蚕蛹虫草栽培方法优化试验.pdf

第 42 卷第 4 期王彤等：美味牛肝菌药用价值及产品开发现状DOI：10.13629/ki.53-1054.2023.04.014中国食用菌圆园23，42（4）：8588耘阅陨月蕴耘 云哉晕郧陨 韵云 悦匀陨晕粤悦晕缘猿原员园缘源/匝陨杂杂晕 员园园猿原愿猿员园蚕蛹虫草栽培方法优化试验*李海洲1，陈正余1，王小平1，孙新涛2，贺才厚1（1.安康市蚕桑产业发展中心，陕西 安康 725000；2.西北农林科技大学，陕西 杨凌 712100）摘要：不同菌种、培养基配方、接种方法对蛹虫草人工栽培的影响不同。对蚕蛹虫草菌种、培养基配方、接种方法三因素进行优化，以接种后蚕蛹感菌率、出草整齐程度、转色情况等为评价指标进行试验。通过菌株活性检测，筛选出性状稳定的蚕蛹虫草菌种；通过液体菌种培养基配方筛选试验，筛选出发菌快的液体菌种培养基配方；分别采用喷洒、浸泡、注射的方式接种蚕蛹虫草液体菌种，筛选出最优接种方法为注射。关键词：蚕蛹虫草；培养基；接种方法中图分类号：S646.9文献标志码：A文章编号：1003-8310（2023）04-0085-04Optimization Experiment of Cordyceps militaris CultivationLI Hai-zhou1,CHEN Zheng-yu1,WANG Xiao-ping1,SUN Xin-tao2,HE Cai-hou1(1.Ankang Sericulture Industry Development Center,Ankang 725000,China;2.Northwest Agriculture and Forestry University,Yangling 712100,China)Abstract:The effects of strains,culture medium formulas and inoculation methods on the cultivation of Cordyceps militaris aredifferen.Three factors of C.militaris strains,culture medium formulas and inoculation methods were optimizeds.The infectionrate,degree of uniformity of budding,condition of color transformation were used as evaluation indicators to carry out the ex原periment.Selecting stable strains of C.militaris through strain activity screening test;through the screening test of liquid spawnculture medium formulas,select the liquid spawn culture medium formula with fast mycelium grouth rate;spray,soak,and injectliquid strains of C.militaris separately,and select the injection inoculation method as the optimal inoculation method.Key words:Cordyceps militaris;culture medium;inoculation method*基金项目：2024 年陕西省科技发展计划“农业领域-农业养殖”项目（S2024-YF-YBNY-0628）。作者简介：李海洲（1976），男，本科，农艺师，主要从事蚕桑资源综合开发、食品工艺研究、质量控制、产品研发方面工作。E-mail:收稿日期：2023-04-30蛹虫草(Cordyceps militaris）有特殊的营养价值，如虫草酸、虫草素、虫草多糖、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD）、硒等，故其也具有明显的药用价值1。