ImageVerifierCode 换一换
格式:PPT , 页数:36 ,大小:1.23MB ,
资源ID:8666470      下载积分:12 金币
验证码下载
登录下载
邮箱/手机:
图形码:
验证码: 获取验证码
温馨提示:
支付成功后,系统会自动生成账号(用户名为邮箱或者手机号,密码是验证码),方便下次登录下载和查询订单;
特别说明:
请自助下载,系统不会自动发送文件的哦; 如果您已付费,想二次下载,请登录后访问:我的下载记录
支付方式: 支付宝    微信支付   
验证码:   换一换

开通VIP
 

温馨提示:由于个人手机设置不同,如果发现不能下载,请复制以下地址【https://www.zixin.com.cn/docdown/8666470.html】到电脑端继续下载(重复下载【60天内】不扣币)。

已注册用户请登录:
账号:
密码:
验证码:   换一换
  忘记密码?
三方登录: 微信登录   QQ登录  

开通VIP折扣优惠下载文档

            查看会员权益                  [ 下载后找不到文档?]

填表反馈(24小时):  下载求助     关注领币    退款申请

开具发票请登录PC端进行申请。


权利声明

1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,个别因单元格分列造成显示页码不一将协商解决,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前可先查看【教您几个在下载文档中可以更好的避免被坑】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时联系平台进行协调解决,联系【微信客服】、【QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【版权申诉】”,意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4009-655-100;投诉/维权电话:18658249818。

注意事项

本文(基因工程药物之干扰素的制备流程课件.ppt)为本站上传会员【丰****】主动上传,咨信网仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。 若此文所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知咨信网(发送邮件至1219186828@qq.com、拔打电话4009-655-100或【 微信客服】、【 QQ客服】),核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
温馨提示:如果因为网速或其他原因下载失败请重新下载,重复下载【60天内】不扣币。 服务填表

基因工程药物之干扰素的制备流程课件.ppt

1、Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,资料仅供参考,不当之处,请联系改正。,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处,请联系改正。,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处,请联系改正。,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第

2、四级,第五级,*,资料仅供参考,不当之处,请联系改正。,1,什么是干扰素,概念,(interferon,IFN),:机体免疫细胞产生的一类细胞因子,是机体受到病毒感染时,免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。,根据分子结构和抗原性的差异分为,、,、,、,等,4,个类型。,1.1,天然干扰素的分类,1.,根据来源、基因序列和氨基酸组成分类,I,型干扰素:,IFN,、,IFN,、,IFN,、,IFN,来源:白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等,功能:抗病毒感染、抗肿瘤生长、免疫调节,(,较弱),其中,IFN-,为多基因产物,有,23,种以上的亚型。,II,型干

3、扰素:干扰素,(,IFN,),来源:活化的,T,细胞和,NK,细胞产生,功能:免疫调节,提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强,Tc,细胞和,NK,细胞的杀伤活性 抑制,TH2,细胞形成,下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用(次要),2.,根据动物来源确定分类 人干扰素(,HuIFN,),小鼠干扰素(,MuIFN,)。,不同来源的干扰素,1.2,重组干扰素的临床应用,广谱抗病毒活性(,rhuIFN,),慢性乙型、丙型、丁型肝炎;疱疹、病毒性角膜炎。,直接抗肿瘤活性(,rhuIFN,),毛细胞和慢性髓样白血病、,Kaposi,肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。,免疫调节活性,治疗慢性肉芽

4、肿瘤(,rhuIFN,),多发性硬化症,rhuIFN,2,基因工程大肠杆菌发酵生产工艺,干扰素生产工艺路线,上市产品:重组人干扰素,rhuIFN,1986,,,rhuIFN-2a,,,rhuIFN-2b,;,1990,,,rhuIFN-1b,;,1993,,,rhuIFN-1b,;,2001,2002,:,PEG,化,IFN,,,PEG-Intron,Pegasys,表达产物:无糖基化,,N-met,,无活性包涵体,工艺特点:发酵过程,随后变性、复性过程,。,基因工程大肠杆菌发酵生产工艺,:,目的基因的分离,克隆载体,目的基因与克隆载体的体外重组,重组体导入大肠杆菌,K12,受体菌的培养及筛选

