实验16-酶切与连接(医学PPT课件).ppt

成都医学院,-,生化与分子生物实验,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验十,限制性酶切与连接,一种能够结合外源,DNA,片段形成重组,DNA,，并能进行自我,复制的,DNA,分子称为,Vectors.,主要载体：质粒、噬菌体、病毒,按功能分类：克隆载体（构建基因组文库或,cDNA,文库）、,测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。,随着生物技术的发展和科学研究的深入，不断出现具有不同功,能的新载体，如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体。,载体（,Vectors,）,结构的三大要素：,多克隆位点,选择标记（耐药性，,LacZ,）,独立的复制单位,由,pUC18,改造而来，大小为,3162bp,。,相当于在,pUC18,中增加了带有,M13,噬菌体,DNA,合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。,（二）材料,模板,DNA,引物：,APO A1-GST2(,载体：,pGEX-6P-1),PrimerGST6p1-APOA1-Up:,5 G,GAATTC,ATG,GATGAACCCCCCCAGAGCC-3,EcoRI,PrimerGST6p1-APOA1-down:,5 CGC,GTCGAC,TCA CTG GGT GTT GAG CTT CT-3,SalI,粘性末端,：,是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。,如,Eco,RI,的识别顺序为：,5 G,|,AATTC 3,3 CTTAA,|,G 5,在双链上交错切割的位置切割后生成,5G AATTC3,3CTTAA G5,各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过,DNA,连接酶的作用而“粘合”。,一、,DNA,的限制性酶切实验原理,核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，功能犹似高等功物免疫系统，用于抗击外来侵袭。,限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的片段端为，端为。,根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为,、,、,型三大类。,第一类（,I,型）限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序，在识别位点很远的地方任意切割,DNA,链，切割核苷酸顺序没有专一性，随机。这类限制性内切酶在,DNA,重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析,DNA,结构或克隆基因。这类酶如,EcoB,、,EcoK,等。,第三类（,III,型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度,DNA,片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。,1.,限制性内切酶的类型,第二类（,型限制性内切酶,就是通常指的限制性内切酶,.,它们能,识别双链的特异顺序,，并在这个顺序内进行切割，,产生特异的片段,；,型酶分子量较小，仅需,Mg,2+,作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序；,型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出、端突出和平末端。,限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。,1.,限制性内切酶的类型,限制性内切酶,酶分子,识别位点,切割位点,限制作用是否需用 ATP,类,三亚基双功能酶,二分非对称,至少在识别位点外 1000bp,Yes,类,内切酶与甲基化酶分子不在一起,4-6bp,大多数为回文对称结构,在识别位点中或靠近识别位点无特异性,No,类,二亚基双功能酶,5-7,bp 非对称,在识别位点下游 24-26bp,Yes,型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出、端突出和平末端。,限制性的内切酶的发现和应用，才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。,粘性末端,：,是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。,如,Eco,RI,的识别顺序为：,5 G,|,AATTC 3,3 CTTAA,|,G 5,在双链上交错切割的位置切割后生成,5G AATTC3,3CTTAA G5,各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过,DNA,连接酶的作用而“粘合”。,II,型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如,Eco,RV,的识别位置是：,5 GAT,|,ATC 3,3 CTA,|,TAG 5,切割后形成,5 GAT ATC 3,3 CTA TAG 5,这种末端同样可以通过,DNA,连接酶连接起来。,平头末端：,用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如,E.coli,用,Eco,表示，所以用斜体字。,用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌,(,Heamophilus,influenzae,)Rd,菌株用,d,，即,Hin,d,。