第四章-灭菌(2013).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,5 灭菌,5.1 杂菌污染的危害,5.2 培养基的湿热灭菌,5.3 空气除菌,1、杂菌污染的危害,消耗营养;,5.1,杂菌污染,合成新产物，菌体自溶、发粘等造成分离困难,；,分解产物；,改变,pH,，使生物化学反应发生变化；,噬菌体破坏极大。,种子扩大培养时期,:,灭菌后弃去；,（,2,）不同发酵时期染菌对发酵的影响,发酵前期染菌,:,重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种；,发酵中期染菌：,挽救困难，应早发现，快处理，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定,抗生素发酵,柠檬酸发酵,污染细菌：加大通风，加速产酸，调,pH3.0,，抑制细菌,b.,污染酵母：加入,0.0250.035g/L CuSO4,抑制酵母；通风加大，加速产酸。,不同发酵时期染菌对发酵的影响,c.,染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH,下降，黄曲霉自溶。,d.,青霉菌：在,pH,很低下能够生长。提前放罐,发酵后期染菌,染菌量不太多，可继续发酵,污染严重，则提前放罐,杀菌剂的添加：,前期无必要，增加成本,；,发现后加入，效果要具体评价,(3)染菌的检查与类型的判断,显微镜检查法,平板划线检查法,：,菌落,2、纯种培养，采取措施：,设备灭菌并确保不泄漏；,所用培养基必须灭菌；,通入的气体过滤除菌；,种子无污染，确保纯种；,补料要灭菌，确保无污染。,4、灭菌的方法,化学法,化学药品灭菌法,物理法,干热灭菌法,湿热灭菌法,射线灭菌法,5.2培养基湿热灭菌,5.2.1,湿热灭菌原理,5.2.2,分批灭菌（实罐灭菌）,5.2.3,连续灭菌（连消）,5.2.4,分批灭菌与连续灭菌的比较,5.2.1,微生物死亡速率与理论灭菌时间,达到要求的无菌程度（10,-3,）,尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，由两个基本类型的反应引起的：,培养基中不同营养成分间的相互作用；,对热不稳定的组分分解；,一、培养基灭菌的要求,:,二、湿热灭菌的原理,原理,：高温的蒸汽使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子等大分子发生变性，使微生物死亡。,灭菌效果,：穿透力强，湿热灭菌对耐热芽胞杆菌，温度升高,10,时，灭菌速率常数可增加,8,10,倍，对营养细胞更高。,需要的温度和时间,取决于：,杂菌孢子的热灭死动力学,反应器的形式和操作方式,培养基中有效成分受热破坏的可接受范围,三、培养基湿热灭菌需解决的工程问题,1.热阻,定义：指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。,可用,比死亡速率常数k,来表示,。,k,，,热阻,t,2 反应速度常数k,在相同的温度下，k值愈小，则此微生物愈耐热。,细菌芽孢的,k,值比营养细胞小得多，即细菌芽孢耐热性比营养细胞大。,同一种微生物在不同的灭菌温度下，,k,值不同，灭菌温度愈低，,k,值愈小；温度愈高，,k,值愈大。,提高灭菌温度，,k,值增大，灭菌时间显著缩短。,当温度T一定时，k随微生物不同而不同，具体计算时，可取细菌芽孢的k值为标准。,存活率,N,N,0,对时间,t,在半对数坐标上标绘，可以得到一条直线，其斜率的绝对值即为比死亡速率,k,。,k,值越大，表明微生物越容易死亡。,大肠杆菌在不同温度下,的残留曲线,嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线,各种微生物对湿热的相对热阻,相对热阻,：指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。