产γ-氨基丁酸贝莱斯芽孢杆菌CLYB1的鉴定及基因组改组选育研究.pdf

迟燕平，苗新宇，王景会，等.产-氨基丁酸贝莱斯芽孢杆菌 CLYB1 的鉴定及基因组改组选育研究 J.食品工业科技，2023，44（19）：167173.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023040233CHI Yanping,MIAO Xinyu,WANG Jinghui,et al.Identification and Breeding with Genome Shuffling Strain CLYB1 Producing-Aminobutyric AcidJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(19):167173.(in Chinese with English abstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2023040233 生物工程 产产-氨基丁酸贝莱斯芽孢杆氨基丁酸贝莱斯芽孢杆菌菌 CLYB1 的鉴定的鉴定及基因组改组选育研究及基因组改组选育研究迟燕平，苗新宇，王景会，苏颖，牛红红，孙慕白，李达，华梅，代永刚*（吉林省农业科学院农产品加工研究所，吉林长春 130033）摘要：为了提高-氨基丁酸产量，本研究采用紫外诱变和基因组改组技术处理筛选鉴定的产-氨基丁酸菌株CLYB1，并对改组后的菌株进行溶血试验和抗生素敏感性试验。结果表明：产-氨基丁酸菌株 CLYB1 为贝莱斯芽孢杆菌 Bacillus velezensis，产量为 3.95 g/L。对菌株 CLYB1 进行紫外诱变，得到菌株 CLYB1-Y，-氨基丁酸产量为 10.26 g/L，比出发菌株 CLYB1 的-氨基丁酸产量提高 160%。通过基因组改组得到菌株 CLYB1-YC，-氨基丁酸产量为 20.19 g/L，比出发菌株 CLYB1 提高 411%。改组菌株进行菌株溶血试验和抗生素敏感性试验，CLYB1-YC 没有溶血环出现，无溶血性，对青霉素、氨苄西林、头孢曲松、庆大霉素、四环素、红霉素、环丙沙星、林可霉素、氯霉素、复方新诺明 10 种常见抗生素均敏感，菌株安全性良好。贝莱斯芽孢杆菌 CLYB1 通过基因组改组可以提高-氨基丁酸产量，菌株具有更好的应用开发价值。关键词：贝莱斯芽孢杆菌 CLYB1，-氨基丁酸，鉴定，诱变，基因组改组本文网刊:中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）19016707DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2023040233IdentificationandBreedingwithGenomeShufflingStrainCLYB1Producing-AminobutyricAcidCHIYanping，MIAOXinyu，WANGJinghui，SUYing，NIUHonghong，SUNMubai，LIDa，HUAMei，DAIYonggang*（Institute of Argo-food Technology,Jilin Academy of Agricultural Science,Changchun 130033,China）Abstract：In order to improve the yield of-aminobutyric acid(GABA),strain CLYB1 was bred with ultraviolet mutage-nesis and genome shuffling to produce high yield of GABA.After breeding，the hemolysis experiments and antibioticsensitivity test were carried out on the recombinant strain.The strain CLYB1 was Bacillus velezensis,and the yield ofGABA was 3.95 g/L.The GABA yield of CLYB1-Y breeding by ultraviolet mutagenesis from CLYB1 was 10.26 g/L,which was 160%higher than that of CLYB1.The GABA yield of CLYB1-YC breeding by genome shuffling from CLYB1-Y was 20.19 g/L,which was 