重组人干扰素生产工艺.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,重组人干扰素生产工艺,三组,主要内容,干扰素概述,基因工程假单胞杆菌的构建与保藏（菌种）,干扰素的发酵工艺过程,干扰素的分离纯化工艺过程,干扰素概述,干扰素的种类,干扰素的理化性质,干扰素的生物学活性,干扰素的临床应用,干扰素的生产工艺路线,干扰素,概念,：,干扰素是一种细胞因子，它是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应，而产生的一组结构类似、功能相近的低分子糖蛋白。简称IFN。,发现,：,干扰素是1957年英国科学家,Isaccs等,发现的。他们把灭活的流感病毒作用于小鸡细胞，结果发现这些细胞产生了一种可溶性物质，,这种物质能抑制流感病毒，并且能干扰其它病毒的繁殖,，因此，他们将这种物质称为“干扰素”。以后科学家们进一步发现，机体对入侵的异种核酸（包括病毒）都产生干扰素以进行防御。,当机体细胞受到病毒感染时，机体细胞产生干扰素，干扰病毒复制，它是机体抗病毒感染的防御系统。,干扰素的理化性质,143-166aa,；,MW:18-40 ku,；,pI:6.5-7.5,；,乙醚、氯仿敏感,容易吸附玻璃、淀粉、醋酸,纤维膜、琼脂和塑料等介质。,型干扰素具有广谱的抗病毒活性，对多种病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用；但这种效应,不是直接的,，而是通过对宿主细胞的作用引起的。,对干扰素敏感的细胞表面存在,干扰素受体,，该,细胞核内,有“抗病毒蛋白”基因，受干扰素作用后该基因活化，产生的抗病毒蛋白可阻止病毒mRNA翻译，并促进病毒mRNA降解。,干扰素能,提高,细胞表面MHC类分子的表达水平，受到病毒感染的细胞表面MHC类分子的增加有助于向Tc细胞,递呈,抗原，引起靶细胞的溶解。,干扰素可增强NK细胞（自然杀伤免疫细胞）对病毒感染的,杀伤能力,。,干扰素的生物学活性,正常情况下,组织或血清中不含干扰素,，只有在某些特定因素的作用下才能,诱使,细胞产生干扰素。,广谱抗病毒活性机制,干扰素合成及作用,宿主细胞（白细胞）,抗肿瘤作用机制,型干扰素能,抑制细胞的DNA合成,，,减慢,细胞,的,有丝分裂,速度；这种抑制作用有明显的选择,性，对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强,5001000倍。另外，型干扰素也可通过增,强机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其,抗肿瘤效应。干扰素原始品种价格在10002000 多，产量很低。运用生物技术生产后的价格在4060之间，而且产量也很乐观，运用价值大大提升。,免疫调节活性机制,免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。,对巨噬细胞的作用：IFN可使巨噬细胞表面MHC类分子的表达增加，增强其抗原递呈能力；此外还能增强巨噬细胞表面表达Fc受体，,促进巨噬细胞吞噬免疫复合物、抗体包被的病原体和肿瘤细胞。,对淋巴细胞的作用：干扰素对淋巴细胞的作用较为复杂，可,受剂量和时间等因素的影响而产生不同的效应,。在抗原致敏之前使用,大剂量,干扰素或将干扰素与抗原同时投入会产生明显的免疫,抑制作用,；而,低剂量,干扰素或在抗原致敏之后加入干扰素则能产生免疫,增强的效果,。在适宜的条件下，IFN对B细胞和CD8+T细胞的分化有促进作用，但不能促进其增殖。IFN能增强TH1细胞的活性，增强细胞免疫功能；但对TH2细胞的增殖有抑制作用，因此抑制体液免疫功能。IFN不仅抑制TH2细胞产生IL-4，而且抑制IL-4对B细胞的作用，特别是抑制B细胞生成IgE。,对其它细胞的作用：IFN对其他细胞也有广泛影响：刺激中性粒细胞，,增强其吞噬能力,；活化NK细胞，,增强,其,细胞毒作用,；使某些正常不表达MHC类分子的细胞（如血管内皮细胞、某些上皮细胞和结缔组织细胞）表达MHC类分子，,发挥抗原递呈作用,；使静脉内皮细胞对中性粒细胞的粘附能力更强，且可分化为高内皮静脉，吸引循环的淋巴细胞（增强免疫系统）。