超高效液相色谱-串联质谱法同时测定人血清中4种硝基呋喃类代谢物.pdf

卫生检验与实验研究566JiangsuJPrevMedVol.34,No.5江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期超高效液相色谱-串联质谱法同时测定人血清中4种硝基呋喃类代谢物曹杰，王强”，孔凡”，宋寅生，张春玲，徐虹1.镇江市疾病预防控制中心，江苏镇江2 12 0 0 4；2.江苏大学医学院摘要：目的建立超高效液相色谱-串联质谱法，同时测定人血清中3-氨基-2-嗯唑烷基酮（AOZ）、5-甲基吗啉-3-氨基-2-嗯唑烷基酮（AMOZ）、氨基脲（SEM）、1-氨基-2-内酰脲（AHD)4种硝基呋喃类代谢物浓度。方法在酸性条件下,4种硝基呋喃类代谢物水解、衍生，经乙酸乙酯提取净化，在色谱柱WatersBEHC18（2.1mm10 0 mm，1.7 m）上分离，以流动相甲醇-2mmol/L乙酸铵体系进行梯度洗脱。采用电喷雾离子源正离子扫描和多反应监测模式检测，定量方法为同位素内标法。结果AOZ在质量浓度范围2.8 8 4ng/mL、A M O Z在质量浓度范围2.4 7 2 ng/mL、A H D 在质量浓度范围5.4 16 3ng/mL、SEM在质量浓度范围2.2 6 6 ng/mL内线性关系良好，相关系数r均 0.998,检出限分别为0.5、0.5、2.7、1.1ng/mL；低、中、高质量浓度的回收率为7 3.8%10 6.7%，相对标准偏差（RSD）为2.7%13.1%，精密度良好。血清样品短期稳定性良好。结论该方法灵敏、准确、稳定，可用于人血清中4种硝基呋喃代谢物AOZ、A M O Z、A H D、SEM 的同时检测。关键词：超高效液相色谱；质谱法；硝基呋喃类代谢物中图分类号：R113文献标识码：B文章编号：10 0 6-90 7 0(2 0 2 3)0 5-0 56 6-0 4硝基呋喃类药物是人工合成的广谱抗生素，主要含有呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因等。因其价格低廉、抗菌消炎疗效较好被广泛地应用于临床治疗，也常用于预防与治疗家畜和水产动物的细菌性疾病。但因其致畸、致癌、致突变等严重副作用，目前很多国家已明确限制应用，并规定动物组织内禁止检出硝基喃类残留。硝基呋喃类药物呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃它酮的代谢物分别为3-氨基-2-嗯唑烷基酮（AOZ）、5-甲基吗啉-3-氨基-2-嗯唑烷基酮（A M O Z）、氨基脲（SEM）、1-氨基-2-内酰脲（AHD）。该类代谢物残留的检测方法有多种 ,如高效液相色谱法2 、超高效液相色谱法3、液相色谱-串联质谱法4-6 、超高效液相色谱-串联质谱法7 和免疫层析技术8 等。大多检测的是兽药、动物源性食品或者水产品中硝基呋喃类代谢物残留4-6 ，人生物样本中的报道较少。超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）9-1 因其高效、灵敏、准确等的优势被广泛应用。本实验建立同时测定人血清中4种硝基呋喃类代谢物的超高效液相色谱-串联质谱法。1材料与方法1.1仪器与试剂AB SCIEXQTRAP?4500质谱仪（A BSCIEX），A g i l e n t 12 90 超高效液相色谱仪（AgilentTechnologies），Vo r t e x-K y l i n-Be l l 5型漩涡振荡器（Sci-entific Industries）,N-EVA P111氮吹仪（OrganomationAssociatesJnc.）等。标准品：3-氨基-2-嗯唑烷基酮（10 m g，纯度99.1%）;5-甲基吗啉-3-氨基-2-嗯唑烷基酮（10 mg，纯度99.5%）、氨基脲（10 0 mg，纯度99.0%）、1-氨基-2-内酰脲（10 0 mg，纯度99.0%）。同位素内标：AOZ-D4（10 mg，纯度99.5%）、AMOZ-D，（10mg，纯度99.1%），北京曼哈顿生物技术公司；SCA-HCl（10 mg,纯度99.1%）、AHD-13C,（10 mg，纯度99.9%）。甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色谱纯，美国MERK公司），乙酸铵、二甲亚矾、氨水（优级纯，国药集团化学试剂有限公司），正已烷（色谱纯，TEDIA公司），实验用水为超纯水。