重组人红细胞生成素生产工艺.pptx

单击此处编辑母版标题样式,#,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第一节 概述,第二节 工程,CHO,细胞系的构建,第三节,CHO,细胞系培养过程与工艺控制,第四节 分离纯化工艺,第十八章 重组人红细胞生成素生产工艺,概 述,18.1.1,红细胞生成素的种类,18.1.,2,红细胞生成素的临床应用,18.1.,3,红细胞生成素的理化性质,18.1.,4,红细胞生成素的表达研究,红细胞生成素,第一节 概 述,概 述,18.1.1,红细胞生成素的种类,红细胞生成素,1,、,天然红细胞生成素的生成和作用原理,1890,：现象，低氧压下红细胞增多,1948,：,Bonsdorff,和,Jalavisto,，提出红细胞生成素,（,erythropoietin,，,EPO,）,动脉氧分压是,EPO,生成调节因素,概 述,红细胞生成素,2,、,天然红细胞种类,1971,年：从贫血羊血桨中分离出羊,EPO,1977,年：从再障碍贫血患者的尿液中分离纯化出人,EPO,hEPO,形式：,hEPO-,及,hEPO-,，二者,氨基酸组成及顺,序相同,，,165aa,，活性类似,糖基化及其含量不同：,EPO-,含有较多的,N-,乙酰,葡萄糖，总含糖量比,EPO-,高。,概 述,红细胞生成素,3,、,红细胞生成素的生理作用,红细胞生成素，又称促红细胞生成素，或红细胞生成,刺激因子：调节红系祖细胞，对红细胞生成有特异性,刺激作用的细胞因子。,EPO,与靶细胞结合：骨髓、脾、肝细胞等，促进前体细胞增殖和分化，生成,RBC,概 述,红细胞生成素,4,、重组人红细胞生成素,第一代：两种，天然基因表达，,rhEPO-,和,rhEPO-,1989,：,Amgen,Epogen,；,1990,，,Biotech,，,Procrit,rhEPO-,，,CHO,细胞生产,Roche,，,NeoRecormon(rhEPO-),，,BHK,细胞系,概 述,红细胞生成素,4,、重组人红细胞生成素,用基因工程技术生产的人红细胞生成素,第二代：,EPO,突变体,2001,，,Amgen,，,Arasnep,长效,rhEPO-,突变体，,170aa,，有,5,个,N,糖基化位点,唾液酸残基高,2,倍，半衰期,36h,（,EPO,为,4-8h,）,CHO,细胞系生产,概 述,红细胞生成素,适应症：各类贫血,起因：慢性肾衰竭、,AIDS,、肿瘤、化疗等引起的贫血,开发新的临床适应症：肾病和糖尿病,在生物制品中排位,NO.1,，,2004,年全球销售额,11.9,BUSD,，,重磅 炸弹药物,各类体育竞技中，禁止使用的药物,？,18.1.,2,红细胞生成素的临床应用,概 述,红细胞生成素,大小：,166aa,糖链占分子量的,39%,糖基化程度与准确性对活性影响很大,pI4.2,4.6,，对热和,pH,变化相对稳定。,18.1.,3,红细胞生成素的理化性质,概 述,红细胞生成素,天然提取制药工艺：,由再生障碍性贫血患者的尿液中纯化而得，人源的红,细胞生成素。产量极其有限。（未用生产）,基因工程制药工艺：,重组人红细胞生成素（应用生产中）,化学制药工艺：,基于红细胞生成素的受体，研究与红细胞生成素功能,相当的化学药物（开发中）,18.1.,4,红细胞生成素的表达研究,概 述,红细胞生成素,重组人红细胞生成素工艺路线的研究,SV40,病毒启动子驱动表达载体，在,COS-1,中瞬时表达,红细胞生成素,昆虫,SF9,细胞中杆状病毒系统表达,rhEPO,。产率有所改,善，但糖基化程度较小,干扰素基因启动子的,rhEPO,表达载体，,BALL-1,细胞，,产生较高量的,rhEPO,概 述,红细胞生成素,重组人红细胞生成素工艺路线的研究,大肠杆菌中表达，仅具有体外抗原结合活性。,家蚕体内的表达系统，糖基化简单，药物在体内稳定性,较低、活性较差等问题。,在,CHO,、,BHK,细胞系统中稳定表达，获得的重组红细胞,生成素与天然红细胞生成素相似。现在工业生产中多采,用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。,第一节 概述,第二节 工程,CHO,细胞系的构建,第三节,CHO,细胞系培养过程与工艺控制,第四节 分离纯化工艺,第十八章 重组人红细胞生成素生产工艺,红细胞生成素,第二节 工程,CHO,细胞系的构建,细胞系的构建,18.2.1,表达载体的构建,18.2.,2,转染,18.2.,3,稳定性筛选,红细胞生成素,细胞系的构建,18.2.1,表达载体的构建,人红细胞生成素基因的克隆策略：,从基因组中克隆编码区片断，拼接成全长；或从基因中,克隆全长，在动物细胞中转录出,mRNA,，,RT-PCR,克隆全长,序列,将目标基因与载体在连接体系中连接过夜，连接酶为,Phage T4,连接酶,表达载体的构建：,人红细胞生成素基因与载体进行酶切、连接、转化、大肠,杆菌中筛选、鉴定、测序、确证序列、方向无误。