,如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如,Hin,d,Hin,d,，,Hin,d,等。,2.,限制性核酸内切酶的命名法,内切酶：,不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；,注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；,内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定，通常,1u,指在适当条件下，,1,小时内完全酶解,ug,特定底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以,ug,DNA,对,u,酶短时间为宜。,同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；,内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。,注意事项,限制性内切酶酶切,作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、,SDS,、,EDTA,、,高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。,这种抑制可通过：,增加酶作用单位数（,1020U/ug DNA,）、,增大反应体积以稀释可能的抑制剂,或延长反应时间加以克服。,五、注意事项,限制性内切酶酶切,：,反应缓冲液主要由,Tris,HCl,、,NaCl,、,Mg2,+,组成，其中,Mg2,+,为内切酶辅基；,Tris,HCl,维持反应体系,pH,值在,7.2-7.6,之间；,NaCl,浓度不同形成种级别的离子强度：,低盐（,10mM,NaCl,),中盐（,50mM,NaCl,）,高盐（,100mM,NaCl,）,不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。,五、注意事项,限制性内切酶酶切,反应缓冲液：,连接反应,-,连接酶（,ligase,）,ligase,又称,合成酶,，能,催化,两个,分子,连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的,酶,。此反应与,ATP,的分解反应相,偶联,。在把两分子相连接的同时发生,三磷酸腺苷,（,ATP),的,高能磷酸键,的断裂如,DNA,连接酶等,连接酶的催化反应过程需要,Mg,离子,T4 DNA,连接酶催化双链,DNA,相邻核苷酸的,5-,磷酸和,3-,羟基之间的连接，平端和粘端都可被连接。本酶也能,催化,RNA,连接到,DNA,或者双链,RNA,上，但不催化单链核酸的连接。,把一个片段克隆到质粒载体时，采用,1:1,1:3,或,3:1,的载体,:,插入片段摩尔比,连接反应,-T4,连接酶,反应体系：,载体,DNA 100ng,插入片段,DNA 17ng,连接酶,10X,缓冲液,1l,T4 DNA,连接酶,(Weiss,单位,)0.11u,无核酸酶水加至,10ul,2.,孵育反应于：室温下,3,小时，或,4C,过夜，或,15C,，,418,小时。,实验步骤与试剂,（酶切）,反应体系,质粒,pUC18 DNA 2l,PCR,产物,2l,Hind,内切酶,2l,Hind,10,X buffer,2lddH,2,O,12l,总体系为,20 l,，混匀,反应步骤,37C,酶切,2h,65C,灭活,10min,琼脂糖电泳检测,内切酶失活,DNA,不纯，含有,SDS,，,酚，,EDTA,等内切酶抑制因子,条件不适（试剂、温度）,DNA,酶切位点上的碱基被甲基化,DNA,酶切位点上没有甲基化（如,Dpn,I,）,DNA,位点上存在其它修饰,DNA,不存在该酶识别顺序,标准底物检测酶活性,将,DNA,过柱纯化，乙醇沉淀,DNA,检查反应系统是否最佳,换用对,DNA,甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒,DNA,转化至,dcm,-,，,dam-,基因型的细菌菌株,换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA,（如,San3A I,代替,Dpn,I),，,重新将质粒转至,dcm,+dam+,菌株中扩增,将,DNA,底物与,DAN,混匀进行切割验证,换用其它的酶切割,DNA,或过量酶消化进行验证,限制性内切酶酶切,常见问题分析,问题一：,DNA,完全没有被内切酶切割,原因,对,策,内切酶活性下降,内切酶稀释不正确,DNA,不纯，反应条件不佳,内切酶识别的,DNA,位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰,部分,DNA,溶液粘在管壁上,内切酶溶液粘度大，取样不准,酶切后,DNA,粘末端退火,由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性,过度稀释使酶活性降低,反应条件不适,识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序,用,5-10,倍量过量消化,用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶,同上,同上,反应前离心数秒,将内切酶稀释，增大取样体积,电泳前将样品置,65,保温,5-10,分钟，取出后置冰浴骤冷,使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡,适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏,使用最佳反应体系,加大酶量,5-10,倍,问题二：,DNA,切割不完全,原因,