5、从受体菌中获取目的基因,表达载体,重组质粒,导入大肠杆菌,受体菌的筛选,表达性、稳定性等检测,工,程菌,基因工程菌的制备,一、目的基因的分离与扩增,1.,破碎细胞,用,Trizol,法提取总的,RNA,2.,将生产干扰素的人白细胞的,mRNA,分级分离然后进行凝胶电泳切取目的基因片段,3.,用逆转录试剂盒逆转录,把总,mRNA,逆转录成,cDNA,4.,以,cDNA,为模板、干扰素引物为引物,,PCR,,得到完全的干扰素基因的,PCR,产物,5.,人工加尾形成“粘性末端”,二、构建重组质粒,1.,提取载体(质粒、病毒等),双酶切,再把干扰素基因的,PCR,产物用相应的酶酶切,用连接酶连接,E

6、co,R I,B,am,H I,E,co,R I,B,am,H I,2.,连接完成后分离纯化,测序,与原干扰素序列比对。,3.,鉴定序列无误后,导入受体细胞,筛选,三、重组体引入宿主细胞,将,cDNA,克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒中,转化到大肠杆菌,重组的载体,DNA,分子在一定条件下转化入大肠杆菌,形成携带质粒的菌株。,四、受体菌的筛选,由于质粒重组时有,3,种基本方式,即:目的基因与克隆载体重组,目的基因片段与目的基因片段重组,克隆载体与克隆载体重组;另外重组过程可能会发生基因突变情况,五、分析保存,对基因工程大肠杆菌进行评价分析,并保存菌种。,干扰素的发酵工艺过程,启开种

7、子 制备种子液 发酵培养 粗提,精提 半成品制备 半成品检定 分装,冻干 成品检定 成品包装,1,菌种培养,取,70,下保存的甘油管菌种(工作种子批),于室温下融化。然后,接入摇瓶,培养温度,30,,,pH7.0,,,250 r/min,活化培养,182,小时后,进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。,2,种子罐培养,将已活化的菌种接入装有,30L,培养基的种子罐中,接种量,10%,,培养温度,30,,,pH7.0,,级联调节通气量和搅拌转速,控制溶解氧为,30%,,培养,3,4,小时,转入发酵罐中,同时取样发酵液进行显微镜检查和,LB,培养基划线检查,控制杂菌,3.,发酵罐培养,将种子液通入,30

8、0L,培养基的发酵罐中,接种量,10%,,培养温度,30,,,pH7.0,。级联调节通气量和搅拌转速,控制溶解氧,30%,,培养,4,小时。然后控制培养温度,20,,,pH6.0,,溶解氧,60%,,继续培养,5,6.5,小时。同时进行发酵液杂菌检查,当,OD,值达,9.01.0,后,用,5,冷却水快速降温至,15,以下,以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中,加入冰块使温度迅速降至,10,以下。,4.,菌体收集,将已降温的发酵液转入连续流离心机,,16000 r/min,离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体于,20,冰柜中保存时

9、不得超过,12,个月。每保存,3,个月,检查一次活性。,3.,干扰素的分离纯化工艺过程,3.1,、干扰素分离工艺过程,3.2,、干扰素的纯化工艺过程,3.1,干扰素分离工艺过程,菌体裂解,预处理,初级分离,(1),菌体裂解,裂解缓冲液:纯化水配制,,2,10,(,pH7.5,),使用保护剂:,EDTA,,,PMSF,。,破碎菌体:,2,厘米以下的碎块,搅拌:加裂解缓冲液,,2,10,,,2hr,冻融,:,细胞完全破裂,释放干扰素。,(2),预处理,-,沉淀,加絮凝剂聚乙烯亚胺,:,2,10,,搅拌,45min,,对菌体碎片进行絮凝。,加凝聚剂醋酸钙溶液,:,2,10,搅拌,15min,,对菌

10、体碎片、,DNA,等进行沉淀。,(3),离心,连续流离心机:,2,10,,,16000 r/min,收集上清液:含有重组干扰素蛋白质,杂质沉淀:,121,、,30min,蒸汽灭菌,焚烧处理。,(,4,)初级分离,盐析,:,硫酸铵,,2,10,,搅匀,静置过夜。,离心:连续流离心机,,16000 r/min,保存:收集沉淀,粗干扰素,,4,保存。,3.2,、干扰素纯化工艺过程,溶解粗干扰素,沉淀与疏水层析,阴离子交换层析与浓缩,阳离子交换层析与浓缩,凝胶过滤层析,无菌过滤分装,(1),溶解粗干扰素,配制纯化缓冲液:,超纯水,,pH7.5,磷酸缓冲液,,0.45 m,滤器和,10 ku,超滤系统,