,红细胞生成素,细胞系的构建,细胞培养,：,CHO dhfr,-,60%,汇合用无血清培养基洗涤,3,次,脂质复合物制备,：细胞载体,prEPO,和,pDHFR,与脂质体混合,共感染,：与无血清培养基混合，加到培养皿中，,37,，,5%CO,2,，,4h,抗性克隆的获得,：在相关的培养基中培养后进行抗性筛选,18.2.,2,转染,红细胞生成素,细胞系的构建,18.2.,3,稳定性筛选,胰蛋白酶消化，,1:5,稀释，在含有,1 nmol/L MTX,培养基上,培养，,3,4d,更换培养基，培养,10,14,天，至抗性克隆,出现。,传代培养：,1:5,稀释，按,1 nM5 nM25 nM100 nM,200 nM1000 nM,使,MTX,浓度逐次升高，筛选抗性克隆。,抗性克隆培养于,100 mm,培养皿中，按,1:500,稀释，继续,培养,3,5,天，集落,2-4 mm,。,酶联免疫分析：确认表达人红细胞生成素。,第一节 概述,第二节 工程,CHO,细胞系的构建,第三节,CHO,细胞系培养过程与工艺控制,第四节 分离纯化工艺,第十八章 重组人红细胞生成素生产工艺,红细胞生成素,转瓶生产：,Amgen,公司,反应器生产,rhEPO,的大规模生产方式,培养过程与工艺控制,红细胞生成素,第三节,CHO,细胞系培养过程与工艺控制,培养过程与工艺控制,18.3.1,种子细胞制备,18.3.,2,反应器培养工艺,18.3.,3,培养过程控制,红细胞生成素,冻存的细胞株,37,水浴，无菌离心。,加适量,DMEM,培养基（,10%,小牛血清）。,37,、,CO,2,培养箱培养，连续传三代。,细胞消化后接种，制成接种细胞浓度,(2.510,6,个,/ml),。,培养过程与工艺控制,18.3.1,种子细胞制备,红细胞生成素,反应器灭菌：加纤维素载体片及,pH7.0,的,PBS,缓冲液，,高压灭菌,1.5h,。,接种：排出,PBS,缓冲液，加,DMEM,培养基，接种。,贴壁培养：,pH7,，,50r/min,，,37,，,DO50-80%,。,扩增培养：,80,100r/min,，培养,10d,。,灌流培养：控制温度、,DO,、,pH,值等培养条件，进行,无血清培养基连续培养。,收获培养物，,4,8,保存。,培养过程与工艺控制,18.3.,2,反应器培养工艺,红细胞生成素,搅拌控制：接种后，搅拌速度缓慢，使细胞贴附于载体上，,随着细胞数量的增加逐渐提高搅拌速度。,温度控制：较为严格，恒定,37,。,pH,值控制：,7.0-7.2,输入,CO,2,和碳酸氢盐溶液维持其恒定。,溶解氧控制：在,50,-80,的范围内，通入氧气、空气或,氮气的比例混合气体。,葡萄糖控制：流加补料。,代谢废物控制：监测氨、乳酸盐类等，维持较低浓度，,减少对细胞损害。,培养过程与工艺控制,18.3.,3,培养过程控制,第一节 概述,第二节 工程,CHO,细胞系的构建,第三节,CHO,细胞系培养过程与工艺控制,第四节 分离纯化工艺,第十八章 重组人红细胞生成素生产工艺,红细胞生成素,培养过程与工艺控制,18.4.1,初级分离,18.4.,2,精制纯化,18.4.,3,产品质量控制,第四节 分离纯化工艺,红细胞生成素,CM,Sephrose,亲和层析,：,Na-HAc-,异丙醇活化，并用,20 mmol/L Tris,-,HCl,平衡缓冲液平衡。,收获培养基滤膜过滤后上,CM,亲和层析柱，平衡缓冲液,平衡。,0,2 mol/L NaCl,，,20 mmol/L Tris,洗脱液梯度洗脱。,透析：,0.1mM Tris,，过夜，换液,4,次。,培养过程与工艺控制,18.4.1,初级分离,将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。,红细胞生成素,培养过程与工艺控制,亲和层析法的四项要素：,(2),Specific,Binding,Substance(B),洗脱,Elution,(4),配,体,Ligand(A),耦合反,应,(3),Coupling Reaction,杂质,B,B,B,B,(1),Solid Matrix,B,红细胞生成素,培养过程与工艺控制,亲和层析法的作用机理：,固相,载体,(1),(2),(3),A,B,Sample,Washing,Elution,X,B,亲和基团,配体,X,B,A,A,红细胞生成素,培养过程与工艺控制,SDS-PAGE,亲,和,层,析法,纯,化,CHOM,Trypsin,A B C&D,Disc-PAGE,A B C =D,以,凝胶电泳检验亲和层析,操作,过程各步骤样品,Chitin,红细胞生成素,透析后的活性组分上预先平衡的,DEAE,离子交换柱。