,比热死亡速率常数k与灭菌温度T的关系可用阿累尼乌斯方程表征,（,4,）温度对,K,的影响,A,：系数（,s,-1,）,E,：活化能（,J/mol,）,R,：气体常数，,8.314 J/,（,mol.k,）,T,：绝对温度，,K,活化能,E,的大小对,K,值有重大影响。其它条件相同时，,E,越高，,K,越低，热死速率越慢。,(3-7),不同菌的孢子的热死灭反应,E,可能各不相同。,对上式两边取对数，得,K,是,E,和,T,的函数,(3-8),1/T,K,（,min,-1,）,2.微生物热死定律：,在一定温度下，微生物,受热致死,遵循分子反应速度理论，微生物受热死亡的速率,-dN/dt,与任何瞬间残留的活菌数,N,成正比，即,当,N,t,=0,时，,t=，,既无意义，也不可能。,一般采用,N,t,=0.001，,即,1000,次灭菌中只有一次失败,。,两边取对数得：,(3-5),或,(3-6),灭菌时间取决：,污染程度（,N,0,）,灭菌程度（,N,t,）,k,值,3.灭菌温度和时间的选择,培养物质受热破坏也可看作一级反应：,式中,C：,对热不稳定物质的浓度；,k：,分解速度常数,；,k,的变化也遵循阿累尼乌斯方程：,都与相应的活化能及,T,有关,当,T,1,T,2,(k,2,/k,1,)/(k,2,/k,1,)=E/E1 (EE),随着,T,上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分分解速率增加倍数，故一般选择高温快速灭菌。,3.,灭菌温度和时间的选择,大多数细菌芽孢的杀灭温度和时间,温度,(),100,110,115,121,125,130,时间（,min,）,1200,150,51,15,6.4,2.4,不同温度下灭菌时间及培养基营养成分破坏情况,温度,(),时间（,min,）,营养成分破坏（,%,）,温度,(),时间（,min,）,营养成分破坏（,%,）,100,400,99.3,130,0.5,8,110,30,67,140,0.08,2,115,15,50,150,0.01,1,120,4,27,结论,采用高温快速灭菌的方法，既可达到灭菌的目的，又可减少营养物质的破坏，通常为,121,，,20,30min,培养基成分,pH值,培养基中的颗粒,泡沫,影响培养基灭菌的因素除了所污染杂菌的种类、数量、灭菌温度和时间外，还有其它一些因素：,4.,影响培养基灭菌的因素,油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性，高浓度有机物会包于细胞周围形成一层薄膜，影响热的传递；在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。,（,1,）培养基成分,2.,影响培养基灭菌的因素,pH值对微生物的耐热性影响很大。,pH值6.08.0，微生物最耐热；,pH值6.0，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡。,所以，pH值愈低，灭菌所需的时间愈短。,2.,影响培养基灭菌的因素（续）,（,2,）,pH,值,培养基中的颗粒小，灭菌容易；颗粒大，灭菌难。,一般含有1mm的颗粒对培养基灭菌影响不大，但颗粒大时，影响灭菌效果，应过滤除去。,（,3,）培养基中的颗粒,2.,影响培养基灭菌的因素（续）,培养基的泡沫对灭菌极为不利,，因为泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物。,对易产生泡沫的培养基在灭菌时，可加入少量消泡剂。,对有泡沫的培养基进行连续灭菌时更应注意。,液膜,空气,空气,（,4,）泡沫,2.,影响培养基灭菌的因素（续）,升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式,(N/N,0)=-kt,来粗略估算灭菌所需时间。,（二）分批灭菌（实罐灭菌）,2.灭菌时间的估算,有一发酵罐内装,40m,3,培养基，在,121,0,C,温度下实罐灭菌，原污染程度为每,1,ml,有,210,5,个耐热细菌芽孢，已知,121,0,C,时灭菌速度常数,k=1.8min,-1,，求灭菌失败机率为,0.001,时所需时间。