,重组干扰素的临床应用,广谱抗病毒活性（,rhuIFN,）,慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。,直接抗肿瘤活性（,rhuIFN,）,毛细胞和慢性髓样白血病、,Kaposi,肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。,免疫调节活性,治疗慢性肉芽肿瘤（,rhuIFN,）,多发性硬化症,rhuIFN,干扰素生产工艺路线（,1,）,体外诱生干扰素制备工艺,：,Sendai,病毒诱导人白细胞,1989,年：,IFN-n3,，批准上市,产量低：,1g IFN,，需要,3,亿,ml,人血白细胞,来源困难，工艺复杂，收率低，,价格昂贵,潜在的血源性,病毒污染,的可能性,干扰素生产工艺路线（,2,）,人源转化细胞系培养生产工艺：,1999,年：,IFN-n1,批准用于临床。,优点：首次实现大规模商业化生产。,缺点：,活性低,，退出临床应用。,干扰素生产工艺路线（3）,上市产品：,rhuIFN-1a,1996,，,Avonex(Biogen),；,2002,，,Rebif(Serono),表达产物：,166 aa糖基化蛋白，,22.5 ku,工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格,动物无限细胞系培养生产工艺：,干扰素生产工艺路线（4）,上市产品：重组人干扰素,rhuIFN,1986,，,rhuIFN-2a,，,rhuIFN-2b,；,1990,，,rhuIFN-1b,；,1993,，,rhuIFN-1b,；,2001,2002,：,PEG,化,IFN,，,PEG-Intron,Pegasys,表达产物：无糖基化，,N-met,，无活性包涵体,工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。,基因工程大肠杆菌发酵生产工艺,:,基因工程,假单胞杆菌,的构建与保藏,基因工程假单胞杆菌菌种建立,基因工程假单胞杆菌菌种特性,菌种库的建立与保藏,基因工程假单胞杆菌菌种建立,第一步：干扰素,-2b,基因的克隆,第二步：表达载体的构建,第三步：工程菌的构建,第一步：干扰素基因的克隆,(RT-PCR),制备白细胞，病毒诱导，分离,mRNA,反录酶合成,cDNA,PCR,，,基因连接质粒,转化,E.coli,筛选鉴定克隆。,测序：编码人,IFN-2b,基因序列,501bp,，,165aa,。,第二步：表达载体构建,IFN,基因与表达载体连接,转化大肠杆菌,筛选阳性克隆,获得序列正确表达载体,第三步：工程菌构建,转化假单胞杆菌,筛选高表达、稳定遗传的工程菌,获得原始菌种,基因工程菌的特性,（1）具有宿主菌的特征细菌：革兰氏阴性菌，有荚膜，无芽孢，杆状。,菌落：直径2.5-3.0 mm，灰绿色半透明状,粘稠。,（2）具有生产干扰素能力：,放射性免疫学效价不低于2.0109 IU/L。,菌种库的建立与保藏,QC（质量控制）：菌种特性、生产能力、质粒稳定性,菌种检查合格后，方可投产。,干扰素,-2b,的发酵工艺过程,摇瓶培养,取保存工作种子批菌种，室温融化,摇瓶培养：,30,，,pH7.0,，,250 r/min,，,182h,检测：,OD,值和发酵液杂菌检查。,种子罐培养,接种：接入50L种子罐，接种量10%。,培养：30，pH7.0。,控制：级联调节通气量和搅拌转速,DO（溶解氧）为30%，34hOD（吸光度）4.0。,检测：显微镜和,LB培养基,划线检查，控制杂菌。,LB,培养基,LB培养基是一种培养基的名称,生化分子实验中一般用该培养基来预培养菌种,使菌种成倍扩增,达到使用要求.培养的菌种一般是,经过改造,的,无法在外界环境单独存活和扩增,的工程菌.通过培养工程菌,我们可以,表达,大量的外源蛋白,也可以拿到带有外源基因的,质粒,.这个名字来源於英语的lysogeny broth，即溶菌肉汤。（贝尔尼塔）,发酵罐培养,接种：通入,300L,培养基的发酵罐，接种量,10%,。