411%higher than that of CLYB1.The hemolysis experiments and antibiotic sensitivity testsshowed that CLYB1-YC had no hemolytic activity and was sensitive to 10 common antibiotics(penicillin,ampicillin,ceftriaxone,gentamycin,tetracycline,erythromycin,ciprofloxacin,lincomycin,chloramphenicol and puromyn).TheBacillus velezensis CLYB1-YC breeding by genome shuffling producing high-aminobutyric acid has a good applicationprospect.Keywords：Bacillus velezensis CLYB1；-aminobutyric acid；identification；mutagenesis；genome shuffling 收稿日期：20230425 基金项目：吉林省中青年科技创新创业卓越人才（团队）项目（创新类）（20210509029RQ）。作者简介：迟燕平（1977），女，博士，研究员，研究方向：食品微生物，E-mail：。*通信作者：代永刚（1976），男，硕士，研究员，研究方向：粮油加工，E-mail：。第 44 卷 第 19 期食品工业科技Vol.44 No.192023 年 10 月Science and Technology of Food IndustryOct.2023-氨基丁酸（-aminobutyric acid，GABA）是一种重要的抑制性神经递质，具有降血压、抗抑郁，抗惊厥、镇静安神的作用，既有利于心脑血压的缓解，又能促进人体内氨基酸代谢平衡12。-氨基丁酸作为一种新食品原料，具有很高的生理活性，越来越受到人们的关注，并逐渐应用于食品、医药等领域34。因此，GABA 的合成越来越受到人们重视。化学法合成-氨基丁酸成本高，得率低，并且在生产工艺中使用危险溶剂，不是天然食品添加剂，不能应用于食品56。生物合成法相比较来说是一种既安全、又低成本的方法，合成条件温和，安全性高，是-氨基丁酸合成的理想途径，具有较好的应用前景和较高的经济效益7。生物合成 GABA 的关键酶是谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD），能催化 L-谷氨酸进行-脱羧反应生成 GABA。GAD 在低等生物和高等生物中均有发现，微生物中如乳酸菌、酵母菌、霉菌、芽孢杆菌等都发现有 GAD，能催化 L-谷氨酸产生 GABA89。基因组改组技术是对菌株进行定向改造从而使微生物表型改善的方法，常被应用于菌株的改良选育中1012。通过对原始菌株诱变筛选得到正向突变体作为亲代菌株，利用热处理和紫外灭活制备原生质体，之后进行原生质体融合再生1314。Yang 等15对 Streptomyces diastatochromogenes 进行三轮基因组改组筛选，获得融合菌株丰霉素产量比野生型提高了 10.8 倍，比亲本菌株提高了 2.64 倍。Sun 等16对Lactobacillus plantarum 163 经过两轮基因组改组获得菌株 F2-14，抑菌活性比两个亲本分别提高了2.45 倍（gamma-ray mutant）和 1.99 倍（DES mutant）。Sun 等17对 Lactobacillus acidophilus NX2-6 进行基因组改组获得菌株 F50，抗菌活性比原始菌株提高了 5.6 倍。张亚萌等18以啤酒酵母（Saccharomycespastorianus）G03 为出发菌株，利用基因组重排技术获得融合菌株 F2-123，发酵周期比 G03 缩短了 1 d，酒精度和真正发酵度分别比 G03 提高了 8.9%和 6.5%。贝莱斯芽饱杆菌在自然界中广泛分布，对人类和动物无害，不污染环境，代谢产物丰富，广泛应用于农业和发酵工业等许多领域，是我国重要的微生物资源1920。目前，对于芽孢杆菌产 GABA 的研究国内并不多见。本文以实验室已筛选的一株产 GABA 贝莱斯芽孢杆菌菌株 CLYB1 为研究对象，通过基因组改组技术提高菌株的产 GABA 能力，获得具有稳定遗传性和良好安全性的重组菌株，为后续的产业化应用提供理论基础和技术支持。