,解,：,N0=4010,6,210,5,=810,12,(,个,),Nt=0.001(,个,)k=1.8(min-1),(Nt/N0)=-kt,t=2.303/klg(N0/Nt)=2.303/1.8lg(810,15,),=20.34(min),由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培养基加热至,100,0,C,以上，这个作用较为显著，故实际保温阶段时间比计算值要短。,武汉市2009年度事业单位公开招考生物工程试题,简述题（每题5分，共10分）,1、简述生物反应过程的特点。,2试述SDS-凝胶电泳测定酶蛋白相对分子质量的原理。,计算题（每题10分，共20分）,1、有一发酵罐装50M,3,培养基，在温度为121进行实罐灭菌。原污染程度为每毫升有2x10,5,个耐热的细菌芽孢，121时灭菌速率常数为2.0min-1.求失败几率为0.001时所需要的灭菌时间。,2、测定碳酸钠试样含量，称取试样0.2440克，以盐酸标准溶液滴定终点时消耗0.2020摩尔每升的盐酸溶液21.20毫升，求试样中碳酸纳的含量。,（三）连续灭菌（连消）,工艺流程,喷淋冷却连续灭菌流程,喷射加热连续灭菌流程,薄板式换热器连续灭菌流程,灭菌时间的计算,(C,t,/C,0,)=kt t=2.303/klg(C,0,/C,t,),式中：,C,0,、C,t,分别为单位体积培养基灭菌前、后的含菌数。,例2某发酵罐内装40m,3,培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为131,0,C，原污染程度为每1ml含有210,5,个杂菌，已知131,0,C时灭菌速度常数为15min,-1,，求灭菌所需的维持时间。,连续灭菌时间的估算,解：,C,0,=210,5,(,个,/ml),C,t,=0.001/(40106,)=2.510,-11,(,个,/ml),t=2.303/klg(C,0,/C,t,)=2.303/15lg(210,5,)/(2.510,-11,),=2.37 min,喷淋冷却连续灭菌流程,分批灭菌与连续灭菌的比较,连续灭菌的优点：（适用于大型罐）,可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；,发酵罐利用率高；,蒸汽负荷均衡；,采用板式换热器时，可节约大量能量；,适宜采用自动控制，劳动强度小；,可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。,缺点：,对小型罐无优势，不方便，对设备要求高；,蒸汽波动时灭菌不彻底；,当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。,分批灭菌与连续灭菌的比较,三、少量培养基的灭菌,手提式灭菌锅结构示意图,手提式,立式,台式,卧式,5.3、空气除菌,（一）,概述,（二）,空气除菌的方法,（三）,空气介质过滤,流程,（四）,空气过滤除菌原理,（五）,空气过滤介质,（六）几种典型,介质过滤除菌的工艺,（一）概述,1、大多数生物培养都需要氧气，通常以空气作为氧源。,无菌空气是将自然界的空气经过压缩、冷却、减湿、过滤等过程。,2、空气除菌的必要性,一个50m,3,的发酵罐，若装料系数为0.7，每立方米发酵液每分钟通气0.8m,3,，培养周期170h，每个周期需通气量2.8610,5,m,3,，而每立方米大气中约有10,3,-10,4,个微生物。,3、空气中微生物的数量与环境有密切关系,一般干燥寒冷的北方，空气中含微生物量较少，而湿润温暖的南方空气中含微生物较多；,城市空气中的微生物含量（10,3,-10,4,个/m,3,）比人口稀少的农村多；,地平面空气中微生物含量比高空多。,连续提供一定流量的压缩空气。,4,、发酵对无菌空气的要求,空气的压强,(,表压,),为,0.20.4MPa,。,进入过滤器之前，空气的相对湿度小于,70,。,进入发酵罐的空气温度可比培养温度高,10,。,压缩空气的洁净度，在设计空气过滤器时，一般取失败概率为,l0,-3,为指标。,（二）空气除菌的方法,辐射灭菌加热灭菌,静电除菌,介质过滤,1、辐射灭菌,原理,射线、,X,射线、,射线、,射线、紫外线、超声波等能破坏微生物的核酸或蛋白质，从而起到杀菌作用。