进展-细胞死亡.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,细胞死亡,项 荣,shirlesmile,中南大学生命科学学院,细胞凋亡,细胞坏死,自噬性死亡,细胞死亡的方式,Apoptosis,Apo,从,ptosis,飘零，落下,细胞象秋天的树叶一样凋落的死亡方式,第一部分 细胞凋亡,左，正常胸腺细胞；右，凋亡胸腺细胞,2002,年诺贝尔生理与医学奖获得者,悉尼,布雷诺尔、罗伯特,霍维茨和约翰,苏尔斯顿,器官发育的遗传调控和,细胞程序性死亡,一、细胞凋亡的研究历史、概念,二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征,三、细胞凋亡与肿瘤等疾病,第一部分 细胞凋亡,一、细胞凋亡的研究历史、概念,1.,凋亡概念的形成和形态学的研究,(1972,）,1972,年，,Kerr,等在英国癌症杂志发表论文，首次提出细胞凋亡,(apoptosis),的概念，也宣告了对细胞凋亡真正探索的开始。,2,DNA,的降解和内源性核酸内切酶参与,(1987,）,3.,蛋白质水解酶活化研究,(1995),4.,细胞膜变化,(1997),5.,线粒体变化和分子生物学研究,(1998-),1,）相关基因及调控,2,）信号转导,3,）各种分子及其相互作用、相互关系,4,）疾病机制的阐明，疾病新疗法的探索及问世,(一,),细胞凋亡的研究历史,Apoptosis,IMPACT FACTOR(201,3,):,3.949,Apoptosis is an international peer-reviewed journal devoted to the rapid publication of innovative basic and clinically-oriented investigations into,programmed cell death,.It aims to stimulate research on the basis of mechanisms of apoptosis and on its role in,various human disease,processes including:cancer,autoimmune disease,viral infection,AIDS,cardiovascular disease,neurodegenerative disorders,osteoporosis and ageing.The editors intend to encourage the development of clinical therapies against apoptosis-related diseases.,国际重要期刊,（二）细胞凋亡的概念,概念：,生理或病理,情况下，发生在机体内的，一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，即“,主动性细胞自杀,”过程为细胞凋亡（apoptosis）。所以也常常被称为细胞编程死亡（,programmed cell death,，,PCD,），凋亡细胞将被吞噬细胞或邻近细胞吞噬。,生物学意义,细胞凋亡对于多细胞生物,个体发育,的正常进行，,自稳,平衡的保持以及,抵御,外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用。,一、细胞凋亡的研究历史、概念,二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征,三、细胞凋亡与肿瘤等疾病,第一部分 细胞凋亡,二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征,（一）细胞凋亡的形态学特征,（二）细胞凋亡的生化特征,（三）诱导细胞凋亡的因子,（四）细胞凋亡的检测,（一）细胞凋亡的形态学特征,凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间,接触,的,消失,，但细胞,膜,依然完整；线粒体大体完整，但,核糖体,逐渐从内质网上脱离，,内质网,囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；,染色质,固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布,凋亡小体的形成：核,染色质断裂,为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的,凋亡小体,凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化。