1材料与方法 1.1材料与仪器贝莱斯芽孢杆菌 CLYB1（Bayycillus velezensis）实验室筛选，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号：CGMCC No.23949；-氨基丁酸标准品、聚乙二醇 6000、甘露醇、-巯基乙醇、乙二胺四乙酸二钠、纤维素酶、蜗牛酶分析纯，上海生工生物工程有限公司；蛋白胨、酵母浸粉分析纯，北京奥博星生物技术有限责任公司。MLS-3780 立式高压灭菌锅上海申安医疗器械厂；BCN-1360B 无菌操作台上海新苗医疗器械制造有限公司；DHP-9272 恒温培养箱上海一恒科技有限公司；HZZ-Q 全温振荡器哈尔滨东联电子技术开发有限公司；3K15 高速冷冻离心机德国西格玛公司；T-6vm 型分光光度计南京菲勒仪器有限公司。1.2实验方法 1.2.1 培养基配制发酵培养基（LB）：酵母浸膏3 g/L、蛋白胨 10 g/L、葡萄糖 3 g/L、氯化钠 5 g/L，调节 pH 至 6.3，121 灭菌 20 min。固体培养基：发酵培养基中加入琼脂 20 g/L。再生培养基：用原生质体稳定液代替蒸馏水按照上述培养基组分配制。磷酸缓冲液、高渗缓冲液、预处理溶液、原生质体稳定液、促融合剂、酶溶液的配制参照文献 2122。1.2.2 -氨基丁酸的定量测定（Berthelot 比色法）-氨基丁酸参照方绮等23的方法进行测定。1.2.3 菌株鉴定形态学鉴定：平板培养观察菌落形态大小，颜色及边缘隆起状况，挑取单个菌落进行革兰氏染色在显微镜下观察菌落形态特征。同源性分析和系统发育树的构建：将筛选菌株送至吉林省库美生物科技有限公司测序，将菌株序列用 BLAST 与数据库中的已知序列进行比较，利用MEGA 软件进行同源性分析并绘制系统发育树。1.2.4 菌株生长曲线和产酶曲线测定将 CLYB1菌株活化后接入 LB 培养基中，于适宜温度下振荡培养，每隔 2 h 取菌液一次，在 600 nm 波长下测定吸光度，共计测定 24 h，记录实验结果，同时测定发酵液中 GABA 含量。1.2.5 菌株基因组改组 1.2.5.1 紫外诱变将紫外灯（15 W）预热 1520 min，将活化后培养至对数期的 CLYB1 菌液稀释至 104106，放置在距离紫外灯 20 cm 处进行照射，紫外照射时间为 0、15、3、45、60、75、90 s。分别取 150 L诱变后的菌液涂布于 LB 固体平板培养基上，将没有经过紫外照射的菌悬液同样稀释至 104106，以未经过紫外照射的为对照，涂布完成后的平板在恒温培养箱中避光培养 12 d。待照射的菌落长出后，通过平板计数计活菌数，取致死率在 80%90%的时间进行紫外诱变。为确保诱变菌株的稳定性，需将诱变菌株（CLYB1-Y）连续传代 10 次后进行液体发酵，对其-氨基丁酸进行测定，从而判断诱变菌株的遗产稳定性。1.2.5.2 基因组改组参照参考文献 2223，配制原生质体菌悬液，适当稀释，涂布于固体培养基上。168 食品工业科技2023 年 10 月再分别取 1 mL 菌株原生质体细胞悬液，加入 9 mL高渗缓冲溶液中，稀释到合适浓度后，在再生固体培养基上涂布，培养 48 h 后，计算菌株原生质体形成率和再生率。根据不同处理条件下原生质体的形成率和再生率，选择最佳酶浓度、酶作用温度和菌体生长时期制备原生质体。研究热处理和紫外处理对原生质体灭活率的影响，确定双亲最佳灭活（热灭活或紫外线灭活）条件，灭活率按下面公式计算。灭活率(%)=灭活处理的平板菌落数未处理的平板菌落数100分别取 CLYB1-Y 菌株原生质体各 1 mL，混合均匀后放入无菌离心管中，用高渗缓冲液离心洗涤两次，离心后加入 1 mL 原生质体稳定溶液于上述沉淀菌体中，混匀后再加 1.8 mL 40%促溶剂 PEG 6000，摇匀，37 水浴保温 10 min，再用原生质体稳定溶液稀释至适当的浓度。涂布于再生平板上，30 培养 35 d，计算融合率。将融合液涂布在再生培养基上进行培养，观察并比较亲株和重组子的细胞形态。将融合菌株进行纯化、斜面保藏。将保藏的菌株接种至 LB 液体培养基中培养 12 d，测定改组菌株（CLYB1-YC）发酵液中-氨基丁酸的含量，之后将第 1 轮改组的菌株作为下一轮亲本菌株重复原生质体制备、灭火、融合、再生，如此循环操作，进行 5 轮基因组改组。改组后菌株经过稳定性实验后保存。1.2.6 菌株安全性评价 1.2.6.1 菌株溶血试验将改组后菌株（CLYB1-YC）在 LB 固体培养基上进行划线活化，然后接种于哥伦比亚血琼脂培养基上培养 48 h，根据平板上是否出现溶血环判断菌株安全性，-溶血环为草绿色，-溶血环为无色透明，本实验以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌株。1.2.6.2 抗生素敏感性试验采用 K-B 纸片扩散法检测 CLYB1-YC 菌株对 10 种抗生素的耐药性，测量并记录各药敏纸片的抑菌圈直径大小。