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软骨细胞培养及其调控实验
自从1965年chestman和Smith首先开始软骨细胞体外培养用于软骨缺损修复的研究以来 ［1］，人们开始对关节软骨损伤不能通过自身的软骨增殖修复的概念有了新的认识。 实验证明不仅年幼且年老的关节软骨标本仍可在体外培养出新生透明软骨［2］。虽 然软骨细胞增殖能力有限，其质与量直接影响体外培养扩增效果，软骨细胞生长环境不同所 表现出的生物学特性也有差别。软骨细胞在悬浮培养或半固体琼脂培养基中生长良好并保持 表型稳定，在培养瓶底水凝胶覆盖的四维培养环境中长期培养时软骨细胞可形成结节结构其 细胞形态胞外基质分泌和软骨特异性基因表达皆与关节软骨相似。软骨细胞的生长密度对其 生长也至关重要。在同样的条件下体外单层培养时，由于细胞密度不同，软骨细胞的生长分 裂经过和形态功能完全不同。组织学检查表明，细胞形态不同，其碱性磷酸酶活性、细胞分 泌特异性基质的功能及对细胞作用因子的反应也不同，进一步研究表明，软骨细胞靠自分泌 或旁分泌信号的方式而存活。

1细胞因子对体外培养软骨细胞的影响

软骨细胞的有限增殖性及存活密度的要求是限制软骨细胞单层培养修复关节软骨缺损及体外 大量扩增的因素之一，随着细胞生物学的发展，软骨细胞体外培养特异基因表达的研究日益 深入，细胞因子参与调节软骨细胞的增殖、分化过程渐被人们所揭示，这对软骨细胞体外培 养研究又提出了一个新方向近年来，关于细胞因子等多肽蛋白质对软骨细胞体外增殖分化 等的影响研究也较多。也有些学者发现软骨细胞内含许多细胞因子及其受体，且表明许多细 胞因子通过自分泌或旁分泌两种基本方式来调节软骨细胞。目前认为促进软骨细胞增殖和基 质合成代谢的细胞因子有：IGFs.TGF-βs.PDGF,FGF.EGF，对软骨细胞有抑制作用的有IL- 1、IL-2、IL-7、TNF-α、IFN-γ等，现就对软骨细胞有显著调节的细胞因子分述如下 ：
1.1转化生长因子beta(TGF-β)
TGF-β最初是由Robert等学者在1978年作为一种可诱导大鼠成纤维细胞增殖因子而描述。T GF-β可以诱导间充质细胞转化为软骨细胞。现已实验证明TGF-βs具有促进软骨细胞增 殖、调节其分化和胞外基质合成的能力［3］。F.Redni等实验证明培养兔关 节软骨细胞表达了不同的TGFβ受体且与软骨细胞生长周期功能有关，软骨细胞在S期表现了 低亲和力受体表型(kd=appiox 1100pm)然而GO/G期的软骨细胞表现了高亲和力受体。因此 ， TGF-β对软骨细胞的作用有多种受体参与。同时也有实验证明TGF-β更多的结合在GO/G1 期比S期的同步化软骨细胞，从而说明TGF-βs对软骨细胞的作用是通过 不同的途径［ 4］。也有学者证明TGF-βs在不同的条件下对成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重 作用，1-10ng/ml浓度的TGF-β可诱导大鼠胚胎肌细胞分化成软骨细胞，合成特异性的Ⅱ型 胶原和蛋白多糖，而在0.4mol/L浓度下，TGF-β可诱导大鼠颅骨成骨细胞的碱性磷酸酶 活 性，减少软骨细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖的合成［5］。同时也有实验证明TGF-β可 抑制培养兔关节软骨细胞的终末分化及钙化。TGF-β可能与多种因素如胞外基质和其它分 化调控生长因子参与对细胞的调节作用［6］。TGF-β在细胞对其它各种分化信号 的应答过程中同样也有调节作用。Wen-Ning Qi等实验证明Ⅱ型胶原能特异的调节TGF- β刺激软骨细胞合成Ⅱ型前胶原DNA和蛋白多糖，同时说明Ⅱ型胶原在TGF-β存在的条件下 调节软骨细胞特异性基因表达具有剂量依赖性(量效关系)。因此Ⅱ型胶原基因表达的变化在 TGF存在条件下受Ⅱ型胶原的调控［7，8］。体外实验证明，许多细胞因子对软骨细胞有协同或拮抗作用如TGF-βs、IGFs、FGF、BMP、 IL-1等，兔关节软骨细胞体外培养时，TGF-β对IGF的分泌作用有三种，(1)减少41KD的IG FBP；(2)增加IGF受体的结合位点；(3)下调了诱导型IGF-1受体的自身磷酸化［9］ ，从而促进软骨细胞的增殖和特异性基质的合成。也有学者认为TGF-β和IGF可以使反分化 的软骨细胞再分化诱导和持久表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖［10］。软骨细胞在传代培 养中表型的变化可能与软骨细胞自分泌IL-1有关，而TGFβ可作为一种IL-1的拮抗剂，减 少了IL-1对胞外基质的分解代谢同时也下调了IL-1受体及其金属蛋白酶的表达［1 1］。TGFβ可能通过以下两种途径拮抗IL-1的作用，(1)刺激成软骨细胞中蛋白糖抑制 剂的产生。(2)抑制软骨细胞蛋白酶的产生，因而对细胞外基质的合成有促进作用［1 2］。