,0,1 mol/L NaCl-Tris,洗脱液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。,上,10%,乙腈平衡的RP-HPLC,柱，,10%,70%,的乙腈溶液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。,上凝胶柱（预先用,20 mmol/L,柠檬酸盐缓冲液平衡），,20 mmol/L,柠檬酸盐缓冲液平衡并洗脱，收集活性洗脱峰（红细胞生成素）。,rhEPO,产品：蛋白含量为,1.2 mg/ml,，其比活可为,2,10,5,IU/mg,。,培养过程与工艺控制,18.4.,2,精制纯化,红细胞生成素,纯度，蛋白质含量，分子量等,体外活性：,ELISA,测定（原理免疫沉淀），单,位,unit,（,IU,）,体内活性：网织红细胞计数法，注射,BALB/c,小,鼠，眼眶取血，染色，涂片计数网织红细胞数。,比活性,(U/mg),：单位重量蛋白质,(mg),中所含的活性,培养过程与工艺控制,18.4.,3,产品质量控制,抗体药物制备,鼠源单克隆抗体,19.2.1,杂交瘤细胞系的建立,1,、杂交瘤制备原理,B,淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这,种抗原分泌特异性抗体的能力。,B,细胞的这种能力和量是有限,的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也,是极其微小的。将这种,B,细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形,成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是,既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的,B,淋巴,细胞的能力，,将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠,体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即,称为单克隆抗体技术。,抗体药物制备,鼠源单克隆抗体,2,、杂交瘤制备过程,制备工艺：,免疫动物,亲本细胞制备,细胞融合,培养筛选和鉴定,克隆化,抗体药物制备,鼠源单克隆抗体,骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，,也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量,McAb,。,有遗传标记，如,HGPRT,-,或,KT,-,。,能在,CM,中生长良好,利用免疫抑制剂，如降植烷、液体石蜡、抗淋巴细胞血清等，,可以加速和促进肿瘤的生长。,2,）骨髓瘤细胞制备,抗体药物制备,鼠源单克隆抗体,取对数期骨髓瘤细胞和,B,淋巴细胞悬液，于离心管中以,1:10,混匀，离心、去上清,在,37,下，使两者充分接触,滴加,PEG,后，继续震动,2min,添加培养基稀释,PEG,，终止其作用,离心后，置于培养板中用,HAT,培养基进行培养,3,）原生质体融合,抗体药物制备,鼠源单克隆抗体,4,）杂交瘤的筛选,HAT,选择杂交瘤细胞脾细胞和骨髓瘤细胞经,PEG,处理后，,形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的,杂交瘤细胞才有意义。,在,HAT,选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激,酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂,交瘤细胞具有上述两种酶，在,HAT,选择培养液可以生长繁殖。,抗体药物制备,鼠源单克隆抗体,指将抗体阳性孔进行克隆化。保证,HAT,筛选后的杂交瘤克隆,一个孔内只有一个克隆。,克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克,隆化。,克隆化的方法，最常用的是有限稀释法和软琼脂平板法。,5,）杂交瘤的克隆化,抗体药物制备,鼠源单克隆抗体,HAT,次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷,主路途径：利用糖和氨基酸合成嘌呤和嘧啶均需叶酸和作为氢的来,源。,A,阻断二氢叶酸到四氢叶酸合成从而阻断主路途径，由于骨髓,瘤细胞是,HGPRT,和,KT,-,，因此不能正常生长,。,旁路途径：次黄嘌呤,-,鸟嘌呤（,HGPRT,）或胸腺嘧啶,(KT),核酸核糖,途径。由于,B,细胞具有该途径，可在,HAT,培养基正常生长。,