参照美国临床和实验室标准协会（CLSI）标准进行结果判定，结果描述为敏感、中度敏感、耐药。1.3数据处理样品的每个指标均设置 3 次重复，采用 IBMSPSS Statistics 25.0 软件进行 Duncan 多重比较分析，采用 Origin 95C 进行绘图，结果以平均值（Means）标准差（SD）表示，统计结果以 P0.05 表示差异达到显著水平。2结果与分析 2.1CLYB1 菌株鉴定 2.1.1 菌株菌落特征菌株 CLYB1 为菌落颜色微黄且不透明，呈圆形，表面湿润不光滑，边缘规则，菌落稍微隆起，直径约 1.8 mm（图 1a）；革兰氏染色呈阳性，菌体为短杆，呈短链排列方式（图 1b）。ab图 1 贝莱斯芽孢杆菌 CLYB1 菌落和革兰氏染色图片Fig.1 Strain colony and gram strain pictures of CLYB1 2.1.2 16S rDNA 和 ITS 序列比对分析及系统发育树的构建将菌株 CLYB1 送由吉林省库美生物科技有限公司，选择 16S rDNA 基因测序（通用引物1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT），测序结果与 NCBI 数据库序列进行 BLAST 同源性检索，结果显示，CLYB1 菌株序列与已公布序列的贝莱斯芽孢杆菌 Bacillus velezensis 99%同源，系统发育树如图 2 所示。Bacillus velezensis strain LB67CLYB1Bacillus velezensis strain CBMB205Bacillus mojavensis strain IFO 15718Bacillus inaquosorum strain BGSC 3A28Bacillus inaquosorum strain NRRL B-23052Bacillus altitudinis strain 41KF2bBacillus pumilus strain SBMP2Bacillus safensis strain NBRC 100820Bacillus pumilus strain ATCC 7061Bacillus dafuensis strain FJAT-25496Bacillus acidicola strain105-210061841001009994910.0050图 2 贝莱斯芽孢杆菌 CLYB1 系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of CLYB1 2.1.3 贝莱斯芽孢杆菌 CLYB1 菌株生长曲线和产酶曲线CLYB1 菌株的生长曲线和发酵液中 GABA浓度随时间变化情况如图 3 所示，CLYB1 在 04 h为生长延滞期，416 h 为生长对数期，16 h 之后进入生长稳定期。当菌体进入生长的稳定期后，随着发酵时间的延长，GABA 在发酵 24 h 后开始产生，发酵72 h 后达到产量最高值，为 3.95 g/L。一般以培养到生长对数生长期的菌株作为诱变的原始菌株，因此选取发酵时间为 4 h 的菌株作为本实验基因组改组的原始菌株。01632486480960.00.51.01.52.0OD600 nmGABA浓度发酵时间(h)OD600 nm01234GABA浓度(g/L)图 3 菌株生长曲线和 GABA 产量Fig.3 Strain growth curve and GABA yield第 44 卷 第 19 期迟燕平，等：产-氨基丁酸贝莱斯芽孢杆菌 CLYB1 的鉴定及基因组改组选育研究 169 2.2贝莱斯芽孢杆菌 CLYB1 紫外诱变研究 2.2.1 最佳紫外诱变时间紫外诱变能够破坏碱基，使 DNA 分子发生断裂，导致 DNA 分子无法正常复制或顺序发生改变，从而引起微生物突变。由图 4可知，随着紫外照射时间的延长，致死率逐渐增大，当紫外照射为 60 s 时，菌株 CLYB1 的致死率达到 90%95%，因此，选择 60 s 作为菌株 CLYB1 紫外诱变的最佳时间选择。CLYB1 菌株在紫外照射 60 s 的条件下，经过诱变和测定后，得到一株产量较高的诱变菌株 CLYB1-Y，诱变菌株-氨基丁酸产量为 10.26 g/L，比出发菌株-氨基丁酸产量提高了 160%。406080100120致死率(%)紫外照射时间(s)0306090120图 4 不同紫外照射时间的菌株致死率Fig.4 Strain lethality with different UV mutagenesis time 2.2.2 诱变菌株的遗传稳定性将诱变菌株 CLYB1-Y 传代 10 次，进行-氨基丁酸产量测定，比较菌株遗传稳定性，见图 5，紫外诱变菌株 CLYB1-Y 的-氨基丁酸产量基本稳定，没有出现回复突变的问题。