蛹虫草的药理成分和作用与野生冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）相近，都能提高机体免疫功能，明显降低血清胆固醇，还有雄性激素样作用及镇静功效，但价格仅为野生冬虫夏草的1/10，是野生冬虫夏草的理想替代品2。蛹虫草作为补益类中药，其药效成分及生物学活性研究已有几十年的历史，且应用越来越广泛3。蚕蛹虫草既可食用也可药用，并且食用方法便捷，泡酒、泡茶、煮炖均可。随着人民生活水平的提高和饮食结构的调整，蚕蛹虫草已成为人们餐桌上的美味佳肴和常用保健食品。2009 年，卫生部批准蛹虫草为新资源食品，在未来的功能性食品和保健性食品开发中具备较大潜力。近年来，因野生蚕蛹虫草资源日渐匮乏，因此人工栽培的蚕蛹虫草以良好的保健功效深受欢迎，需求量逐年上涨，使蚕蛹虫草栽培业具有更加广阔的发展空间。人工栽培蚕蛹虫草，是用蚕蛹虫草菌种浸染蛹体，菌种从蛹体内吸取养分而迅速增殖，约半个月菌丝即长满蛹体，随后蛹体僵硬最终形成僵蛹。通中国食用菌耘阅陨月蕴耘 云哉晕郧陨 韵云 悦匀陨晕粤灾燥造援 42晕燥援4过人工诱导，约 1 周即在蛹体的头、胸、腹各环节间膜处形成许多子实体原基，再经约 10 d 子实体即成熟4。虽然蚕蛹虫草的人工培养在我国已获得成功并进入产业化阶段，但生产中仍存在许多难题，较突出的就是蚕蛹虫草菌种退化的问题。因为蚕蛹虫草的生长机制及所需生态环境与一般食用菌不同，长期进行无性繁殖及多次转管的菌种，其母种基因容易变异，表现为子实体畸形甚至无法产生子实体，产量和品质均不稳定，生物转化率较低5。这给批量栽培带来极大的风险。因此获取适应性强、子实体产量高的菌种是蚕蛹虫草栽培成功的关键因素6。蚕蛹虫草生长需要的营养成分有碳、氮、矿物质元素、维生素等，不同成分和含量的营养物质对虫草的产量和品质有明显影响。营养成分配比不当会造成蚕蛹虫草子实体生长推迟，严重时甚至无法产生子实体，因此需要根据蚕蛹虫草的生长特性筛选适合的液体菌种培养基配方，保证培养基营养均衡。同时，蚕蛹虫草的寄主是活体蚕蛹，具有一定的抗菌性，选择不同的接种方法对蚕蛹感菌、僵化、转色子实体形成等的效果都有决定性作用，需要对不同接种方法进行试验，以筛选出最优的接种方法。1材料和方法1.1试验材料1.1.1蚕蛹虫草菌株菌株 1（C1）：子实体采自安康汉阴凤凰山，菌株由孢子分离获得。菌株 2（C2）：子实体采自安康汉滨双龙镇，菌株由孢子分离获得。菌株 3（C3）：菌株来自中国科学院微生物研究所，菌种编号为 3.4655。1.1.2主要试剂葡萄糖（AR）500 g，天津市北辰方正试剂厂；蔗糖（AR）500 g，天津市北辰方正试剂厂；磷酸二氢钾（AR）500 g，天津市化学试剂三厂；硫酸镁（AR）500 g，天津市北辰方正试剂厂；蛋白胨，北京鸿润宝顺科技有限公司；维生素 B1、B6，天津市光复精细化工研究所；酵母粉，北京鸿润宝顺科技有限公司；增产灵，江苏省江都市天达食用菌研究所；土豆、玉米粉、食用油、食盐，均为市售。蚕蛹粉，新鲜蚕蛹经 60 益烘干后粉碎而成；营养强化剂，每 1 000 克含酵母粉 10 g、葡萄糖 20 g、维生素 B14 片、维生素 B64 片。1.1.3液体培养基配方液体菌种培养基配方 F1：300 g 土豆去皮切片，加清水 1 000 mL 煮沸后取滤液备用；称取葡萄糖20 g、蛋白胨 2 g、磷酸二氢钾 0.5 g、硫酸镁 1 g、食盐 1 g、维生素 B115 mg，加入土豆滤出液中搅拌均匀；加入纯净水定容至 1 000 mL。将培养液分装入容积为 500 mL 的锥形瓶，每瓶约 300 mL，并加入 23 滴食用油（防止通气培养时产生泡沫），用脱脂棉封口。121 益高压灭菌 30 min，冷却到 30 益以下备用。液体菌种培养基配方 F2：称取葡萄糖 20 g、蛋白胨 10 g、玉米粉 20 g、酵母粉 5 g、磷酸二氢钾10 g、硫酸镁 0.5 g、维生素 B13 片，加纯净水定容至 1 000 mL，分装入容积为 500 mL 的锥形瓶中，每瓶约 300 mL，加入 23 滴食用油（防止通气培养时产生泡沫），用脱脂棉封口。121 益高压灭菌 30 min，冷却到 30 益以下备用。