重组DNA技术的操作过程.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,重组,D,NA,技术与,基因工程,5,2,3,4,1,6,重组,DNA,技术与基因工程的基本概念,重组,DNA,技术所需的基本条件,重组,DNA,技术的操作过程,目的基因的克隆与基因文库的构建,外源基因在大肠杆菌中的表达,外源基因在酵母中的表达,3,重组,DNA,技术的操作过程,切,接,转,增,检,A DNA,的体外重组（切与接）,3,重组,DNA,技术的操作过程,同种内切酶生产的粘性末端的连接,同尾酶生产的粘性末端的连接,不同粘性末端的连接,人工粘性末端的连接,重组率,基于同源重组的,In-Fusion,连接,同种内切酶生产的粘性末端的连接,5,5,GAATTC,CTTAAG,GAATTC,CTTAAG,EcoRI,5,G,CTTAA,AATTC,G,5,5,G,CTTAA,5,5,AATTC,G,5,退火,G,CTTAA,AATTC,G,5,G,CTTAA,5,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,5,G,CTTAA,5,AATTC,G,T4-DNA ligase,G,AATTC,CTTAA,G,5,5,G,AATTC,CTTAA,G,G,AATTC,CTTAA,G,5,5,G,AATTC,CTTAA,G,同尾酶生产的粘性末端的连接,BamHI,5,5,GGATCC,CCTAGG,GGATCC,CCTAGG,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,T,ACTAG,5,5,GATCA,T,5,退火,G,CCTAG,GATCC,G,5,T,ACTAG,5,GATCA,T,T4-DNA ligase,T,GATCC,ACTAG,G,5,5,G,GATCA,CCTAG,T,5,TGATCA,ACTAGT5,BclI,G,CCTAG,GATCC,G,5,T,ACTAG,5,GATCA,T,T,GATCC,ACTAG,G,5,5,G,GATCA,CCTAG,T,不同粘性末端的连接,BamHI,5,5,GGATCC,CCTAGG,GGATCC,CCTAGG,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,CTGCA,G,5,G,ACGTC,3,T4-DNA ligase,C,GATCC,G,CTAG,G,5,5,G,GATC,G,CCTAG,C,5,CTGCAG,GACGTC,5,PstI,3,T4-DNA pol,切平,5,C,G,5,G,C,Klenow,补平,5,G,GATC,CCTAG,GATCC,5,CTAG,G,C,GATCC,G,CTAG,G,5,5,G,GATC,G,CCTAG,C,人工粘性末端的连接,5突出末端,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,G,CTTAA,5,5,5,AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,Klenow,补平,Klenow,补平,5,G,GATC,CCTAG,GATCC,5,CTAG,G,5,G,AATT,CTTAA,5,5,5,AATTC,TTAA,G,TdT,TdT,dGTP,dCTP,G,AATT,GGGGGG,CTTAA,AATTC,GGGGGG,TTAA,G,G,GATC,CCCCCC,CCTAG,GATCC,CCCCCC,CTAG,G,G,AATT,GGGGGG,GATCC,CTTAA,CCCCCC,CTAG,G,G,GATC,CCCCCC,AATTC,CCTAG,GGGGGG,TTAA,G,5,5,G,AATT,GGGGGG,GATCC,CTTAA,CCCCCC,CTAG,G,G,GATC,CCCCCC,AATTC,CCTAG,GGGGGG,TTAA,G,退火,BamH I,BamH I,EcoR I,BamH I,人工粘性末端的连接,3突出末端,CTGCA,3,G,G,3,ACGTC,5,GCATG,3,C,5,C,3,GTACG,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATG,CCCCCC,3,C,退火,Pst I,Pst I,C,3,CCCCCC,GTACG,CTGCA,GGGGGG,3,G,G,3,GGGGGG,ACGTC,5,5,GCATG,CCCCCC,G,C,GGGGGG,ACGTC,CTGCA,GGGGGG,C,G,CCCCCC,GTACG,5,5,GCATG,CCCCCC,G,C,GGGGGG,ACGTC,CTGCA,GGGGGG,C,G,CCCCCC,GTACG,5,5,GCATG,CCCCCC,TGCA,G,C,GTAC,GGGGGG,ACGTC,CTGCA,GGGGGG,CATG,C,G,ACGT,CCCCCC,GTACG,5,5,GCATG,CCCCCC,TGCA,G,C,GTAC,GGGGGG,ACGTC,CTGCA,GGGGGG,CATG,C,G,ACGT,CCCCCC,GTACG,Klenow,Pst I,Sph