对,策,限制性内切酶酶切常见问题分析,内切酶星状活性,其它内切酶污染,底物中含其它,DNA,杂质,检查反应条件：甘油浓度大于,12%,，盐度过低，,Mn2+,的存在及酶：,DNA,值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量,用,DNA,作底物检查酶切结果,电泳检查,DNA,，,换用其它酶切，纯化,DNA,片段,问题三：,DNA,片段数目多于理论值,原因,对,策,限制性内切酶酶切常见问题分析,DNA,定量错误（如,RNA,含量较高）,在酶切反应液中形成非特异的沉淀,用,RNA,酶,A,（无,DNA,酶）,100ug/ml,消化,DNA,样，酚抽提后沉淀溶解，定量,在反应前透析,DNA,样品或用酒精沉淀二次,问题四：酶切后没有观察到,DNA,片段的存在,原因,对,策,限制性内切酶酶切常见问题分析,保存温度不合适,以稀释形式保存,贮藏缓冲液不适当,低蛋白浓度,内切酶贮藏在含,50%,甘油的贮藏液中，应在,-20,低温保存,稀释酶液不宜长期存放，应一次使用使用厂家推荐的贮藏缓冲液,内切酶与,500ug/ml,的,BSA,一起保存,问题五：内切酶保存期内快速失活,原因,对,策,限制性内切酶酶切常见问题分析,DNA,上结合有蛋白质,内切酶中含有,DNA,外切酶,减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶,减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶,问题六：电泳后,DNA,片段的带型弥散，不均一,原因,对,策,DNA,电泳常见问题分析,含磷酸盐的浓度高,内切酶失活不全或含有,ATP,酶,平末端连接,外切酶污染,连接缓冲液不合适,透析，乙醇沉淀去除磷酸盐,延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收,DNA,加大,T4 DNA,Ligase,用量,减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收,DNA,重新配制连接缓冲液,DNA,电泳常见问题分析,问题七,：,酶切后的,DNA,片段连接效率低,原因,对,策,DNA,降解,电泳缓冲液陈旧,所用电泳条件不合适,DNA,上样量过多,DNA,样含盐过高,有蛋白污染,DNA,变性,避免核酸酶污染,电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，,pH,值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液,电泳时电压不应超过,20V/cm,，,温度,30,；巨大,DNA,链电泳，温度应,15,；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力,减少凝胶中,DNA,上样量,电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐,电泳前酚抽提去除蛋白,电泳前勿加热，用,20mM,NaCl,缓冲液稀释,DNA,DNA,电泳常见问题分析,问题一：,DNA,带模糊,原因,对,策,对于,/,Hin,d III,片段,cos,位点复性,电泳条件不合适,DNA,变性,电泳前于,65,加热,DNA 5,分钟，然后在冰上冷却,5,分钟,电泳电压不超过,20V/cm,；,温度,30,；经常更换电泳缓冲液,以,20mM,NaCl,Buffer,稀释,DNA,，,电泳前勿加热,问题二：,不规则,DNA,带迁移,对,策,原因,DNA,电泳常见问题分析,DNA,的上样量不够,DNA,降解,DNA,走出凝胶,对于,EB,染色的,DNA,，,所用光源不合适,增加,DNA,的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低,避免,DNA,的核酸酶污染,缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度,应用短波长（,254nm,）,的紫外光源,问题三：,带弱或无,DNA,带,对,策,原因,DNA,电泳常见问题分析,小,DNA,带走出凝胶,分子大小相近的,DNA,带不易分辨,DNA,变性,DNA,链巨大，常规凝胶电泳不合适,缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度,增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度,电泳前请勿高温加热,DNA,链，以,20mM,NaCl,Buffer,稀释,DNA,在脉冲凝胶电泳上分析,问题四：,DNA,带缺失,对,策,原因,DNA,电泳常见问题分析,重组体筛选与鉴定,转化（,transformation),：,是将异源,DNA,分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。,重组质粒的转化,转化方法,1,、化学的方法,(,热击法,),；使用化学试剂（如,CaCl,）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体,DNA,分子导入受体细胞；,2,、电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体,DNA,分子导入受体细胞。,大肠杆菌感受态细胞的制备、重组质粒的转化及克隆的筛选与鉴定,感受态细胞,(competent cells):,受体细胞经过一些特殊的方法（如,Cacl,2,、,Rucl,等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源,DNA,的载体分子通过的感受态细胞,(competent cell),。