液体菌种培养基配方 F3：200 g 土豆去皮切片，加清水 1 000 mL 煮沸后取滤液备用；取蔗糖 20 g、磷酸二氢钾 3 g、硫酸镁 1.5 g、维生素 B12 片、增产灵 0.5 mg，加纯净水定容至 1 000 mL，分装入容积为 500 mL 的锥形瓶中，每瓶约 300 mL，加入 23滴食用油（防止通气培养时产生泡沫），用脱脂棉封口。121 益高压灭菌 30 min，冷却到 30 益以下备用。1.1.4主要仪器设备LDZX-30KBS 型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；HWS-160 型智能恒温恒湿箱，宁波东南仪器有限公司；YC-D205 超声波加湿器，北京亚都环保科技股份有限公司；ACS-25S 电子秤，上海衡器总厂；KB-900 智能脱色摇床，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；1810D 型自动双重纯水蒸馏器，上海申生科技有限公司；WJ-JZX 无菌接种箱，济南洁康空气净化设备厂；DHG-9075A 电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司。1.2试验方法1.2.1菌种筛选试验将野生蚕蛹虫草菌种 C1、C2，以及引入的蚕蛹虫草菌种 C3 进行活化，分别接种至 F1 配方的液体培养基中制备成液体菌种，随后进行菌株筛选试验。取 30 个蚕蛹虫草栽培罐（瓶），分为 3 组，每组 10个，每罐（瓶）包含 25 个蚕蛹。将 3 种蚕蛹虫草液86第 42 卷第 4 期王彤等：美味牛肝菌药用价值及产品开发现状体菌种以注射的方式分别接种至蚕蛹中，每个蚕蛹菌种接种量为 0.2 mL，将接种了不同菌种的试验组分别记为 C1、C2、C3。通过观察蚕蛹感染后变僵和子实体形成过程，根据相应参数及菌株活性，确定最优菌种。1.2.2液体菌种培养基配方的优化试验液体菌种的制备方法。在灭菌的接种箱内，按无菌操作的要求分别在 3 种液体培养基中接入试管母种，每瓶接入 5 mm 伊 5 mm 大小的 C3 菌种 源 块，并加入 56 粒小玻璃珠或洁净沙石（可使菌球分布更均匀）。随后将培养瓶置于转速为 80120 r min-1的摇床上，在 2225 益条件下震荡培养 57 d，待菌球直径达 0.31.0 mm 或菌球充满液体培养基时，即液体菌种制作完成。取 30 个蚕蛹虫草栽培盒，分为 3 组，每组 10个，每盒准确加入 320 g 优质大米、蚕蛹粉 2 g、营养强化剂 430 mL，聚乙烯薄膜封口，121 益高压灭菌 30 min，冷却到 30 益以下备用。将 3 种配方制备的蚕蛹虫草液体菌种分别接种到大米复合培养基中，将不同培养基配方的试验组记为 F1、F2、F3。完成接种后将栽培盒至于温度为 16 益、湿度为 65%的条件下黑暗培养 14 d。观察菌种在培养基中的生长情况，确定液体培养基的配方。1.2.3接种方法优化试验以蚕蛹为寄主，分别采用喷洒（P1）、浸泡（P2）、注射（P3）3 种方式接种优选的蚕蛹虫草液体菌种（即菌种为 C3，液体培养基配方为 F1），观察其发菌情况，确定最优接种方法。取 30 个蚕蛹虫草栽培罐（瓶），分为 3 组，每组10 个，分别采用喷洒、浸泡、注射 3 种方式接种蚕蛹，每种方法接种 10 罐（瓶），每罐（瓶）25 个，通过对比试验观察蚕蛹变僵情况，确定最优接种方法。2结果及分析2.1菌种筛选试验结果各试验组中蚕蛹蛹体变僵硬、出现白色菌丝、出现芽孢、芽孢见光转黄色、子实体形成等情况详见表 1。由表 1 可知，C1 和 C3 接种后的感菌率都在80%以上，C2 的感菌率为 78.4%；在 58 益的温差刺激后，3 个菌株形成子实体所占比率分别为78.1%、82.6%、80.3%，C1 菌株的子实体形成率低于 C2 和 C3；感光转色率分别为 93.7%、93.8%、95.7%，3 个菌株的转色率都达到 92%以上，转色好；3 个菌株在转色后子实体的生长情况均良好。综合考虑，C3 菌株接种后，感菌率、子实体形成率、转色率都达到 80%以上。C3 菌株接种后的生长情况见图 1。由图 1 所示，C3 菌株性状稳定、成功率较高，因此选择 C3 为最优的蚕蛹虫草菌种。筛选出的菌种栽培一段时间后，为防止菌种退化，必须进行分离纯化。