,应用范围,通常用于无菌室和医院手术室。,缺点,杀菌效率较低，杀菌时间较长。一般要结合甲醛蒸汽等来保证无菌室的无菌程度。,加热灭菌,加热杀菌：加热方法可用蒸汽、电和,空气压缩机,产生的热量,空气进口温度为,21,，出口温度为,187198,，压力为,0.7MPa,。,原理,高压产生电晕，电晕使空气分子电离为带正电和负电荷的空气离子，遇到空气中固体微粒和液体微粒，使后者带上电荷分别向两极运动，利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘、除菌的目的。,3,、静电除菌,2、优点 阻力小，染菌率低，除水、除油的效果好，耗电少,3、缺点,设备庞大、一次性投资较大、捕集率尚嫌不够，需要采取其它措施。,定义：让含菌空气通过过滤介质，以阻截空气中所含微生物，而取得无菌空气的方法。,通过过滤除菌处理的空气可达到无菌，并有足够的压力和适宜的温度以供好氧培养过程之用。,广泛应用，是获得大量无菌空气的常规方法。,4.,介质过滤除菌法,按过滤机制的不同,绝对过滤,利用微孔滤膜，其孔隙小于,0.5,甚至,0.1m,，将空气中的细菌滤除，从而获得无菌空气。,深层介质过滤,由多种介质组成过滤层，滤层较深，空隙较大，靠静电、扩散、惯性和阻截作用等将细菌截留在滤层中，从而获得无菌空气。,（三）空气除菌流程图,两级冷却、加热除菌流程图,1-,粗过滤器；,2-,空压机；,3-,贮罐；,4,，,6-,冷却器；,5-,旋风分离器；,7-,丝网分离器；,8-,加热器；,9-,过滤器,1、空气预处理,除尘,(,外源空气的前处理,),：防塞，提高过滤效率和滤器寿命；,降温,：防烧伤介质及水分蒸发严重，对发酵不利；,除油、除水：防塞（因油膜堵），防止过滤器长菌堵塞（因水滴）,加热：保持相对湿度,稳压：防止压力波动，贮罐,措施：建吸风塔、粗过滤器,（,布袋过滤器、填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高效前置过滤器,粗过滤器,安装在空压机吸入口前，拦截空气中较大的微尘以保护空气压缩机，起到一定的除菌作用，减轻总过滤器的负担。,粗过滤器应具有阻力小、容尘量大的特点，否则会成为阻力而影响压缩机吸气。,采风塔,采风塔应建在工厂的上风头，远离烟囱。,1,、空气预处理,过滤器经常被认为是一种简单的网或筛子，过滤,/,分离是在一个平面上进行的。,空气过滤器的滤材具有深度。,“,弯曲通道,”,的结果对于污染物的去除起到了辅助作用,“,弯曲通道”存在于：,空气压缩机 提供动力，以克服随后各设备的阻力。,空气贮罐 消除压缩空气的脉动。,冷却器,空压机出气温一般在,120,左右，必须冷却。空气中含水量较高时，为了避免过滤介质受潮而失效，冷却还可以达到降湿的目的。,气液分离设备,冷却后的压缩空气，带有空压机的润滑油。如果冷却温度低于露点，空气中还会有水。所以在冷却器后面安置了气液分离设备，除去空气中的水和油，以保护过滤介质。,空气加热设备,压缩空气经旋风分离器与丝网除沫器把夹带在空气中的液滴、雾沫除掉后。相对湿度仍为100(假设冷却到露点以下),在进入总过滤器之前为了把空气的相对湿度从100降低到70以下。,空气中的微生物菌体是依靠气流通过过滤介质时，由于滤层纤维的层层阻碍，迫使空气在流动过程中多次改变气流速度大小和方向的绕行运动，从而导致微生物微粒与滤层纤维间的产生撞击、拦截、布朗运动、重力及静电引力等运动，从而把微生物微粒截留、捕捉在纤维表面上，实现过滤的目的。,（四）介质过滤除菌机理,1、介质过滤除菌的机理,滤材,孔,过滤除菌,利用有孔介质从气体中除去微生物,洁净气体,含微生物的气体,2、空气过滤器的功能,从气体中去除污染物（微生物），得到所需的气体的无菌程度,第一类为绝对过滤 介质孔隙小于被拦截的微生物大小。如用聚四氟乙烯或者纤维素酯材料做成的微孔滤膜；,第二类为深层过滤 介质孔隙大于被拦截的微生物大小但介质层有一定的厚度。机理是静电、扩散、惯性及拦截作用，如棉花过滤器、超细玻璃纤维纸、石棉滤板等。