,原理,目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的,CaCl2,处理细菌的方法制,备，即用低渗,CaCl,2,溶液在低温（,0,）时处理快速生长的细菌，,从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源,DNA,分子在此,条件下易形成抗,DNA,酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面，,通过热激作用促进细胞对,DNA,的吸收。,在一定条件下，经过连接后的片段与感受态细胞混合保,温，可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的分子通过复,制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性,状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转,化体，即带有异源分子的受体细胞。,实验步骤,1.,挑取一,DH5,单菌落于,5ml LB,培养液中,37,过夜培养,2.,取其中,500ul,菌液于一含,50mlLB,培养液的锥形瓶中，,37,振摇培养至,OD600,值达到,0.5-0.6,之间,3.,取,50ml,菌液置于离心管内，,4 4500g,离心,5,分钟,4.,加入,30ml,100mM,的冰冷,CaCl2,溶液，摇荡重悬细胞，冰浴,30,分钟,5.4 4500g,离心,5,分钟收集细胞后，加,2 ml,100mM,的冰冷,CaCl2,溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液,。,6.,感受态细胞分装成,200l,的小份,暂且不用的贮存于,-70,可保存半年。取其中一份进行转化,。,7.,向转化管中加入,DNA,（不超过,10ul,）,轻度摇晃混合后于冰上放置,30,分钟,。,8.,将上述混合物转移到预热到,42,的水浴锅中，热休克,90,秒,(,不要摇动试管,),，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却,1,2,分钟,。,9.,向管内加入,800ul,的,LB,培养液。然后,37,培养,45,分钟,。,10.,取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的,LB,固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟,11.,倒置平板于,37,培养,12,16,个小时。,重组质粒的转化,（热激法）,1,、冰上融化感受态细胞；,2,、将,10ul,连接产物加入到,100ul,感受态细胞，冰浴,40min,；,3,、,42,热激,90s,，勿摇动！,4,、热激后立马放置冰上,1-2min,；,5,、加,400ulLB,液体培养基，置摇床，,37,，,70-100rpm 1h,；,6,、涂平板。,四、实验注意事项,为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素,：,1.,细胞生长状态和密度,:,细胞生长密度以刚进入对数生长期时,为好，可通过监测培养液的,OD600,来控制。,2.,质粒的质量和浓度,:,用于转化的质粒,DNA,应主要是超螺旋态,DNA(cccDNA,),。一般情况下,DNA,溶液的体积不应超过感受态细胞体积的,5,。,3.,试剂的质量,:,所用的试剂,如,CaCl2,等均需是最高纯度的,(GR.,或,AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。,4.,防止杂菌和杂,DNA,的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行。,试剂：,1.LB,固体和液体培养基。,2.,含特定抗生素的,LB,固体培养基。,3.,100mM,CaCl2,溶液。,4.,含,15%,甘油的,0.05mol/L CaCl2:,称取,0.28g CaCl2(,无水,分析纯,),溶于,50ml,重蒸水中,加入,15ml,甘油,定容至,100ml,高压灭菌。,5.,待转化质粒。,克隆的筛选与鉴定,不同抗生素基因筛选,常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源,DNA,分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时并不能确定哪个克隆含有插入片段。,一、抗药性标记及其插入失活选择法,pBR322,质粒上有两个抗菌素抗性基因,:,Tet,r,和,Amp,r,。,Tet,r,上有插入位点,BamH,I,和,Sal I;,Amp,r,上有插入位点,Pst,I,。,一,载体表型选择法,1.,原理：,（,1,）四环素：,（,2,）氨苄青霉素抗性基因：,产生,-,内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘,-,青霉素指示液（,I,2,-KI-Aampicillin,）（,蓝灰色）褪色。,抑制细菌生长，但不杀死细菌。,杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。,（,3,）环丝氨酸：,3.,选择过程：,如果在,Tet,r,上插入外源,DNA,，,导致四环素抗性基因失活，可用,四环素加环丝氨酸,平板培养基选择重组克隆。,Tet,r,失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；,Tet,r,不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。,（,1,）四环素抗性插入失活,无环丝氨酸培养基,（,2,）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程,如果,Amp,r,上插入外源,DNA,，,导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘,-,青霉素指示液选择。