I,人工粘性末端的连接,平头末端,C,3,G,G,5,G,3,C,5,C,3,G,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dTTP,dATP,G,TTTTTTTTTT,3,C,退火,C,3,TTTTTTTTTT,G,C,AAAAAAAAAA,3,G,G,3,AAAAAAAAAA,C,5,5,G,TTTTTTTTTT,G,C,AAAAAAAAAA,C,C,AAAAAAAAAA,C,G,TTTTTTTTTT,G,S1,C,3,5,5,G,TTTTTTTTTT,G,C,AAAAAAAAAA,C,C,AAAAAAAAAA,C,G,TTTTTTTTTT,G,加热,G,T,C,A,T,T,T,T,T,T,T,T,T,G,A,A,AAAA,A,A,A,C,C,A,G,T,A,A,A,A,A,A,A,A,A,C,T,T,TTTT,T,T,T,G,T,G,A,C,C,A,G,T,基于同源重组的,In-Fusion,连接,载体质粒,重组质粒,每条引物外侧设计含有与载体相应末端同源的,15,个碱基序列,引物,引物,In-Fusion,酶,加入,In-Fusion,酶,37,15 min+50,15 min,PCR,扩增,转化,重组率,重组率的定义,重组率=含有外源,DNA,的重组分子数/载体分子总数,；,在常规实验条件下，重组率一般为,25-75%；,重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以,大大简化,DNA,重组的后续操作。,重组率,提高重组率的方法,提高外源,DNA,片段与载体的分子比,：,5,:,1,-,10,:,1,载体,DNA,分子在连接前先除去磷酸基团：,5,5,GAATTC,CTTAAG,GAATTC,CTTAAG,EcoRI,5,G,CTTAA,p,AATTC,G,5,p,5,G,CTTAA,OH,5,5,AATTC,G,5,HO,退火,5,G,-,A,-,A,-,T,-,TC,C,-,T,-,T,-,A,-,A,G,5,G,A,-,A,-,T,-,T,-,C,C,-,T,-,T,-,A,-,A,-,G,OH,HO,OH,HO,碱性磷酸单酯酶,碱性磷酸单酯酶,重组率,提高重组率的方法,加装同聚尾末端：,CTGCA,3,G,G,3,ACGTC,5,GCATG,3,C,5,C,3,GTACG,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCATG,CCCCCC,3,C,退火,C,3,CCCCCC,GTACG,CTGCA,GGGGGG,3,G,G,3,GGGGGG,ACGTC,5,5,GCATG,CCCCCC,G,C,GGGGGG,ACGTC,CTGCA,GGGGGG,C,G,CCCCCC,GTACG,5,5,GCATG,CCCCCC,TGCA,G,C,GTAC,GGGGGG,ACGTC,CTGCA,GGGGGG,CATG,C,G,ACGT,CCCCCC,GTACG,Klenow,B,重组,DNA,分子,的转化和扩增（转与增）,3,重组,DNA,技术的操作过程,转化的原理与技术,转化率,转化细胞的扩增,转化的原理与技术,Ca,2+,诱导的完整细菌细胞的转化,Ca,2+,诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），,1970,年建立此技术，其原理是,Ca,2+,与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。,转化的原理与技术,Ca,2+,诱导的完整细菌细胞的转化,大肠杆菌感受态细胞,的制备：,100,ml,菌体培养至,OD,600,=0.5,，,离心收集菌体；,用,10,ml,冰冷的,10,mM,CaCl,2,溶液悬浮菌体，离心,用,1,ml,冰冷的,75,mM,CaCl,2,溶液悬浮菌体；,冰浴放置,12-24,小时，备用。,收集菌体；,转化的原理与技术,Ca,2+,诱导的完整细菌细胞的转化,大肠杆菌感受态细胞,的质粒转化：,取100,m,l,感受态细胞，加入相当于,50,ng,载体的重组,冰浴放置半小时；,在42保温,2,分钟（热脉冲）；,快速将转化细胞转移至冰浴中放置,1-2,分钟；,DNA,连接液，混匀；,加入,1,ml,新鲜培养基，,于37,培养,1,小时（扩增）；,涂在合适的固体培养基平板上进行筛选。,转化的原理与技术,细菌原生质体的转化,革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源,DNA,的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用,原生质体,（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组,DNA,分子。,酵母菌、霉菌、植物细胞也可用,原生质体法进行转化。,转化的原理与技术,细菌原生质体的转化,不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如,34%,的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在,10.3%,的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂。,细菌原生质体,的制备：,转化的原理与技术,细菌原生质体的转化,取,0.2-1,ml,的原生质体悬浮液（10,8,-10,9,个原生质体），加入,10-20,m,l DNA,重组连接液，同时加入含有,PEG1000,和,Ca,2+,细菌原生质体,的转化：,细菌原生质体,的再生,：,原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生,的等渗溶液，混匀。,在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素。