,凋亡细胞早期,细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（,cavitations,）的空泡结构,凋亡细胞中期,细胞核的染色质高度凝聚、边缘化,凋亡细胞晚期,细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体,细胞凋亡过程中细胞,核,染色质的形态学改变分为三期：,早期,的细胞核呈波纹状或呈折缝样部分染色质出现浓缩状态；,中期,细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；,晚期,的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体,（二）细胞凋亡的生化特征,凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶,tTG,（,tissue Transglutaminase,）积累并达,到较高水平,细胞凋亡的主要特征,形成大小为,180,200bp,特征性的,DNA ladders,细胞色素,c,诱导的凋亡细胞,DNA,电泳图,1,细胞色素,c诱导,0 h,2,细胞色素,c,诱导,1 h,3,细胞色素,c,诱导,2 h,4,细胞色素,c,诱导,3 h,5,细胞色素,c,诱导,4 h,6,阴性对照,7,Marker,？,（三）诱导细胞凋亡的因子,物理性因子，包括射线（紫外线，,射线等），,较温和的温度刺激（如热激，冷激）等,化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，,DNA,和蛋白质合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿,瘤坏死因子,（,TNF,），抗,Fas/Apo-1/CD95,抗体等,1.,细胞凋亡的形态学检测,2.,磷脂酰丝氨酸外翻分析（,Annexin V,法）,3.,线粒体膜势能（,mt,）的检测,4.DNA,片断化检测,5.TUNEL,法,6.Caspase-3,活性的检测,7.WB,检测,8.,凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析,（四）细胞凋亡的检测,1.,细胞凋亡的形态学检测,光学显微镜和倒置显微镜,未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。,染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。,荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜,一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的,DNA,特异性染料有：,Hoechst 33342;,Hoechst 33258;DAPI,。,电子显微镜观察,2.,磷脂酰丝氨酸（,PS,）外翻分析,（,Annexin V,法）,磷脂酰丝氨酸（,Phosphatidylserine,PS,）,正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期，,PS,可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。,Annexin-V,是一种分子量为,35,36KD,的,Ca,2+,依赖性磷脂结合蛋白，能与,PS,高亲和力特异性结合。将,Annexin-V,进行荧光素（,FITC,、,R-PE,）或,biotin,标记，以标记了的,Annexin-V,作为荧光探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。,Annexin V-FITC Fluorescence,PI Fluorescence,Time course of apoptosis in TF-1 cells cultured in GM-CSF-free medium,Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV+PI,流式细胞分析,DNA,根据凋亡细胞,DNA,断裂和丢失，采用碘化丙啶使,DNA,产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的,亚二倍体,细,胞，同时又能观察细胞的周期状态。,3.,线粒体膜势能（,mt,）的检测,线粒体荧光染料,：,Rhodamine 123,、,DiOC,6,（,3,）、,JC-1,、,TMRM,等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。,线粒体跨膜电位的存在使亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。