,控制：级联调节通气量和搅拌转速。,前,4h,：,30,，,pH7.0,，,DO,为,30%,。,4h,后：,20,，,pH6.0,，,DO,为,60%,，,5,6.5h,。,终点控制：,OD,值达,9.01.0,，,5,冷却水快速降温至,15,以下。,检测：发酵液杂菌检查,菌体收集,连续流离心机：冷却的发酵液，,16000 r/min,离心收集。,菌体保存：,20,冰柜，不超过,12,个月。,检测：干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性。,干扰素的分离纯化工艺过程,干扰素分离工艺过程,干扰素的纯化工艺过程,干扰素,-2b,分离工艺过程,菌体裂解,预处理,初级分离,(1),菌体裂解,裂解缓冲液：纯化水配制，,2,10,（,pH7.5,）,使用保护剂：,EDTA,，,PMSF破碎,20,菌体：,2,厘米以下的碎块,搅拌：加裂解缓冲液，,2,10,，,2hr,冻融,:,细胞完全破裂，释放干扰素。,EDTA,本品为钙离子络合剂，洗涤剂，血液抗凝剂。生化研究中用作钙螯合剂，消除微量重金属导致的酶催化反应中的抑制作用。,PMSF,分离纯化剂，有剧毒，使用时微量即可。,(2),预处理,-,沉淀,加,絮凝剂,聚乙烯亚胺,:,2,10,，搅拌,45min,，对菌体碎片进行絮凝。,加凝聚剂醋酸钙溶液,:,2,10,搅拌,15min,，对菌体碎片、,DNA,等进行沉淀。,(3),离心,连续流离心机：,2,10,，,16000 r/min,收集上清液：含有重组干扰素蛋白质,杂质沉淀：,121,、,30min,蒸汽灭菌,焚烧处理。,（,4,）初级分离,盐析,:4M,硫酸铵，,2,10,，搅匀,静置过夜。,离心：连续流离心机，,16000 r/min,保存：收集沉淀，粗干扰素，,4,保存。,干扰素纯化工艺过程,溶解粗干扰素,沉淀与疏水层析,阴离子交换层析与浓缩,阳离子交换层析与浓缩,凝胶过滤层析,无菌过滤分装,(1),溶解粗干扰素,配制纯化缓冲液：,超纯水，,pH7.5,磷酸缓冲液，,0.45 m,滤器和,10 ku,超滤系统，百级层流下收集。冷却至,2,10,。,检查,:,缓冲液的,pH,值和电导值。,溶解：,2,10,，匀浆，完全溶解。,(2),沉淀与疏水层析,等电点沉淀（,1,）：磷酸调节至,pH5.0,，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。,疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中,除非疏水性蛋白,洗脱与收集：,0.01M,磷酸缓冲液（,pH8.0,）。,等电点沉淀（,2,）：磷酸调节,pH4.5,，调节电导值,40 ms/cm,，,2,10,，静置过夜,超滤：,1000 ku,超滤膜过滤，除去大蛋白。,透析除盐：调整溶液,pH 8.0,，电导值，,10 ku,超滤膜，,0.005 M,缓冲液。,(3),阴离子交换层析与浓缩,0.01M,磷酸缓冲液（,pH8.0,）平衡树脂。,盐浓度线性梯度,5,50 ms/cm,进行洗脱，,配合,SDS-PAGE,收集干扰素峰。浓缩：调整溶液和电导，,10 ku,超滤膜，,0.05M,醋酸缓冲液（,pH5.0,）中透析。,（,4),阳离子交换层析与浓缩,用,0.1M,醋酸缓冲液（,pH 5.0,）平衡树脂。,上样，相同缓冲液冲洗。,盐浓度线性梯度,5,50 ms/cm,进行洗脱,配合,SDS-PAGE,收集干扰素峰。,浓缩：,10 ku,超滤膜进行。,(5),凝胶过滤层析,洗涤液：,0.15 M NaCl,的,0.01M,磷酸缓冲液（,pH7.0,）清洗系统和树脂,上样，相同缓冲液进行洗脱。,合并干扰素部分,(6),无菌过滤分装,0.22 m滤膜过滤干扰素溶液，分装,20以下的冰箱中保存。,(7),检测项目,干扰素鉴别试验,干扰素效价测定,蛋白质含量，纯度测定，分子量,宿主残余蛋白、残余,DNA,干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，,N,端序列,其他：热原，内毒素，残留抗生素,谢谢观看,