对已经开始退化的菌种要定期进行复壮，尽可能保持菌种原有性状和活力的稳定，确保菌种不变异。2.2液体菌种培养基配方筛选试验结果各液体菌种培养基表面白色菌丝形成（感菌）情况见图 2，各配方条件下菌种在大米培养基上形成的子实体见图3。由图 2 和图 3 可知，液体菌种培养基配方 F1 具有发菌快，感菌率高的优点。配方 F1 确定为最优配方。2.3接种方法筛选试验结果接种方法筛选试验情况见图 4。转色子实体生长情况80.315695.7良好试验编号感菌变僵子实体形成C320381.2163C219678.416282.615293.8良好百分比/%个数/个百分比/%个数/个百分比/%个数/个C120582.016078.115093.7良好表 1蚕蛹虫草菌株活性对照表Tab.1Comparison table of Cordyceps militaris strains图 1C3 菌株子实体形成过程Fig.1The formation process of fruit body of C3 straina.菌丝萌发b.子座原基形成c.形成子实体李海洲等：蚕蛹虫草栽培方法优化试验87中国食用菌耘阅陨月蕴耘 云哉晕郧陨 韵云 悦匀陨晕粤灾燥造援 42晕燥援4由图 4 可知，采用喷洒及浸泡的方式接种蚕蛹，蚕蛹感菌率极低，不宜采用。注射接种法接种后蚕蛹感染变僵率较高，因此接种推荐采用注射法。3结论及讨论试验以感菌率高、子实体整齐、转色发菌快、菌丝长势好的 3 种优良菌种为对象，通过菌种生长活性对比试验，筛选出最优菌种。蚕蛹虫草人工栽培中常用的碳源有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、果胶等，其中以葡萄糖、蔗糖等小分子糖类的利用效果最好；蚕蛹虫草能利用的有机氮类很多，其中氨基酸、蛋白胨、豆饼粉、蚕蛹粉、酵母膏等利用效果最好；蚕蛹虫草所需矿物质元素以磷、钾、钙、镁等为主，加入 B 族维生素有利于蚕蛹虫草菌丝的生长和发育7。用无菌注射器吸取液体菌种进行注射接种效果最好，液体菌种接种量以 0.2 mL 为宜，全过程按无菌操作要求进行8。通过对蚕蛹虫草菌种、液体培养基配方、接种方法 3 个因素进行对比试验，以接种后蚕蛹感菌率、子实体整齐度、转色情况、菌丝长势为评价指标，筛选出感菌率、子实体形成率、转色率都达到 80%以上，性状稳定的蚕蛹虫草菌种 C3。通过液体菌种培养基配方筛选试验，筛选出发菌快的液体菌种培养基配方 F1。分别采用喷洒、浸泡、注射的方式接种蚕蛹虫草液体菌种，喷洒及浸泡方式虽然操作相对简单，但蚕蛹感菌率极低，而注射接种法接种后蚕蛹感染变僵率达到 80%以上，因此注射为最优的接种方法。参考文献：1 李海洲，孙新涛援 蛹虫草菌丝体深层发酵培养加工虫草酸奶研究J援 中国食用菌，2014，33(4)：55-56.2 廖森泰，肖更生援 蚕桑资源创新利用M援 北京：中国农业科学技术出版社，2006.3 樊慧婷，林洪生.蛹虫草化学成分及药理作用研究进展J.中国中药杂志，2013，38（15）：2549.4 徐秀华.北虫草栽培新技术M.武汉：华中科技大学出版社，2010.5 都兴范，李亚杰.北冬虫夏草的研究发展现状J援 辽宁农业科学，2003（4）：26-28.6 李海洲，陈正余.蛹虫草栽培的关键因素及发展趋势J援安康学院学报，2015，27（5）：104-106.7 李昊.虫草人工栽培技术M.北京：金盾出版社，2006.8 秦秀丽，邢力.北冬虫夏草寄主体培养关键技术研究J.北方园艺，2013（17）：157-160.（责任编辑：周汐）图 2蚕蛹虫草液体菌种培养基配方筛选试验对照图Fig.2Comparison chart for screening test of liquid spawn forCordyceps militaris图 3蛹虫草在大米培养基上形成的子实体Fig.3FruitbodyformedbyCordyoeps mtlttarts onriceculture-medium图 4蚕蛹虫草接种方法筛选试验对照图Fig.4Comparison chart of screening test for inoculation methodsof Cordyceps militarisF1F2F388