衍生化试剂（0.0 5mol/L）：称取一定量的邻硝基苯甲醛溶于二甲亚矾中，冷藏保存。1.2标准溶液配制精密称取AOZ、A M O Z、SEM、AHD标准品，甲醇溶解，配制成质量浓度分别为140、120、110、136 g/mL的标准储备溶液，于-2 0 保存备用。精密称取AMOZ-Ds、A O Z-D 4、SCA-H CL、A H D-13C，同位素内标溶液，甲醇溶解，配制成质量浓度分别为117、131、12 3、95g/mL的同位素内标储备液，于-20保存。混合标准使用溶液：准确吸取适量D01:10.13668/j.issn.1006-9070.2023.05.015基金项目：江苏大学大学生创新训练项目（2 0 2 310 2 992 7 7 H）作者简介：曹杰（198 3一），女，山东菏泽人，副主任医师，主要从事食品卫生与环境卫生检验工作通信作者：徐虹，主任技师，E-mail：js z jx h s in a.c o m567JiangsuJPrevMeVol.34,No.5江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期AOZ、A M O Z、SEM、A H D 储备溶液，用乙定量稀释，制成质量浓度为140、12 0、110、2 7 2 ng/mL的混合标准使用液，于4储存。同位素混合内标溶液：准确吸取适量AMOZ-Ds、A O Z-D 4、SCA-H CL、A H D-13C,储备溶液，用乙腈定量稀释，制备成质量浓度分别为117、131、12 3、19 0 n g/m L 的混合内标溶液，储存于4冰箱。1.3仪器工作条件1.3.1色谱条件色谱柱为WatersBEHCis柱：2.1mmx100mm,1.7m,柱温：40。流动相：水相A为2 mmol/L乙酸铵溶液，有机相B为甲醇,线性梯度洗脱程序：0 1.0 min时，B为10%;1.0 3.0 min时，B由10%升至9 0%,保持1.0 min;4.04.5min时,B由9 0%降至10%，保持2.5min。流速0.3mL/min，进样量为10L。1.3.2质谱条件电喷雾离子源正离子扫描，多反应监测模式；电喷雾电压为550 0 V；离子源温度为550；碰撞气选择Medium；气帘气压力为30 psi，雾化气压力为50 psi,辅助加热气压力为6 0 psi。见表1。表1目标化合物的质谱参数离子对质荷比去簇电压碰撞能量化合物(m/z)(DP)/V(CE)/eVAOZ236.1/134.0*7017236.1/104.07026AMOZ335.0/291.1*8016335.0/262.18022SEM209.1/192.060143 209.1/166.0*6013AHD249.1/134.9*7030249.1/104.87038AOZ-D4240.1/134.0*7017AMOZ-Ds340.2/296.1*7016SCA-HCL212.1/168.1*6013AHD-13C3252.2/133.9*7016注：*为定量离子对。1.4检测方法1.4.1血清样品前处理取-2 0 保存的血清样品，室温自然解冻后，吸取1.0 mL于50 mL塑料离心管中，加入同位素混合内标溶液10 0 L，轻轻振荡混匀30 s，依次加人5.0 mL0.2mol/L盐酸溶液和2 0 0 L0.05mol/L衍生化试剂12 ,涡旋振荡混匀30 s,置摇床振荡30min，于37 电热鼓风干燥箱中衍生化16 h。衍生化完毕后冷却至室温，加入4 6 mL1mol/L的磷酸氢二钠溶液调节pH值至7.0 7.5再加入5mL乙酸乙酯12 ,振荡混匀6 0 s,10000r/min低温离心5min（离心半径119 mm），取出上层乙酸乙酯，备用；再加乙酸乙酯5mL重复提取1次，将2 次乙酸乙酯层合并，氮吹近干。加入1mL乙腈水（1:9）复溶，涡旋30 s,加人正已烷2 mL,轻轻涡旋30 s，10 0 0 0 r/m in 低温离心5min（离心半径119 mm），取下层溶液经0.2 2 m有机滤膜过滤，上机进行仪器分析。1.4.2扫描化合物离子对分别吸取硝基呋喃代谢物储备液（AOZ、A M O Z、SEM、A H D 标准品及同位素内标）各10 0 L于50 mL塑料离心管中，经衍生化、提取、净化、氮吹近干（方法同前处理），最后加人1mL甲醇复溶，涡旋振荡30 s，用0.2 2 m有机滤膜过滤，上机扫描各化合物的母离子和子离子，优化质谱参数。