,Bcl-2,家族与线粒体相关细胞凋亡,Bcl-2是一种,原癌,基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡（,抑制凋亡蛋白酶的激活，直接抗氧化，抑制线粒体释放促凋亡蛋白质，抑制凋亡调节蛋白对细胞的毒作用）,与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域；Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH3,哺乳动物细胞中发现的,Apaf2即是CytC,（B 细胞淋巴瘤/白血病-2，,B cell lymphoma/leukemia-2,）,分布：,造血细胞，上皮细胞，淋巴细胞等多种瘤细胞,线粒体凋亡信号途径,Mitochondrial Pathway,4.DNA,片段化分析,细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩,染色质,DNA,在核小体单位之间的连接处断裂,形成,180,200bp,整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱,(DNA ladder),。,荧光素（,fluorescein,）标记的,dUTP,在,脱氧核糖核苷酸末端转移酶,（,TdT Enzyme,）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂,DNA,的,3,-OH,末端，并与连接辣根过氧化酶（,HRP,，,horse-radish peroxidase,）的荧光素抗体特异性结合，后者又与,HRP,底物二氨基联苯胺（,DAB,）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有,DNA,断裂，因而没有,3,-OH,形成，很少能够被染色。,5.TUNEL,（,TdT-mediated dUTP nick end labeling,）,（,TdT-mediated dUTP nick end labeling,）,Caspase,家族,Caspase,活性位点是半胱氨酸,(Cysteine),，,裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽,键，因此称为,C,ysteine aspartic acic specific,protease,，即,Caspase,6.Caspase,活性的检测,caspase,超家族成员及其相应底物,Caspase,活化,Caspase,自身以,非活化,的,Procaspase,存在，其激活依赖于其他的,Caspase,在它的,天冬氨酸,位点裂解活化或自身活化,荧光物质偶联的短肽,活化的,Caspase-3,能够特异切割,D1E2V3D4-X,底物，水解,D4-X,肽键,7.WB,8.,凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析,一、细胞凋亡的研究历史、概念,二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征,三、细胞凋亡与肿瘤等疾病,第一部分 细胞凋亡,三、细胞凋亡与疾病,（一）细胞凋亡不足,1 肿瘤,Bcl-2表达,P53突变或缺失,2,、自身免疫疾病,胸腺对,T,细胞正负选择障碍,正选择,：与非已抗原,-MHC,抗原结合的,TCR,的单阳性细胞保留存活，进入外周,T,细胞库,负选择,：与自身抗原,-MHC,抗原结合的,TCR,的双阳性细胞被凋亡清除,（二）细胞凋亡过度,1,心血管疾病,（,1,）心肌缺血和心脏缺血再灌注损伤（,IRI,）：坏死,+,凋亡,心肌缺血和,IRI,凋亡特点,缺血早期多,梗死灶周边多,轻度缺血多,IRI,比单纯缺血多慢性轻度缺血多,（,2,）心力衰竭：心肌肥大的同时心肌数量减少（凋亡）,凋亡指数：由对照,0.2 0.4%35%,2,神经元退行性疾病,Alzheimer disease,AD,神经元丧失；海马及基底核的胆碱能神经元丧失达,30%50%,，累及大脑皮层,老年性痴呆与细胞凋亡,老年性痴呆,神经病理学和神经生化改变,神经元细胞减少 神经元纤维缠结神经炎症,脑内免疫炎症细胞凋亡,IL-1,、,IL-2,、,IL-3,、,IL-6,、,IL-8,、,TNF,ICE,白介素,-1,转换酶基因,AD,机制：致病因素（如氧自由基）作用于神经元，,Ca,2+,内流，激活有关基因，促使神经元内,-,淀粉样蛋白含量，从而导致凋亡,3.HIV感染导致CD4,淋巴细胞凋亡过度,1）感染HIV的宿主细胞膜上表达一种gp120糖蛋白，与CD4,淋巴细胞表面的受体结合，触发凋亡。,2）感染HIV的CD4,细胞逐步融合成合胞体或多核巨细胞，易发生凋亡。,3）Fas基因表达上调，使CD4,细胞对Fas介导的细胞凋亡敏感性增加，易发生凋亡。,4）T细胞激活，与凋亡有共同的信号传递系统，缺乏足够的细胞生长因子时，引起凋亡。,6）受感染的细胞产生tat蛋白，透过细胞膜，使CD4+细胞内氧自由基生成增多，增强Fas抗原表达，细胞对凋亡的易感性升高,7.,受感染的,CD4+,淋巴细胞作为效应细胞，诱导未受感染的,CD4+,淋巴细胞凋亡,8.HIV,和诱导,B,细胞，,CD8+,淋巴细胞，巨噬细胞凋亡,5）细胞因子分泌，TNF，与TNF受体（死亡受体）结合，启动凋亡，或产生氧自由基。