,转化的原理与技术,l,噬菌体,DNA,的转染,感受态细胞的培养：,将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和,MgCl,2,的培养基中培养至,OD,600,=0.5；,吸附：,加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30保温10分钟；,转染裂解：,加入20倍体积的新鲜培养基，30培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选。,转化的原理与技术,电击转化,将待转化的质粒或,DNA,重组连接液滴加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或,DNA,重组分子便可进入细胞内。,电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大。,同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验。,转化率,转化率的定义,转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体,DNA,在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为：每微克载体,DNA,转化后，受体细胞接纳,DNA,的个数，,即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）。,转化率,转化率的定义,例如，,pUC18,对大肠杆菌的转化率为,10,8,，即每微克,pUC18,中只有,10,8,个分子能进入受体细胞。,一,微克,pUC18,共有,3.4,X10,11,个分子（,6.02,X10,17,/2686X660,），,也就是说，每,3400,个,pUC18,分子才有,一,个分子进入受体细胞。,另一方面，在实际操作过程中，转化,一,微克,pUC18,共需,2,ml,感受态细胞，大约含有,2,X10,10,个大肠杆菌细胞，也就是说，每,200,个细胞只有一个细胞能接纳,pUC18 DNA,。,转化率,转化率的用途,利用转化率和重组率等参数可以帮助设计,DNA,重组实验规模。,例,如，,某一,DNA,重组实验的重组率为,20%,，转化率为,10,7,/,m,g,载体，经切,接处理后的载体转化率一般要比天然的载体低,100,倍。欲获得10,4,个重,组克隆，需投入多少载体,DNA,进行重组实验？,若重组率为,100%,，则转化后产生,10,4,个重组克隆需要：,10,4,/10,7,X 10,-2,=0.1,m,g,载体,DNA,考虑到实验系统的重组率为,20%,，所以实际投入载体应为：,0.1/20%=0.5,m,g,载体,DNA,载体投入量确定后，外源,DNA,的投入量即可按,101,的要求算出,（,5,m,g,），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选。,转化率,转化率的影响因素,载体及,DNA,重组分子方面：,载体本身的性质：,不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同。,载体的空间构象：,质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于,空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低,两个数量级。,插入片段的大小：,对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。,转化率,转化率的影响因素,受体细胞方面：,受体细胞必须与载体相匹配，例如：,pBR322,转化大肠杆菌,JM83,株，转化率很低；但对大肠杆菌,ED8767,株的转化率则,较高。,转化率,转化率的影响因素,转化方法方面：,受体细胞的预处理：,影响最大,供受体的比例：,Ca,2+,诱导转化,0.1,ml,感受态,细胞,50,ng DNA,转化方法：,Ca,2+,诱导转化,10,6,-10,7,/,m,g DNA,原生质体转化,10,9,个,原生质体,50,ng DNA,原生质体转化,10,5,-10,6,/,m,g DNA,l,-DNA,转染,10,7,-10,8,/,m,g DNA,电穿孔转化,10,6,-10,9,/,m,g DNA,转化细胞的扩增,扩增操作,转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如：,Ca,2+,诱导转化后的,37,培养一个小时；,原生质体转化后的再生过程；,l,噬菌体转染后的,30,培养等，均属扩增操作。,转化细胞的扩增,扩增操作的目的,增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序,扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选,表达外源基因，便于筛选和鉴定,C,转化子的筛选和鉴定（检）,3,重组,DNA,技术的操作过程,载体遗传标记检测,克隆,DNA,序列检测,外源基因产物检测,C,转化子的筛选和鉴定（检）,3,重组,DNA,技术的操作过程,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分,转化子,与非转化子,、,重组子,与非重组子、,目的重组子,与非目的重组子。