1.4.3制备空白血清基质标准工作曲线溶液准确吸取2 0、50、10 0、2 0 0、40 0、6 0 0 L混标使用液，各加人1mL空白血清，制成血清样品浓度系列，质量浓度AOZ的分别为2.8、7.0、14、2 8、56、8 4ng/mL，A M O Z分别为2.4、6.0、12、2 4、48、7 2 ng/mL,SEM分别为2.2、5.5、11、2 2、44、6 6 n g/mL,A H D 分别为5.4、13.6、27.2、54.4、10 9、16 3n g/m L，按照1.4.1操作，制成空白血清基质标准工作曲线系列溶液1.4.4丝结果计算根据仪器自动绘制的空白血清基质标准工作曲线，算出血清样品中4种硝基呋喃类代谢物的含量(ng/mL)。2结果2.1标准物质的色谱图4种硝基呋喃代谢物及其同位素内标的多反应监测色谱图见图1和图2。图1为4种同位素内标在空白人血清中的色谱图（AMOZ-Ds、AHD-13C3、A O Z-D.和SCA-HCL质量浓度分别为11.7、19.0、13.1、12.3n g/mL）。图2 为空白血清基质标准工作曲线溶液某浓度点的色谱图，AMOZ、A H D、A O Z、SEM质量浓度分别为48、10 9、56、44ng/mL。2.2标准曲线和检出限艮在上述色谱质谱条件下，测定空白血清基质标准工作溶液，结果AOZ在质量浓度范围2.8 8 4ng/mL、A M O Z在质量浓度范围2.472ng/mL、A H D 在质量浓度范围5.4 16 3ng/mL、SEM在质量浓度范围2.2 6 6 ng/mL内线性关系良好，相关系数均 0.9 9 8，检出限分别为0.5、0.5、2.7、1.1 n g/m L。见表2。2.3回回收试验和准确度使用空白血清样品，精密配制含4种硝基呋喃类代谢物的低、中、高3种浓度血清样品（质量控制样品）各5份，按照前处理方法操作后,重复测定6 次。4种硝基喃类代谢物低、中、高质量浓度的回收率为7 3.8 10 6.7%，相对标准偏差（RSD）为2.7%13.1%，精密度良好，见表3。568JiangsuJPrevMedVol.34,No.5江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期3.691.00 x105AMOZ-D55.00104000.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5保留时间(min)3.462.0 x104AHD-13C31.0 x10400.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5保留时间(min)3.535.01044.01842.89AOZ-D42.0 x1040400.51.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5保留时间(min)3.552.0104SCA-HCL1.0 x1043.30000.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5保留时间(min)图14种同位素内标在空白人血清中的色谱图3.704.8x18AMOZ2.0 x104000.51.01.52.02.53.0 3.5 4.04.55.05.56.0 6.5保留时间(min)3x184.39AHD1.0 xi043.454.03000.5 1.0 1.5 2.0 2.5.3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5保留时间(min)2:8x183.541.0 x1053.22AOZ000.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5保留时间(min)(3.555-8882000SEM000.51.01.52.02.53.0 3.54.04.55.0 5.5 6.06.5保留时间(min)图24种硝基呋喃代谢物在空白人血清中的色谱图表2 4种硝基喃代谢物线性回归方程、相关系数、检出限和定量限保留时间线性范围相关系数检出限定量限化合物线性回归方程(min)(ng/mL)()(ng/mL)(ng/mL)AOZ3.542.884y=1.2300 x+0.08400.999 60.51.0AMOZ3.702.472y=0.803 0 x+0.018 60.99930.51.0AHD3.455.4 163y=0.0205x+0.00710.999 22.75.4SEM3.552.2 66y=0.047 6 