反应 一、 原理 免疫多聚酶链反应(PCR)是一种抗原检测系统，将一段已知序列的DNA片段标记到抗原抗体复 合物上，再用PCR方法将这段DNA扩增，然后用常规方法检测PCR产物。由于PCR具有强大的扩 增能力，因而比常规的免疫学检测法，如ELISA和放射免疫测定(RIA)的敏感性提高好几个数 量级。 免疫PCR的原理与ELISA和RIA等常规免疫学检测方法基本相同，只不过是用DNA片段代替了酶 或放射性核素作为标记物。通常需要一个对抗体和DNA具有双亲和力的连接物，将DNA与抗体 偶联在一 起。抗体与抗原结合后，用该DNA片段特异的一对引物做
2、PCR，分析扩增产物。特异性PCR产 物的存在表明有该DNA片段标记的抗体所针对的特异性抗原存在。 将DNA标记到抗体分子上的方法有多种，一种是通过链亲和素(streptavidin)蛋白A(prote in A)的融合蛋白，它具有两种独立的结合功能，链亲和素结合生物素(biotin)，蛋白A结合 免疫球蛋白G的Fc片段，从而使生物素标记的DNA片段连接到IgG分子上。另一种方法是用单 特异性的多价结合分子，如亲和素(avidin)或链亲和素，它们是四价分子，即一个分子可与 四个生物素分子结合，因而可以将生物素标记的DNA片段与生物素标记的抗体分子结合到一 起
3、 二、 材料、方法和结果 免疫PCR可以在96孔塑料板(ELISA板)或微量离心管(05ml)中进行。 (一) 生物素标记特异性抗体免疫球蛋白(如IgM、IgG)的Fc片段上有糖基 存在，因而可用能与糖基结合的BiotinLChydrazide作生物素标记。 1将纯化的抗体(IgM或IgG，01~1mg/ml)在标记缓冲液(01mol/L NaAc,pH值55，01 mol/L NaCl)中4℃透析过夜。 2吸取05ml至微量离心管中，加过碘酸钠溶液至终浓度10mmol/L，置冰浴上于暗处孵育3 0min，使抗体分子上的糖基氧化。 3
4、将氧化的抗体过PBS平衡的Sephadex G25 PD10预装柱(Pharmacia)，使之与过碘酸钠分 开。收集蛋白峰。 4向抗体管中加入biotinLChydrazide(Pierce)至终浓度5mmol/L，置混摇器上室温孵 育1h。 5用含002% NaN３的PBS平衡Sephadex G25预装柱，将生物素标记的抗体分子过柱与游 离的生物素分开。收集蛋白峰，保存在-20℃。 (二) 生物素标记DNA片段作为将与抗体偶联的报告DNA片段，应确保在待 测抗原来源的机体DNA中无同源序列，如可选用大肠杆菌的序列作为报告DNA去检测人源的标 本
5、DNA片段大小为300~500bp，生物素标记可采用PCR方法，根据报告DNA的核苷酸序列合成 一对引物，其中一个引物的5′端碱基上带有生物素标记。 1在05ml PCR管中将下列试剂混合： [HJ*2] 试剂添加量终浓度 10× PCR缓冲液10μl1× [BHDW]25mmol/L 4dNTP混合物8μl02mmol/L [BH]50μmol/L生物素标记的上游引物1μl05μmol/L [BH]50μmol/L下游引物1μl05μmol/L [BH]15mmol/L MgCl２1μl15mmol/L [BH]模板DNA1μl<1μg [BH]
6、Taq DNA聚合酶1μl5U [BH]加H２O至100μl [HJ1] [HJ] 2混匀后上面覆盖液体石蜡。 3 95℃加热5min，然后在PCR仪上按下列程序扩增：94℃ 1min；55℃ 1min；72℃ 1min； 40个循环。最后72℃延伸10min。 4加等量酚氯仿抽提，然后加10μl 3mol/L KAc,250μl无水乙醇，置-70℃ 30min。 5离心沉淀DNA片段，用70%乙醇洗一次。 6将沉淀干燥后重溶于TE缓冲液，保存在-20℃。 (三) 制备抗体亲和素DNA复合物将生物素标记的抗体与亲和素按等分 子浓度混合
7、于含有1mg/ml BSA的PBS中，室温孵育30min，再加入两倍分子浓度的生物素标记 的DNA片段，继续孵育30min，最后加入10倍分子浓度的生物素，将亲和素分子上的结合部位 饱和。最后过凝胶过滤柱将复合物与未结合的单体分开，加BSA达1mg/ml，分装后冻存于-20 ℃。 (四) 免疫PCR 1按常规ELISA方法，用包被缓冲液稀释抗原，加到96孔塑料板或05ml PCR管中，4℃过 夜。 2用PBS洗三次，然后每孔加200μl封闭液(PBS含10mg/ml BSA,1mg/ml鱼精DNA)，室温孵育 3min。 3用TETBS(其配方：20
8、mmol/L TrisHCl pH值74，015mol/L NaCl,01% Tween 20, 01mmol/L EDTA,002% NaN３)洗三次。 4将抗体亲和素DNA复合物稀释于含有1mg/ml BSA和01mg/ml鱼精DNA的TETBS中，每 孔加50μl，室温孵育1h。 5用TETBS洗5次，然后将塑料板或管倒置在吸水纸上拍打以控干水分。 6每管中加50μl PCR反应液，含有下列成分： [HJ*2] 试剂添加量终浓度 10× PCR缓冲液5μl1× 2.5mmol/L4dNTP混合物4μl0.2mmol