,7）受感染的CD4+淋巴细胞作为效应细胞，诱导未受感染的CD4+淋巴细胞凋亡,8）HIV诱导B细胞，CD8+淋巴细胞，巨噬细胞凋亡,（三）细胞凋亡不足与过度并存,动脉粥样硬化,(atherosclerosis,AS),：,内皮凋亡,平滑肌凋亡不足,（增殖,凋亡）,oxLDL,activated plt,Ag II,hypertension,内皮屏障,细胞凋亡在疾病防治中的意义,1,合理利用凋亡相关因素,抑凋亡：老年性痴呆：,NGF,急性,T,细胞白血病：低剂量放射线、,TNF,促凋亡：局部肿瘤热疗；高温,43,、,30min,癌细胞获得性耐药：癌细胞改变蛋白表达模式,免疫疗法和靶标致癌基因的疗法,2,干预凋亡信号转导,FAS/FASL,信号系统：阿霉素刺激,SPP,（神经酰胺信号系统的代谢产物）：转导增殖信号，拮抗凋亡,AIDS,，,AD,wtP53,修复受损的,DNA,，如修复失败则诱导细胞凋亡,突变的,P53,失活的,P53,丧失监视,DNA,损伤的功能,射线，毒素,P53,蛋白,+,细胞凋亡,分子警察,（促进凋亡基因）,3,调节凋亡相关基因,野生型,P53,基因转染,4,控制凋亡相关的酶,核酸内切酶：Ca,2+,/Mg,2+,依赖性,Ca,2+,Mg,2+,激活；Zn,2+,抑制,Caspases:Ca,2+,直接或间接激活,5,防止线粒体跨膜电位的下降,环胞霉素,A(cyclosporinA,免疫抑制剂）阻抑,m,，其衍生物无免疫抑制作用，但有稳定,m,第二部分 其他细胞死亡方式,自噬性死亡,副细胞凋亡,胀亡,内吞死亡,“auto”+”phagein”=Autophagy,self,to eat,自噬,自噬是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成,自噬体,，并与溶酶体融合形成,自噬溶酶体,，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。,自噬（,Autophagy,）,自噬体（,autophagosome,）内涵体（,endosome,）自噬内涵体（,amphisomes,）自噬溶酶体（,autophagolysosome,）,凋亡是程序化细胞死亡，自噬是程序化细胞存活,Autophagy,IMPACT FACTOR(201,3,):,12.042,Autophagy,is a unique peer-reviewed journal with an international audience that covers the following topics:,macroautophagy,microautophagy,specific organelle degradation(e.g.,pexophagy)and additional autophagic processes including,chaperone,-mediated autophagy;the molecular mechanism of autophagy including the characterization of structural proteins and structure/function relationships;signaling and autophagic regulation;the role of autophagy in diseases including cancer,neurodegeneration and myopathies;developmental roles of autophagy and its connection with aging;autophagy in microbial invasion and the immune response;and autophagy in cell death.,副细胞凋亡（,Paraptosis,）,当发生,Paraptosis,时，细胞体积变大，细胞膜完整，电子显微镜下可见细胞内出现大量由线粒体和内质网肿胀形成的胞浆空泡,Paraptosis,是,TUNEL,阴性的,Caspase,抑制剂和,Bcl-XL,超表达不能阻断它,胀亡：,oncosis,胀亡的形态学特征是细胞,肿胀,，体积增大,胞浆空泡化，肿胀波及细胞核、内质网、线粒体等胞内结构，核溶解,胞膜起泡，膜泡中无亚细胞器，细胞膜完整性破坏,常引起炎症反应。,细胞凋亡与程序性细胞死亡,（,Apoptosis and Programmed Cell Death,）,PCD,是,功能,性概念，表示基因调控细胞死亡这一功能；而,Apoptosis,为,形态,学概念，是对一系列凋亡特征性、形态、生化变化的概括。,PCD,主要由,Apoptosis,引起，但还有其它的多种机制；同样，,Apoptosis,既有程序性部分，又有非程序性部分存在。,PCD,仅存在于,发育细胞,中，而,Apoptosis,既可发生于,发育,中的细胞，也可发生于,成体细胞,如肿瘤细胞等。,内吞死亡：,entosis,体外培养的哺乳动物上皮细胞,经细胞内化过程进入邻近细胞,(,宿主细胞,),的空泡,(vacuole),内,然后大部分细胞会死亡,在两个细胞之间的粘附力失衡的情况下,将一个细胞“推向”另一个细胞，直到它被后者包裹,乳腺、卵巢、脐带、肾脏癌细胞,抑制肿瘤？,THANKS,