x+0.053 30.998 81.12.2表3LC-MS/MS测定人血清中4种硝基呋喃类代谢物的方法回收率(n=5)加标量测得值回收率RSD化合物(ng/mL)(ng/mL)(%）（%）13.613.095.55.7AHD54.455.2101.611.8163.0164.2100.913.16.05.694.04.2AMOZ24.023.296.84.372.064.489.42.77.06.999.212.7AOZ28.029.9106.711.184.080.095.4.7.65.54.582.612.1SEM22.016.273.811.566.051.077.210.52.4精密度试验在相同色谱条件下，连续5天对4种硝基呋喃类代谢物血清样品重复测定5次。结果显示，4种硝基呋喃类代谢物日间RSD为4.4%10.3%。见表4。2.5方法的稳定性精密配制中、高两种浓度的4种硝基喃类代谢物血清样品各3份，考察短期稳定性试验，于液相色谱仪样品池放置4天。结果表明，4种硝基喃类代谢物血清样品测定值RSD在2.2%12.9%。见表5。表4LC-MS/MS测定人血清中4种硝基呋喃类代谢物的精密度（n=5)化合物测得值(ng/mL)平均值(ng/mL)RSD(%)AHD45.256.249.054.444.949.910.3AMOZ24.422.322.9 23.1 24.723.44.4AOZ25.826.828.128.629.427.75.1SEM20.417.318.5 17.7 17.618.36.8表5LC-MS/MS测定人血清中4种硝基呋喃类代谢物的稳定性（n=3）低浓度高浓度化合物样品实测RSD样品实测RSD(ng/mL)(ng/mL)(%）(ng/mL)(ng/mL)(%）AHD54.456.83.0163163.312.9AMOZ24.023.83.372.064.93.4AOZ28.030.24.484.082.83.7SEM22.015.62.266.054.07.42.6实际样品检测随机采集健康成人血样2 0 份，按照本文方法测定其血清中AOZ、A M O Z、SEM 和AHD残留含量，检测结果均低于该方法检出限3结论本实验建立了测定人血清中4种硝基呋喃类代谢物浓度的UPLC-MS/MS分析方法，实验结果表明该方法灵敏、准确、稳定性良好，符合生物样本测定的技术规范要求，可用于人血清中4种硝基呋喃类代谢物的残留测定，为人群暴露监测提供技术方法。（下转第57 5页）编辑：周羚上接第56 8 页）编辑：周羚575Jiangsu J Prev MedVol.34,No.5江苏预防医学2 0 2 3年9 月第34卷第5期2.3.4样品测定收集随机人群全血样品12 0 份，按照本方法进行测定。尼古丁检测出2 0 份，检出率为16.70%，检出值范围是0.13 8 8.6 7 ng/mL；可替宁检测出2 8 份，检出率为2 3.3%，检出值范围是0.17 1083.75ng/mL,与文献报道基本一致8-9 。尼古丁和可替宁在血清中可以单独或同时存在，2 种成分同时都检出的有11份，检出值 10 ng/mL的均为男性,这与吸烟者男性居多的现实吻合2 0 。由于收集的血样为随机血样，未收集吸烟相关信息，仅有性别和年龄信息，仅能得到初步结论。3结论本文建立了一种快速、高效测定血清中尼古丁和可替宁的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，前处理采用先沉淀蛋白再直接通过CaptivaEMR-Lipid小柱的方法，脂质等被截留，不需洗脱，加压直接得到目标物质，净化效果良好，方法验证结果证明此方法准确、稳定。参考文献1范茂林，杨旭东，艾雨，等.尿液中尼古丁和可替宁QuEChERS预处理气相色谱测定法建立J.中国公共卫生，2 0 17,33（2）：333-337.2Bramer SL,KallungalBA.Clinical considerations in study designs thatuse cotinine as a biomarker J.Biomarkers,2003,8(3-4):187-203.3李晶，梁梦洁，刘欣，等.超高效液相色谱-串联质谱法快速测定吸烟者尿液中尼古丁和可替宁J.理化检验-化学分册，2 0 19,55(11):1287-1291.4王俊，宋瑞金.人体内可替宁检测技术研究进展J.环境与健康杂志,2 0 0 8,2 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