1.2骨形态发生蛋白(BMP)
BMP是TGFβ的超家族成员之一，BMP-7(OP-1)是BMP家族中的一员，其对无血清培养的高密 度单层细胞和悬浮在琼脂糖中的细胞有促进生长和成熟作用，可增加其碱性磷酸酶活性和提 高mRNA和Ⅱ型胶原的合成能力。实验rhBMP(OP-1)能有效促进胚胎和成人关节软骨细胞合成 蛋白多糖和Ⅱ型胶原而Ⅰ、Ⅲ型胶原没有增加。也有实验证明OP-1对人软骨细胞特异性胶 原、蛋白多糖的促合成作用比IGF-Ⅰ、TGF-β和激活素更显著［13］。在培养软 骨细胞生长周期的不同时期，BMP的作用也不同，rhBMP调节软骨细胞增殖、分化作用依赖于 细胞的成熟状态，且静止区软骨细胞更敏感，同时对软骨细胞的自分泌也有作用［14 ］。关节软骨细胞原代培养时表达了BMP-4功能性受体。1998年Rach1,venena等实 验证明BMP2和维生素C共同作用下培养的软骨细胞没有诱导其肥大，同时BMP-2独自干预下 细胞凋亡明显少于维生素C的干预，从而说明软骨细胞向肥大软骨细胞的过度与细胞增殖数 量减少而相对高的凋亡水平有关。软骨细胞体外传代培养渐反分化为成纤维样细胞或过度为 肥大软骨细胞与细胞生存的微环境有关［15］。
1.3胰岛素样生长因子(IGFs)
IGF于1953年由salmon和Danghaday研究表明，IGFs家族由两种相关多肽组成即IGF-Ⅰ和IGF -Ⅱ。在软骨细胞表面有IGF的受体且软骨细胞能合成和分泌这种多肽。IGF-Ⅰ能与软骨细 胞膜上的受体结合也以旁分泌和自分泌的方式起作用。IGF-Ⅰ能强烈刺激软骨细胞合成Ⅱ 型胶原和蛋白多糖，IGF-Ⅰ还能刺激软骨细胞集落形成和细胞增殖，体内IGF-Ⅰ能促进骨 骺软骨生长。而IGF-Ⅱ能刺激软骨细胞DNA和RNA的合成且比IGF-Ⅰ更有效的刺激胚胎细 胞的生长。但IGF-Ⅰ对成年软骨细胞的作用强于IGF-Ⅱ，也能促进蛋白多糖的合成。软骨 细胞表面的IGF-Ⅱ的受体与IGF-Ⅰ相比，两者的结构与体外活性相似，但体内生物效应不 同。而IGF结合蛋白(IGF1BPs)它通过特异性结合IGFs而起作用，尽管目前对IGFBPs的生理功 能还不十分清楚，但它们对IGFs的调节作用是肯定的，它们通过结合IGFs减少了IGFs与其受 体的相互作用，从而降低了IGFs的活性。onley等人实验表明细胞因子可以调节IGFBPs的产 生，IGFBPs反过来调节IGF的作用，同时表明IL1α、TNF-α降低细胞对IGF-Ⅰ的反应 性可能是通过增加IGFBPs而起作用。
1.4成纤维细胞生长因子(FGFs)
FGFs最初是从牛脑垂体分离出来的一种蛋白质，后来发现它在人体组织包括骨、软骨基质中 广泛存在，且对胚胎发育及软骨修复起重要作用。体外实验发现它能促进软骨细胞的增殖、 成熟和胞外基质的合成，而bFGF是一种强大的软骨细胞有丝分裂原，它能刺激生长板中软骨 细胞蛋白多糖的合成。在成人关节软骨中它与IGF有协同作用，两者协同刺激软骨细胞有丝 分裂和蛋白多糖的合成，抑制软骨细胞分化为肥大表型。1.5白介素和肿瘤坏死因子(IL、TNF)
近来报道IL-1对关节软骨细胞代谢的干预作用主要表现为抑制透明软骨特征性Ⅱ、Ⅳ型胶 原的合成，而促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成使软骨细胞变性，抑制软骨细胞增殖和蛋白多糖的合 成同时IL-1对关节软骨的降解作用主要表现在促进软骨细胞合成和分泌金属蛋白酶，并提 高软骨基质中溶解蛋白分子酶类的活性。TNF是通过IL-1而抑制Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成 ，但其作用远弱于IL-1。