89101112传代次数(代)0246810-氨基丁酸产量(g/L)图 5 紫外诱变菌株遗传稳定性Fig.5 Genetic stability of UV mutagenic strains 2.3基因组改组选育高产-氨基丁酸菌株 2.3.1 原生质体的制备CLYB1-Y 菌株在培养 10 h，溶菌酶酶解时间 1 h 条件下原生质体的再生比率为99.88%。这说明得到的原生质体己经比较纯净。2.3.2 原生质体灭活条件的确定紫外灭活是使原生质体的 DNA 产生嘧啶二聚体，从而抑制细胞的正常生长繁殖甚至造成细胞凋亡；而热灭活是对核糖体 RNA 进行破坏，从而使细胞内蛋白质变性失活，进而产生致死作用。通过对不同时间的紫外灭活和热灭活处理的再生培养基平板上的菌落进行计菌落数，计算灭活率，结果见图 6。CLYB1-Y 菌株紫外照射 25 min 时，原生质体的灭活率达到 100%，因此，选择 25 min 作为最佳紫外灭活时间。CLYB1-Y 菌株热灭活 70 min 时原生质体的灭活率达到 100%，因此，选择 70 min 作为最佳热灭活时间。102030405060708090406080100紫外灭活热灭活处理时间(min)灭活率(%)图 6 紫外处理和热处理对菌株灭活率的影响Fig.6 Effect of UV treatment and heat treatment on theinactivation rate of strains 2.3.3 基因组改组菌株的检出与筛选将制备好的原生质体混合后用紫外和热灭活的方式进行灭活，然后进行融合，适当稀释后涂布于高渗培养基中。长出菌落后按照上述所用的初筛和复筛的方法，进行5 轮基因组改组，最终筛选出一轮改组菌株产量最高（见图 7），改组后菌株 CLYB1-YC 的-氨基丁酸产量为 20.19 g/L，比 CLYB1-Y 提高 97%，比 CLYB1提高 411%。0510152025-氨基丁酸产量(g/L)筛选轮次(轮)12345图 7 基因组改组菌株-氨基丁酸的产量Fig.7 GABA yield of genome shuffling strains 2.3.4 基因组改组菌株的遗传稳定性实验基因组改组菌株是否具有稳定的遗传性状是菌株进行应用开发的关键，为确保改组菌株的稳定性，因此将改组菌株分别转接 10 次进行传代，对转接 10 次的菌株进行产-氨基丁酸的能力测定，由图 8 可知，CLYB1-YC 产量基本稳定，没有出现回复突变的问题。2.4菌株 CLYB1-YC 安全性评价 2.4.1 菌株溶血试验将金黄色葡萄球菌和 CLYB1-YC 分别划线接种于哥伦比亚血琼脂培养基上，培养后观察，结果如图 9 所示。金黄色葡萄球菌菌落周围出现了透明圈，发生了-溶血现象，而 CLYB1 菌落周围无溶血环出现，说明 CLYB1-YC 不是溶血性 170 食品工业科技2023 年 10 月细菌，不存在引起败血症的风险。2.4.2 抗生素敏感性试验菌株安全性评价的首要指标是菌株对抗生素的敏感性，本实验选取青霉素、氨苄西林、头孢曲松、庆大霉素、四环素、红霉素、环丙沙星、林可霉素、复方新诺明、氯霉素 10 种抗生素对菌株进行研究，根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）测定菌株抑菌环直径，菌株敏感性结果如表 1 所示。CLYB1-YC 对十种常见的抗生素表现均为敏感性，证明菌株安全性好。表 1 菌株对 10 种抗生素的敏感性检测结果Table 1 Sensitivity test results of strains to 10 antibiotics抗生素CLYB1-YC青霉素H氨苄西林H头孢曲松H庆大霉素I四环素H红霉素H环丙沙星L林可霉素H复方新诺明I氯霉素H注：高敏感（H）：1520 mm；中敏感（I）：1014 mm；低敏感（L）：10 mm；不敏感（R）：0 mm。3讨论菌株选育是人为方式改变微生物菌株遗传物质的选育过程，包括诱变育种、杂交育种、基因组改组等技术手段。菌株诱变是一种操作简便、容易获得的诱变方式，可以有效的得到高质量突变菌株。王俊芳等24利用紫外和微波对枯草芽孢杆菌 G10 进行复合诱变，获得突变株 W1-32 产壳聚糖酶活为11.82 U/mL，是出发菌株 G10 的 6.9 倍。庞光武和梁智群25对具有产纤溶酶能力的枯草芽抱杆菌LC6-1 进行紫外诱变得到的突变菌株 PW6-3，纤溶酶产量较诱变之前的菌株 LC6-1 提高 72.53%。Lu 等26利用紫外激光诱变法得到 2 个突变体 UV-1-84 和 LA-UV-1-11，与野生型相比，蛋白酶活性分别提高了 45.63%和 41.39%。