9、/L 50μmol/L上游引物0.5μl0.5μmol/L 50μmol/L下游引物0.5μl0.5μmol/L 15mmol/LMgCl２5μl1.5mmol/L Taq DNA聚合酶0.5μl2.5U 加H２O至50μl [HJ1] [HJ] 7混匀后，上面覆盖液体石蜡。 8 95℃加热5min，然后在PCR仪上按下列程序扩增35个循环：94℃ 1min，55℃ 1min，72 ℃ 1min。最后72℃延伸10min。 9每管取5μl作琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色后观察结果，如在PCR时加入 了放射性核素标记，则可用X光片显
10、影。 亦可在凝胶电泳后做southernblot，用特异性探针杂交，进一步提高其特异性和敏感性 。 三、 注 意 事 项 本实验的关键步骤是获得适当的抗体DNA复合物。用链亲和素将生物素标记 的抗体与生物素标记的DNA偶联的方法，因每个链亲和素分子可与四个生物素分子结合，因 此要优化反应条件，以使得每个链亲和素分子既能结合上抗体分子，又能结合上DNA片段。 此外还可用化学方法将DNA片段与抗体分子共价偶联，即将抗体分子和5′端氨基修饰的DNA 片段分别用不同的双功能偶联剂激活，然后通过自发的反应偶联到一起，比如，用NS uccinimid
11、ylSacetyl thioacetate(SATA)活化氨基修饰的DNA片段，用SulfoSucc inimidyl 4(maleimidomethyl) Cyclohexane1Carboxylate(SulfoSMCC)修饰抗体分 子，然后将二者在一小管中混合，通过加入盐酸胲(Hydroxylamine hydrochloride)使二者 偶联在一起。 免疫PCR具有高度敏感性。因此，抗体和标记DNA的任何非特异性结合均会导致严重的本底问 题。因而在加入抗体和标记DNA后必须尽可能彻底地清洗。即使有些特异性结合的抗体或标 记DNA被洗掉了，亦可在
12、最后通过增加PCR的循环次数得到弥补。此外，应用有效的封闭剂对 防止非特异性结合也是非常重要的。可用脱脂奶粉和牛血清白蛋白做蛋白封闭剂，用鱼精DN A做核酸封闭剂。防止本底信号的另一个重要因素是控制污染，这也是所有敏感的检测系统 存在的问题。即使每一步试验都做得非常认真，重复使用同样的引物和标记DNA均会产生假 阳性信号。免疫PCR的一个主要优点是标记DNA序列完全是人为选定。因此标记DNA及其引物 可经常变换，以避免由于污染造成的假阳性信号。 免疫PCR可以检测到常规免疫学方法无法检测的样品。因此，应用免疫PCR可在微观水平(单 细胞)检测到抗原，定量PCR产物可
13、以估计某一标本中的抗原数量，在临床诊断中可在疾病早 期抗原量很低时检测到微量的抗原。 ［附］PCRELISA 一、原理 PCRELISA是用免疫学方法检测PCR产物，这比常规用电泳方法及Southernblot要简便、 省时，可同时处理大量标本，便于自动化。 PCRELISA的原理是在做PCR扩增时应用生物素(biotin)标记的引物，这样PCR的产物就可结 合到亲和素(avidin)包被的塑料板上，再用地高辛标记的探针与PCR产物杂交，然后就可以 用抗地高辛的酶联反应检测。 二、材料、方法和结果 1PCR扩增按基
14、本PCR技术做DNA扩增，只是所用的引物至少有一个是5′端用生物素标记 的。通常可在DNA合成仪上直接合成5′端带生物素标记的引物。 2地高辛标记的探针杂交将地高辛标记的DNA探针01μg稀释于90μl 50mmol/L Tris H Cl,pH值83,80mmol/L KCl中。取10μl PCR产物加到管中，加热至90℃，缓慢冷却至67℃ 。离心1s，置52℃水浴保温1h。 3将杂交产物固定到塑料板上①可用商品供应的亲和素包被的酶标板，亦可用普通酶标 板按常规方法将亲和素包被上；②每孔加100μl封闭液(含10mg/ml BSA,1mg/ml鱼精DNA
15、的PB S)，室温1h；③PBST洗3次；④将地高辛探针杂交的PCR产物直接加到酶标板上，室温孵 育1h；⑤PBST洗3次。 4ELISA检测①将抗地高辛抗体稀释于PBS中，每孔加100μl，室温孵育1h；②PBST洗 3次；③将酶标的第二抗体稀释于PBS中，每孔加100μl，室温孵育1h；④PBST洗3次；⑤ 每孔加100μl酶底物，在颜色适合后终止反应；⑥在酶标仪上读结果。 三、注意事项 本法的敏感性可与放射性同位素标记相比，但又避免了同位素的危险。做大量样品时，应统 一配制反应液，再小心地分装到各反应管中，以免污染，并使各管条件一致。非特异性
16、反应 常由于地高辛标记的DNA探针与酶标板直接结合所致，因此在封闭液中一定要包括足量的鱼 精DNA。 相关帮助 需要相关抗体试剂的可以访问Fantibody全球抗体搜索引擎 fantibody全球抗体搜索引擎是一个供公共检索的抗体数据库，其抗体信息数据来源于全球范围的研究机构与商业公司。该引擎由商品化抗体数据库与抗体应用评价数据库两部分组成，以帮助研究者更高效的寻找并评估该抗体的性能。全球抗体搜索引擎是继基因与蛋白数据库之后更为复杂的应用型检索平台，网址： 需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生网进行咨询，期待您的加入：
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