,利用插入的外源基因的,表达产物,特性进行直接选择。（只在特定条件下）。,转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。,一、原理：,二,根据插入基因的表型选择,1.,弥补缺陷,his,-,his,+,受体菌：,外源基因：,在不含组氨酸的培养基中生长,小鼠的二轻叶酸还原酶（,DHFR,）,对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。,DHFR,载体,连接,转化受体菌,三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板,含,DHFR,的克隆才能生长,例：,使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。,2.,增加新性状,利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。,一、直接电泳检测法,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。,三,DNA,电泳检测法,分子量,Marker,载体,重组克隆,二、酶切电泳筛选法,1.,原理：,根据已知的外源,DNA,序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（,DNA,带数和长度）。,或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。,A,B,A,或,B筛选过程,三、,PCR,扩增检测法,1.,原理,PCR,能在模板序列上扩增出预期,DNA,片断。,2.,过程,（,1,）从重组克隆中提取质粒（或,DNA,）。,（,2,）用外源,DNA,插入片断引物作,PCR,。,（,3,）电泳,PCR,产物。,（,4,）检查是否有,PCR,产物。,（,5,）,PCR,产物的长度是否与外源基因一致。,1.,核酸,杂交,四,核酸杂交检测法,一、原理：,重组克隆与探针杂交。,3.,识别标记,32,P,或,125,I,。,（,1,）放射性同位素,2.,检测用的探针,与外源,DNA,插入片断互补的序列。,（,2,）非放射性标记,荧光素,二、核酸杂交检测方法,用,DNA,（或,RNA,）,探针检测,DNA,样品。,1.Southern blotting,从宿主细胞中提取,DNA,（,或质粒载体），再用探针杂交。,只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。,酶切前,酶切后,插入片断,载体,Southern blot,筛选结果,（,1,）原位杂交筛选,特点：,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,（,2,）,R-,环检测法,DNA-RNA,杂交。,1,）原理：,2,）选择过程,在,70%,甲酰胺中，把,DNA,双链变性，复性的时候，,DNA-RNA,杂交分子比,DNA-DNA,双链更稳定。电镜下可见一种,R-,环形结构。,用外源基因的,mRNA,与重组载体杂交。,缺点：需要电镜！,2.Northern blotting,用,DNA,（或,RNA,）,探针检测,RNA,样品。,主要检测插入片断是否被转录。,从宿主细胞中提取,RNA,，,再用探针杂交。,利用抗体作为,“,探针,”,来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。,根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：,一、放射性抗体检测法,五,免疫化学检测法,1.,抗体与产物的结合方式,对表达产物的检测。蛋白,蛋白,“,杂交,”,待测基因,产物蛋白,一抗,二抗,125,I,标记的二,抗结合蛋白,固相支持滤膜,待测基因,产物蛋白,一抗,125,I,标记的二抗,固相支持滤膜,待测基因,产物蛋白,一抗,固相支持滤膜,固相支持滤膜,待测基因,产物蛋白,一抗,二抗,125,I,标记的二抗,结合蛋白,125,I,标记的二抗,2.,放射性抗体检测法过程,3.Broome-Gilbert,双位点检测法,质粒基因,A,插入基因,B,表达,质粒蛋白,A,外源蛋白,B,融合蛋白,检测融合蛋白。,既检测外源基因产物又检测载体基因产物。,固相支,持滤膜,抗,A,抗体,125,I,标记的,抗,B,抗体,质粒蛋白,A,外源蛋白,B,质粒蛋白,A,外源蛋白,B,固相支,持滤膜,抗,A,抗体,发光，底片曝光,二、免疫沉淀检测法,把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成,“,沉淀圈,”,。,1.,原理,抗原,抗体凝集反应。,检测分泌型产物。,2.,方法,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。,三、酶联免疫吸附测定（,ELISA,）,E,nzyme-,l,inked,i,mmuno,s,orbant,a,ssay,1.,原理：,一抗（,primary antibody,）,:,与目标分子的特异结合。,二抗（,secondary antibody,）：,与一抗的特异性结合。,酶连（,enzyme-,linke,）,：,二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。,四、免疫印迹（,western blotting,）,法,1.,原理：,在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。,（,1,）,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。