11、百级层流下收集。冷却至,2,10,。,检查,:,缓冲液的,pH,值和电导值。,溶解:,2,10,,匀浆,完全溶解。,(2),沉淀与疏水层析,等电点沉淀(,1,):磷酸调节至,pH5.0,,沉淀杂蛋白,离心收集上清液。,疏水层析:干扰素吸附在疏水层析柱中,除非疏水性蛋白,洗脱与收集:,0.01M,磷酸缓冲液(,pH8.0,),等电点沉淀(,2,):磷酸调节,pH4.5,,调节电导值,40 ms/cm,,,2,10,,静置过夜,超滤:,1000 ku,超滤膜过滤,除去大蛋白。,透析除盐:调整溶液,pH 8.0,,电导值,,10 ku,超滤膜,,0.005 M,缓冲液。,(3),无菌过滤分装,0.2

12、2 m,滤膜过滤干扰素溶液,分装,20,以下的冰箱中保存。,(4),检测项目,干扰素鉴别试验,干扰素效价测定,蛋白质含量,纯度测定,分子量,宿主残余蛋白、残余,DNA,干扰素结构鉴定:紫外光谱,肽谱,,N,端序列,其他:热原,内毒素,残留抗生素,半成品检定,(,1,),效价测定,用细胞病变抑制法,以,Wish,细胞、,VSV,病毒为基本检测系统,测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。,(,2,),蛋白质含量测定,福林,-,酚法,以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋白为标准。,(,3,),比活性,效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。,(,4,),纯度,电泳纯度用非还原型,SDS-PAG

13、E,法,银染显色应为单一区带,经扫描仪测定纯度应在,95%,以上。,(,5,)相对分子量测定,还原型,SDS-PAGE,,加样量不地域微克,同时用已知相对分子量的蛋白标准系列做对照,以迁移率为横坐标,相对分子量的对数为纵坐标作图,计算相对分子量。与理论值比较,误差不得高于,10%,。,(,6,)残余外源性,DNA,含量测定,用放射性核素或生物素探针法测定,每剂量中残余外源性,DNA,应低于,100pg,。,(,7,)残余血清,IgG,含量测定,在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项检定。,(,8,)残余抗生素活性测定,半成品中不应有抗生素活性存在。,(,9,),紫外光谱扫描,检查半成品

14、的光谱吸收值,最大吸收值应在,2802,纳米。,(,10,),肽图测定,用,CNBr,裂解法,测定结果应符合干扰素的结构,且批与批之间应一致。,(,11,),等电点测定,等电聚焦电泳。,(,12,),除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质试验。,成品检定,(,1,),物理性状,冻干品白色或微黄色疏松体,加入注射水后不得含有肉眼可见不溶物。,(,2,),鉴别试验,应用,ELISA,或中和试验检定。,(,3,),水分测定,用卡氏法,应低于,3%,。,(,4,),无菌试验,同半成品。,(,5,),热原质试验,同半成品检定。,(,6,),干扰素效价测定,同半成品检定,效价不应低于标示量。,(,

15、7,),安全试验,取体重为,350-400,克豚鼠,3,只,每只腹侧皮下注射量为成人每千克体重临床使用最大量的,3,倍,观察,7,天,若豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降,说明成品合格。取体重,18-20,克小鼠,5,只,每只尾静脉注射剂量按人每千克体重临床使用最大量的,3,倍,观察,7,天,若动物全部存活,说明成品合格。,4,国内基因工程药物产业发展状况,我国的生物技术药物却一直苦于缺乏自主创新的产品,绝大多数上市药物为仿制药,创新药物的开发一直未能打开局面。,一种新药从研发到投放市场,投入大约为,30,亿,60,亿美元。,存在的问题:,(,1,)同种产品生产厂家过多,造成市场恶性竞争,严重影响产业的健康发展。(,2,)融资渠道单一、产业发展资金不足。(,3,)医药市场竞争无序,行业不正之风严重。(,4,)企业管理相对滞后,技术兼经营型人才匮乏。,谢谢!,

移动网页_全站_页脚广告1

关于我们      便捷服务       自信AI       AI导航        抽奖活动

©2010-2025 宁波自信网络信息技术有限公司  版权所有

客服电话:4009-655-100  投诉/维权电话:18658249818

gongan.png浙公网安备33021202000488号   

icp.png浙ICP备2021020529号-1  |  浙B2-20240490  

关注我们 :微信公众号    抖音    微博    LOFTER 

客服