2力学刺激对培养软骨细胞的影响

关节软骨主要由软骨细胞和胞外基质组成，而胞外基质主要包括胶原和蛋白多糖，其中Ⅱ型 胶原占胶原的95%，聚合素是蛋白多糖的主要成分，关节运动时软骨经历循环应力载荷而发 生周期性变形和恢复，循环载荷是软骨细胞执行正常功能和维持胞外基质正常表型的基本因 素。而体外培养软骨细胞其随传代次数增加而发生代谢、表型的变化伴有Ⅱ、Ⅳ型胶原合成 减少，Ⅰ、Ⅲ型胶原合成增加和蛋白多糖分子量的改变，为维持体外培养软骨细胞的正常形 态和功能则许多学者进行了软骨细胞培养的力学刺激实验研究。这种压力可分为两种：一种 是持续静压力，一种是循环动压力，力学刺激对调控软骨代谢和维持其胞外基质正常表型起 重要作用，其中静压力刺激减少了Ⅱ胶原和蛋白多糖的合成，而正常动压力刺激则促进Ⅱ型 胶 原和蛋白多糖的合成［16，17］，K.Koarninnta［18］实验表明持 续高流体静压力抑制蛋白多糖的合成和分泌，减少了聚合素mRNA的表达，改变了高尔基氏器 的形态和抑制微丝的组成。在循环压力作用下软骨组织内4种物理特性发生变化；①静水压 ；②毛细液流；③流能；④组织与细胞变形。低频循环压力促进基质降解而高频循环压力则 促进软骨细胞合成代谢。所以力学刺激是软骨细胞的一个重要调节者，但软骨细胞又如何接 受力学刺激信号呢自从认识软骨细胞可以分泌整合素以来，整合素就在软骨细胞与胞外基 质信号转导方面起着重要作用。整合素是一种异二聚体(α、β)转膜糖蛋白特异性受体，力 学刺激使胞外基质与整合素结合同时与细胞骨架相连，从而影响着基因表达和调控细胞生长 和分化［19，20］。力学刺激促进胶原合成增加同时整合素合成也上调，力学刺激 增加了α2整事素亚单位mRNA表达。实验表明在软骨细胞培养一周后，给予循环压力刺激 15次/min，结果3h后，循环压力促进了Ⅱ型胶原和聚合素mRNA的表达，从而说明胞外基 质 调节整合素来应答力学刺激。α2 β1整合素是Ⅱ型胶原受体。软骨基质受体作为一 种 应力感受器在软骨基质网络中通过力学刺激信号来调控软骨细胞。周期性力学刺激促进基质 合成，而静压力则促进基质合成减少［21，22］，所以力学刺激信号可能通过力学 刺激、细胞外基质、整合素、细胞骨架(肌动蛋白)而调控软骨细胞的增殖和分化功能。Taka haki-k［23］等实验证鞒咚降木菜褂盏糏L－6和TNF-α mRNA表达增加 而缩减了蛋白多糖核心蛋白的表达，生理水平的静水压则增加了蛋白多糖核心蛋白的表达， 组织与细胞变形可兴奋ECM受体［24］细胞膜张力受体、细胞网架结构［25 ］而促进合成功能，总之，机构压力对培养软骨细胞的作用在有效范围内与压力值无关， 而与压缩程度(静压力)和频率(循环压力)有关，持续的静压力抑制软骨细胞的合成代谢，一 定频率的循环压力则促进软骨细胞的合成功能［26］。3其它因素对培养软骨细胞的影响