,转化子,重组子,目的重组子,载体遗传标记检测,抗药性筛选法,抗药性筛选法的基本原理：,ROP,ROI,Sal I,BamH I,Tc,r,Pvu I,Pst I,Pst I,EcoR I,Cla I,Hind III,Hind II,Bal I,Ap,r,pBR322,4363,bp,ori,抗药性筛选法可区分转化子与非转,化子、重组子与非重组子。,将外源,DNA,片段插在,EcoRI,位点：,非重组子呈,Ap,r,、,Tc,r,重组子呈,Ap,r,、,Tc,r,将外源,DNA,片段插在,BamHI,位点：,非重组子呈,Ap,r,、,Tc,r,重组子呈,Ap,r,、,Tc,s,载体遗传标记检测,抗药性筛选法,抗药性筛选法的基本操作：,先将转化液涂布含有,Ap,的平板，,再,将,Ap,平板上的转化子影印至,含有,Ap,和,Tc,的平板上。,在,Ap,平板上生长、但在,Ap,和,Tc,平板,上,不长的转化子即为重组子。,Ap,Ap+Tc,影印,挑选,载体遗传标记检测,营养缺陷型筛选法,营养缺陷型筛选法的基本原理：,营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。,载体遗传标记检测,显色筛选法,显色筛选法的基本原理：,显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒,pUC18,携带的,lacZ,基因（蓝色反应）、链霉菌质粒,pIJ702,携带的,melC,基因（黑色反应）等。,载体遗传标记检测,显色筛选法,显色筛选法的基本操作：,Ap+X-gal,重组子（,Ap,r,+lacZ,-,）,将外源基因克隆在,pUC18,的,lacZ,标记,基因内部，使之灭活，此时重组子为,Ap,r,、,lacZ,-,基因型,，乳白色菌落；而非重组子则为,Ap,r,、,lacZ,+,基因型的,蓝色菌落。,pUC18,Ap,r,lacZ,ori,克隆,DNA,序列检测,限制性酶切图谱法,所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源,DNA,片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。,克隆,DNA,序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,pUC18,2.7 kb,HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI,Ap,r,lacZ,ori,B,B,E,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,区分重组子与非重组子,用,BamHI,酶切转化子质粒,DNA,；,电泳观察酶解产物片段。,重组子：,2.7,kb+4.0 kb,非重组子：,2.7,kb,如果外源,DNA,片段也是,2.7,kb,，,最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然,后通过其长度来鉴定其是否为重组子,克隆,DNA,序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,区分重组子与非重组子,如果外源,DNA,片段插在,pUC18,的,SphI,位点处，原则上也可用,SphI,酶解鉴定，但这样做很不经济，因为,SphI,非常昂贵（每,100,单位,50,美元）。用,HindIII,和,EcoRI,联合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及,SphI,的,1/50。,pUC18,2.7 kb,HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI,Ap,r,lacZ,ori,S,S,B,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,克隆,DNA,序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,pUC18,2.7 kb,HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI,Ap,r,lacZ,ori,B,B,E,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,区分目的重组子与非目的重组子,用,EcoRI,酶切转化子质粒,DNA,目的重组子：,3.0,kb+3.7 kb,或者：1.0,kb+5.7 kb,用,PstI,酶切转化子质粒,DNA,目的重组子：,3.2,kb+3.5 kb,或者：0.8,kb+5.9 kb,克隆,DNA,序列检测,限制性酶切图谱法,全酶解图谱法：,pUC18,2.7 kb,HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI,Ap,r,lacZ,ori,B,B,E,4.0 kb,2.0 kb,2.0 kb,区分目的重组子与非目的重组子,对图示的克隆片段，转化子质粒,DNA,用,EcoRI,酶切开后，只出现,2.0,kb,和,2.7,kb,两条带子，实际上,2.0,kb,的条带中含有两种不同的,2.7 kb,2.0 kb,E,分子。