,SDS:,（,SDS-PAGE,）：,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,PAGE,）：,（,P,oly,a,crylamide,g,el,e,lectrophoresis,）,在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。,电泳,buffer,电泳,buffer,点样,电泳方向,蛋白质电泳的分子量标准,已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。,商品化供应,Da,道尔顿,(,质量单位,等于一氧原子质量的十六分之一。,一克约为,6,10,23,道尔顿,Dalton,SDS PAGE,凝胶中的蛋白质染色：,考马斯亮蓝：,灵敏度底、只能检出,0.3-1,g/,带，但可褪色回收。,硝酸银：,灵敏度高、可检出,2-5ng/,带。,2,）转到膜上进行染色。,1,）直接染色,直接染色电泳结果,（,2,）,Western blotting,电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、,PVDF,膜、中性尼龙膜等）。,Western,（,转膜）,胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。,膜,胶,蛋白,Western,装置,Blotting,原理与,ELISA,相同。,待测蛋白,硝酸纤,维素膜,一抗,二抗,辣根过氧,化物酶,底物,产物，,并发出光,PAGE,胶,待测蛋白,底片曝光,辣根过氧化物酶：,HRPO,1,）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与,膜上的蛋白结合。,2,）洗去未结合的一抗。,3,）用二抗与一抗结合（二抗上带有,HRPO,）。,4,）清洗掉未结合的二抗。,5,）用,HRPO,的底物浸泡膜。,6暗室里曝光，冲洗胶片。,Blotting,过程,Immuno,Blotting,结果,多克隆抗体,Blotting,的结果,单抗,blotting,结果,一、无细胞翻译系统,第六节,转译筛选法,能把外源的,mRNA,翻译成蛋白质的细胞提取物。如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。,借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。,适用于,mRNA,转录丰度高的外源基因。,二、转译筛选,mRNA,无细胞翻译系统,35,S,标记的,甲硫氨酸,翻译,35,S,标记的肽链,PAGE,电泳,放射自显影,比较放射性,带纹的位置,载体,+,外源,DNA转录,与预期的产物分子量相符？,三、杂交抑制转译法,mRNA,一旦与,DNA,杂交成,RNA-DNA,双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。,1.,原理,2.,过程,专门设计检测能同,DNA,特异结合的蛋白质因子。,待测蛋白质,硝,酸,纤,维,素,滤,膜,能与蛋白质结,合的,DNA,序列,放射性标记,待测蛋白质,硝,酸,纤,维,素,滤,膜,能与蛋白质结,合的,DNA,序列,放射性标记,五、,DNA-,蛋白质相互作用筛选法,一般克隆与筛选策略,二、植物转化体报道基因筛选法,（,1,）,大肠杆菌的,-D-,葡萄糖醛酸糖苷酶,（,-D-,g,luc,u,ronida,s,e,，,GUS,2,）,细菌和萤火虫的荧光素酶,（,luciferase,）；,（,3,）,水母绿色荧光蛋白（,GFP,）,基因,（,G,reen,F,luorescent,P,rotein,）。,1.,报道基因（,reporter gene),（,4,）其它,2.,几种报道基因的作用原理,4-,甲,-,-D-,葡糖醛酸,荧光产物,GUS,GFP,紫外光照,发绿色荧光,5-,溴,-4-,氯,-3-,吲哚,-,-D-,葡糖醛酸,蓝色水解产物,GUS,Fireflies emit light catalyzed by,luciferase,with ATP,转入萤火虫的,luciferase,的烟草,半乳糖苷酶系统筛选（蓝,/,白斑筛选）,-,互补现象：,因为许多载体都带有一个,半乳糖苷酶,（,Lac,Z,）,基因的调控序列和头,146,个氨基酸的编码信息，编码,-,互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型,-,半乳糖苷酶实现基因内互补（,-,互补,）。,当这种载体转入可编码,半乳糖苷酶,C,端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基,-D,硫代半乳糖苷（,IPTG,）的诱导下，,宿主可同时合成这两种肽段，,虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为,-,互补现象。,由互补产生的,半乳糖苷酶,(,Lac,Z,),能够作用于生色底物,5,溴,4,氯,3,吲哚,D,半乳糖苷,(X-gal),而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源,DNA,片段时，会造成,Lac,Z,(,),基因的失活，破坏,-,互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。,-,半乳糖苷酶使,Xgal,分解成兰色产物。,其他鉴定方法,鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有,-,互补、小规模制备质粒,DNA,进行酶切分析、插入失活、,PCR,以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒,DNA,进行酶切分析，对于带有,Lac,Z,基因的载体还可以结合,-,互补现象来筛选。,The end!,