体外培养软骨细胞随其传代而表型整个发生改变，正常的Ⅱ、Ⅳ型胶原合成减少，Ⅰ、Ⅲ 型胶原合成增加，在不同的培养条件下(如培养基、PH细胞的接种密度、血清浓度、氧分压 及其培养基的离子浓度、培养方式)其表型不同，有时可以反分化或向肥大软骨细胞转化。 体外培养只有保持其正常形态才能保持其正常功能。Freed［27］等将软骨细胞移 植于DGA、PLA进行三维体外培养，证明三维培养6周后其细胞数扩增了近8.3倍，且传代后细 胞产生蛋白多糖和Ⅱ型胶原的能力较佳，所以软骨细胞三维培养有利于维持其形状，常利用 胶原纤维蛋白、琼脂、海澡酸盐、PGA、PLA等为附属物进行三维培养。也有学者认为无血清 培养可以阻止软骨细胞反分化。培养基PH值轻度偏碱不利于蛋白多糖的合成，偏酸则相反。 低钙环境有利于软骨细胞的稳定［28］。1995年Baragi［29］等将IL - Rα和标记基因LacZ分别构建在腺病毒上转染软骨细胞并将它们分别与骨关节炎软骨组织块 一起培养，结果表明与IL-1Rα转染软骨细胞培养的组织块能抵制IL-1β的作用而与LacZ 细胞培养的软骨细胞块抵制作用明显减弱，从而说明基因转染可以用来调控软骨细胞从而维 持其表型。

4结束语

体外培养软骨细胞的优点是可以大量扩增及研究其生命活动的状况，但要维持其正常表型则 受到众多复杂因素的调控。就其细胞因子而言，细胞因子对体外培养软骨细胞的作用非单一 的，而是一个复杂的网络调节作用，如生长因子的生物学活性是由受体介导的，生长因子在 软骨细胞合成分泌后，多为无活性的前体分子需要经过特异性的激活才能发挥作用。生长因 子之间存在基因表达及其活性的相互调控TGF-β能促进PDGF的A链和B链的mRNA表达和分泌 ［30］。bFGF能促进TGF-β mRNA的表达，诱导间充质细胞分化成软骨细胞，增强 TGF对软骨细胞的增殖及其基质合成作用。生长因子之间还存在受体水平的调控，胰岛素不 影响TGF-Ⅱ型受体的亲和力但增加了Ⅱ型受体的数目引起受体上调效应，从而Ⅱ型受体与 Ⅰ型受体竞争，使胰岛素与Ⅰ型受体结合减少。IL-1可使TNF受体下调，而IFN-γ却使TNF 受体上调等。但是网络生长因子如何调控体外培养软骨细胞的增殖、分化阻滞反分化或向肥 大型转化、维持其正常软骨细胞表型及合成特异性胞外基质还需进一步的研究。总之软骨细 胞体外培养维持其正常表型则受到众多因素的影响如培养条件及其方式，细胞的微环境，PH 值、细胞密度、力学变化、生长因子等等。随着细胞生物学和分子生物学的发展，软骨细胞 体外培养大量扩增、分化维持其正常的表型及代谢的调控因素会渐为人们所明晰，为组织工 程化软骨修复软骨缺损、体外培养软骨细胞建立软骨细胞库(永生化软骨细胞)及揭示退变性 骨关节病又开拓了一条新的途径。

参考文献：[略]

软骨细胞培养中II型胶原酶配制方法及使用
配制方法:0.2%Ⅱ型胶原酶;称200mgⅡ型胶原酶,先溶解于少量D-Hank＇s液中,充分溶解后,稀释到100ml;用0.22微米孔径滤膜过滤除菌,分装小瓶于-20℃保存备用.

使用方法: 无菌条件下,切取动物软骨组织剪碎为1立方毫米大小;加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴消化15~20分钟;离心10分钟(1000转/分),弃去胰酶再 换成0.2%Ⅱ型胶原酶37℃水浴消化30分钟至2小时,期间每15分钟混匀一次或者不停搅拌(用磁力搅拌器)至液体浑浊为止,加胎牛血清数滴终止消化, 加1640培养液5~10ml混匀;用100目金属网过滤,滤液离心10分钟(1000转/分),弃去上清夜,再加含10%胎牛血清1640培养液5ml 放入培养瓶进行孵育培养.