,克隆,DNA,序列检测,限制性酶切图谱法,部分酶解图谱法：,2.2 kb,PstI EcoRI BamHI,B,B,E,4.4 kb,1.2,1.8 kb,E,B,0.6,0.8,该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据：,BamHI,全酶解：,0.6 0.8 1.8 3.4,kb,BamHI+EcoRI,全酶解：0.6 0.8 1.8 1.2 2.2,kb,其中，,1.2,kb,片段的存在表明该片段位于一端。,BamHI,部分酶解：,1.4 2.6 4.0,kb,其中，,1.4,kb,的片段必为,0.6,kb,和,0.8,kb,两片段，表,明两者是连在一起的；同理，,2.6,kb,的片段必为,0.8,kb,和,1.8,kb,两片段，表明两者是连在一起的；最后，,4.0,kb,的片段必为,0.6,kb,和,3.4,kb,两片段，表明两者,是连在一起的。,克隆,DNA,序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或,DNA,片段的同源序列设计并合成,探针,，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，,DNA,同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。,克隆,DNA,序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,菌落原位杂交法的基本操作：,影印,用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板；,洗涤,杂交,感光,用,0.4,N,的,NaOH,溶液浸泡影印薄膜；,用,SSC,溶液浸泡清洗影印薄膜,；,80,烘干固定影印薄膜；,薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温；,用,SSC-SDS,液洗涤杂交薄膜；,用,X,光胶片覆盖薄膜感光。,洗涤,压片,克隆,DNA,序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的制备：,用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：,单链结构（双链,DNA,可用碱变性）,足够长度（至少,12个,碱基）,内部不含互补区,探针的制备方法或来源包括：,人工合成,cDNA,合成,同源序列,mRNA,克隆,DNA,序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：,逆转录酶,介导的反转录标记,3,AAAAAAAAAAACCAGCUUCC,G,AACUGAUUUAGGCU,5,mRNA,反转录酶,Mg,2+,dNTP+,p,p,p,d,ATP（,a,-,32,P-dATP,）,5,TTTTTTTTTTT,5,mRNA,3,cDNA,3,AAAAAAAAAAACCAGCUUCC,G,AACUGAUUUAGGCU,5,TTTTTTTTTTT,GGTCG,AA,GGCTTG,A,CT,AAA,TCCG,A,克隆,DNA,序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：,DNA,聚合酶,介导的缺刻前移标记,5,G,-,C,-,T,-,C,-,A,-,G,-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G,-,T 3,3,C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,C,-,G,-,A,-,C,-,C,-,T,-,C,-,A,5,Mg,2+,5,dNTP,5,pp,p,dA（,a,-,32,P-dATP）,5,G,-,C,-,T,-,C A,-,G,-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G,-,T 3,3,C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,C,-,G,-A,-,C,-,C,-,T,-,C,-,A,5,5,G,-,C,-,T,-,C,-,A-G,-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G,-,T 3,3,C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,C,-,G,-,A,-,C,-,C,-,T,-,C,-,A,5,DNase I,DNA pol I,克隆,DNA,序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：,ABC,荧光标记,GCTTGAGCAGTAACCTG,荧光胺,Biotin,生物素,Avidin,生物素结合蛋白,烷烃连接臂,克隆,DNA,序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：,ABC,显色酶标记,GCTTGAGCAGTAACCTG,显色酶,Biotin,生物素,Avidin,生物素结合蛋白,烷烃连接臂,生色底物,颜色产物,克隆,DNA,序列检测,菌落噬菌斑原位杂交法,杂交探针的标记：,地高辛系统标记,dUTP,-,连接臂,-,甾醇半抗原,digoxigenin DIG,抗体,-,显色酶,交联复合物,克隆,DNA,序列检测,PCR,扩增检测法,如果已知克隆的目标基因两侧的序列，便可合成引物，以待鉴定的重子,DNA,为模板，实施,PCR,。能扩增出大小相符,pUC18,2.7 kb,HindIII SphI PstI SalI BamHI SmaI KpnI EcoRI,Ap,r,lacZ,ori,4.0 kb,片段的即为期望重组子。