,3、过 滤 机 理,直接拦截,惯性撞击,扩散拦截,直接拦截,流体中的基本过滤机制,本质是一种筛分效应，机械拦截颗粒，,当颗粒大于流道孔径时即被该结构去除,例如：一种简单的筛网可以拦截尺寸,大于其孔径的颗粒,直接拦截,绝对截留,-,颗粒被捕获在滤材纤维之间形成的孔中,颗粒大于孔径,直接拦截,通过搭桥作用，尺寸小于滤孔的颗粒也可被拦截,不规则形状的颗粒,/,方向性,多个颗粒同时撞击到同一个滤孔,不规则形状的搭桥,多个小颗粒的搭桥,2、惯性撞击,尺寸小于滤材孔径的颗粒的主要拦截方式,当微生物等颗粒随空气以一定速度流动，在接近纤维时，气流碰动纤维受阻，空气就改变运动方向饶过纤维继续前进。,微生物颗粒由于具有一定质量和线速度而具有直线 运动的惯性，颗粒离开流体主流而撞击到滤材上，由于摩擦、黏附作用，被滞留。,惯性撞击,惯性撞击,当流体改变运动方向时，惯性使颗粒 撞击到滤材表面并由于吸附力而停留,惯性撞击,当流经过滤介质时流体必须沿弯曲通道行进,增加过滤机制的有效性。,3,、吸附,表面相互作用,电荷不同,范德华力,(Van der Waals),拦截尺寸小于滤孔的颗粒,由于,:,吸附,表面作用,4、扩散拦截,气体分子(作随机运动)碰撞小颗粒或雾滴,布朗运动(Brownian motion)碰撞的结果，,增加了颗粒碰撞过滤介质的机会,仅在气体中有效,扩散拦截,扩散拦截,气体分子作布朗运动,扩散拦截,被随机运动的气体分子碰撞的颗粒,撞击到过滤介质上并被吸附截留,扩散拦截,当流经过滤介质时流体必须沿弯曲通道行进。这将增加过滤机制的有效性。,5,、小结,过滤介质的过滤,/,分离效率由于,直接拦截,惯性撞击,扩散拦截,的共同作用而增强,过滤机理总结,直接拦截,惯性撞击,扩散拦截,（五）、过滤介质的类型,表面过滤介质,:,编织网粉末烧结,深度过滤介质,:,纤维材料结构,棉花,活性炭或玻璃纤维,有机合成纤维,浇铸膜结构,过滤器的结构,1、深层棉花、活性炭过滤器,立式圆筒形，内部填充过滤介质，以达到除菌的目的。,填充物的装填顺序如下：孔板铁丝网麻布棉花麻布活性碳麻布棉花麻布铁丝网孔板,2、滤纸过滤器,3、金属过滤器,（1）过滤器,外壳图,外壳滤芯接口图,外壳示意图,4、膜过滤,（1）示意图,（六）、介质过滤除菌的工艺,空气过滤除菌流程是按生产对无菌空气要求具备的参数，根据空气的性质而制订的，同时还要结合吸气环境的空气条件和所用设备的特性进行考虑。,对于一般要求的低压无菌空气，可直接采用一般鼓风机增压后进入过滤器，经一、二次过滤除菌而制得。,而一般的深层通气发酵，除要求无菌空气具有必要的无菌程度外，还要具有一定的压力，这就需要比较复杂的空气除菌流程。,一、对空气除菌流程的要求,流程的设备：,主设备：空气压缩机,附属设备：要求尽量采用新技术，提高效率，减少设备，精简设备流程，降低设备投资、运转费用和动力捎耗，简便操作。,流程的制订应考虑：,地理、气候环境,设备条件,二、空气过滤除菌流程的分析,发酵厂所使用的空气除菌流程，随各地的气候条件及设备条件不同而有很大的差别。,要保持过滤器有比较高的过滤效率，应维持一定的气流速度和不受油、水的干扰。气流速度可由操作来控制；要保持不受油、水干扰则要有一系列冷却、分离、加热的设备来保证空气的相对湿度在,5060,的条件下过滤。,1,、两级冷却、分离、加热的空气过滤除菌流程,流程的特点是：两次冷却，两次分离，适当加热。,两级冷却、加热除菌流程图,1-,粗过滤器；,2-,空压机；,3-,贮罐；,4,，,6-,冷却器；,5-,旋风分离器；,7-,丝网分离器；,8-,加热器；,9-,过滤器,2,、冷热空气直接混合式空气过滤除菌流程,特点：可省第二冷却分离设备和空气再加热设备，流程比较简单，冷却水用量较少，利用压缩空气的热量来提高空气温度。,冷热空气直接混合式空气除菌流程图,1-,粗过滤器；,2-,压缩机；,3-,贮罐；,4-,冷却器；,5-,丝网分离器；,6-,过滤器,3,、高效前置过滤除菌流程,特点：无菌程度高,高效前置过滤空气除菌流程图,1,高效前置过滤器；,2,压缩机；,3,贮罐；,4,冷却器；,5,丝网分离器；,6,加热器；,7,过滤器,2、空气贮罐,作用：是消除压缩机排出空气量的脉动，维持稳定的空气压力，同时也可以利用重力沉降作用分离部分油雾。,贮罐的大小可按下面的经验公式计算：,