本实验中菌株 CLYB1经过紫外诱变后比出发菌株产量提高了 160%，证明紫外线对 CLYB1 菌株的诱变效果好，能提高菌株产-氨基丁酸的能力。基因组改组是将传统育种和原生质体融合相结合的一种高效育种方法，是将诱变后的菌株制备成原生质体进行融合，使菌株的细胞基因组进行重排。Sandip 和 Bomba27通过基因组改组筛选出具有明显培养特性的融合子 F2-19，黄色素、橙色素和红色素的含量分别比野生型高 67%、70%和 76%。王晓洁等28利用基因组改组技术，获得融合子 F2-24 的短杆菌素产量是出发菌株的 1.72倍。Li 等29对短小芽孢杆菌 LS-1 进行基因组改组获得菌株 GS3-M7，poly-l-diaminobutanoic acid 产量达 2316.4 mg/L，提高了 5.4 倍。张天笑等30经过两轮基因组改组选育获得 2 株高 L-乳酸量菌株F2-5（18.87 g/L）和 F2-9（18.64 g/L），较原始菌株（10.56 g/L）提高了 79%和 77%，产 L-乳酸较高的菌株 F-5 比原始菌株 10.56 g/L 提高了 79%。Fatema等31采用基因组改组方法，显著提高了植物乳杆菌的抗菌活性，金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌的抑制区域增加了 1.34、1.31、1.37 和1.37 倍。本实验获得的融合菌株CLYB1-YC 产量比诱变菌株 CLYB1-Y 提高了 97%，比出发菌株 CLYB1 提高了 411%；因此，基因组改组能够更有效地提高菌株产-氨基丁酸的能力。4结论本文以实验室筛选产-氨基丁酸菌株 CLYB1 为研究对象，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Saccharomycescerevisiae），产量为 3.95 g/L。利用紫外诱变方式处理 CLYB1，筛选得到株菌株 CLYB1-Y，-氨基丁酸产量为 10.26 g/L，比出发菌株 CLYB1 提高了 160%。采用基因组改组技术对菌株 CLYB1-Y 进行高产选育，经过 5 轮基因组改组，最终得到菌株 CLYB1-YC，-氨基丁酸产量为 20.19 g/L，比诱变菌株 CLYB1-Y 提高 97%，比出发菌株 CLYB1 提高 411%。对菌株 CLYB1-YC 进行菌株溶血试验和抗生素敏感性试验，没有溶血环出现，无溶血性，对大多数抗生素均敏感，菌株安全性良好。因此，基因组改组技术可以有效地提高贝莱斯芽孢杆菌 CLYB1 的-氨基丁酸产量，且改组后菌株遗传性状稳定，安全性良好，具有 02468101617181920传代次数(代)-氨基丁酸产量(g/L)图 8 基因组改组菌株遗传稳定性Fig.8 Genetic stability of genome shuffling strains CLYB1金黄色葡萄球菌图 9 菌株溶血试验结果Fig.9 Results of strain hemolysis test 第 44 卷 第 19 期迟燕平，等：产-氨基丁酸贝莱斯芽孢杆菌 CLYB1 的鉴定及基因组改组选育研究 171 较好的应用开发价值。参考文献 1 刘鸷驹,张东星,晏仁义,等.-氨基丁酸的生物活性研究进展J.现代药物与临床，2022，37（9）：21672172.LIU Zhiju,ZHANG Dongxing,YAN Renyi,et al.Research progress on biolog-ical activities of-aminobutyric acidJ.Drugs&Clinic，2022，37（9）：21672172.2 李海峰,李冰冰,石硕硕,等.-氨基丁酸在食品中的应用研究进展J.河南工业大学学报（自然科学版），2023，44（1）：117125.LI Haifeng,LI Bingbing,SHI Shuoshuo,et al.Researchprogress on the application of-aminobutyric acid in foodJ.Jour-nal of Henan University of Technology(Natural Science Edition)，2023，44（1）：117125.3 FARHAD G,DAVID F M D,LAURA G G-M.Biofunctional,structural,and tribological attributes of GABA-enriched probioticyoghurts containing Lacticaseibacillus paracasei alone or in 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