,由于,PCR,技术日益普及，因此该程序已成为鉴定重组子,和期望重组子的首选方法。,克隆,DNA,序列检测,DNA,序列分析法,双脱氧末端终止测序法的基本原理：,DNA,序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行采用,Sanger,发明的双脱氧末端终止法测定,DNA,序列，其工作原理是在,DNA,聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定,DNA,序列其关键技术有：,DNA,链聚合反应时的定点随机中断（,ddNTP,）,聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（,600,bp/601 bp,）,电脑自动检测、记录、编辑程序,用于,DNA,测序的专一性试剂盒（,Kit,）,克隆,DNA,序列检测,DNA,序列分析法,双脱氧末端终止测序法的基本操作：,A,C,G,T,ssDNA,ssDNA,ssDNA,ssDNA,Primer,Primer,Primer,Primer,Klenow,Klenow,Klenow,Klenow,dNTPs,dNTPs,dNTPs,dNTPs,ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP,A,G,T,C,DNA,聚合反应,聚丙烯酰胺凝胶电泳,克隆,DNA,序列检测,DNA,序列分析法,双脱氧末端终止测序法的基本反应：,Klenow,OH 3,5,P,T,dNTP+,ddATP,T,T,T,T,T,OH 3,5,P,A,G,T,C,GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA,克隆,DNA,序列检测,DNA,序列分析法,基于,DNA,合成的,454,超高通量测序战略：,待测,DNA,样品的预处理：,A,接头,B,接头（含,生物素,分子）,高压气流随机打断,400-600 bp,片段,两端连接扩增和测序接头,克隆,DNA,序列检测,DNA,序列分析法,基于,DNA,合成的,454,超高通量测序战略：,待测,DNA,的固相,emPCR,扩增,变性,表面涂有抗生物素蛋白的磁珠,结合,包裹,水油乳状囊泡,扩增,释放,变性,克隆,DNA,序列检测,DNA,序列分析法,基于,DNA,合成的,454,超高通量测序战略：,多重,DNA,测序反应,3,T-C-G-A-G-G-G-A-C-C-A-G-T-C-G-T-A-,5,A-G-C-T-C-C-G,pppT,PPi,+,APS,sulfurylase,ATP,luciferase,luciferin,oxy-luciferin+,hv,160,万孔,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,淀粉酶目的基因的鉴定：,淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶,淀粉酶能将淀粉水解为多糖或单糖。将难溶于水,的淀粉加入固体培养基内，培养基呈混浊状。将,待鉴定的重组克隆涂布在此培养基上，含目的基,因的目的重组子可其表达的淀粉酶分泌出胞外，,并均匀扩散，同时降解淀粉为可溶性的多糖或单糖。因此，目的重组子菌落周围会形,成透明圈。如果透明圈不明显，还可往培养板上喷碘，使淀粉所在区域呈蓝色本底，,易于辨认。,蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定。,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,抗菌素抗性基因的鉴定：,抗菌素抗性基因表达的蛋白质能使受体细胞产生对该抗生素的抗性。据此，只需往培养板中加入适量抗生素，理论上长出的菌落即是含有目的基因的目的重组子。,在实际操作过程中，由于抗生素有时会诱导受体细胞产生抗性，因此必须从抗性重组克隆中抽出重组质粒，二次转化受体细胞。如果此时转化平板上出现大量的抗性菌落，即可认为这种抗性确由目的基因的编码产物产生。,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,抗菌素抗性基因的鉴定：,目的重组子,诱导抗性,抽取重组质粒,再次转化,外源基因产物检测,蛋白质生物功能测定法,DNA,结合蛋白编码基因的鉴定：,影印,用聚乙烯薄膜影印裂解平板；,洗涤,杂交,感光,轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定；,80,烘干固定影印薄膜；,与探针溶液中杂交；,洗涤、干燥、感光。,用,氯仿蒸汽,或,烈性噬菌体,喷洒克隆平板；,聚乙烯膜,探针选用能与,目标蛋白特异,性结合的,DNA,片段。,外源基因产物检测,蛋白质生物结构鉴定法,放射免疫原位杂交,鉴定：,影印,用固定了特异性抗体的聚乙烯薄膜影印,洗涤,与,I,125,标记的,IgG,保温,感光,轻轻漂洗影印薄膜，干燥固定；,与,I,125,标记的,IgG,保温；,洗涤、干燥、感光,。,用,氯仿蒸汽,或,烈性噬菌体,喷洒克隆平板；,含抗体的聚乙烯膜,裂解平板；,洗涤,压片,外源基因产物检测,聚丙烯酰胺凝胶电泳法,如果待筛选鉴定的目标蛋白既不能测定生物活性，又无现成的抗体使用，则可采用,聚丙烯酰胺凝胶电泳进行粗略的筛选。,3,重组,DNA,技术的操作过程,C,转化子的筛选和鉴定（检）,B,重组,DNA,分子的转化和扩增（转、增）,A DNA,的体外重组（切、接）,