SHC SH2域结合蛋白1对肝细胞癌细胞恶性生物学行为的影响及其作用机制.pdf

3548宋磊，等SHC SH2域结合蛋白1对肝细胞癌细胞恶性生物学行为的影响及其作用机制SHC SH2 域结合蛋白 1对肝细胞癌细胞恶性生物学行为的影响及其作用机制宋磊,高明,李贺”,孙远松,王琪1安徽医科大学第一附属医院急诊科，安徽合肥2 30 0 2 2；安徽医科大学第二附属医院急诊外科，安徽合肥230001【摘要】目的：探究SHC SH2域结合蛋白1（SHCBP1）通过与驱动蛋白家族成员18 A（K IF18 A）相互作用对肝细胞癌（HCC）细胞增殖、调亡、侵袭、迁移及干性特征的调控作用。方法：ENCORI数据库分析SHCBP1、K I F18 A 在HCC组织中的表达以及与HCC患者总体生存率之间的相关性以及 SHCBP1与KIF18A表达在HCC组织中的相关性。分析SHCBP1、K I F18 A 与HCC患者临床病理特征间的关系;STRING数据库预测SHCBP1与KIF18A间潜在的结合关系。体外培养人正常肝细胞系HHL-5、H C C 细胞（Huh-7、SNU-449、H e p 3B），实时荧光定量PCR（RT-q PCR）、蛋白质印迹法（Westermblot）检测SHCBP1、K IF18 A 表达水平;CCK-8检测细胞活力TUNEL、划痕和Transwell实验分别评估细胞调亡、迁移和侵袭；体外成球实验检测细胞成球能力；Westernblot分析调亡、转移相关蛋白及干性标志物表达水平。结果：SHCBP1、K I F18 A表达均与HCC患者肿瘤分化程度、脉管侵犯及远处转移之间具有显著相关性（均P0.05）;SH C BP1和KIF18A在HCC组织和细胞中高表达（P0.05）,并与预后不良相关。敲低SHCBP1可抑制细胞增殖、迁移、侵袭和干性并促进细胞调亡（均P0.01）。此外,SHCBP1与KIF18A相互作用,KIF18A过表达可逆转SHCBP1干扰对HCC细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及干性的作用（均P0.01）。结论：SHCBP1可通过与KIF18A相互作用进而促进HCC细胞恶性生物学行为。【关键词】肝细胞癌;SHCBP1;KIF18A;细胞干性【中图分类号】R735.7【文章编号】16 7 2-4992-(2 0 2 3)19-3548-10Effects of SHC SH2 domain-binding protein 1 on the malignant biological behaviors ofhepatocellular carcinoma cells and its mechanismSONG Leil,GAO Ming,I He,UN Yuansong,WANG Qi?Emergency Department,the First Afiliated Hospital of Anhui Medical University,Anhui Hefei 230022,China;Department of EmergencySurgery,the Second Hospital of Anhui Medical University,Anhui Hefei 230022,China.Abstract)Objective:To figure out the regulatory role of SHC SH2 domain-binding protein 1(SHCBP1)in theproliferation,apoptosis,invasion,migration and stemness of hepatocellular carcinoma(HCC)cells via interacting withKinesin family member-18A(KIF18A).Methods:ENCORI data base analyzed SHCBP1 and KIF18A expression inHCC tissues,the correlation of SHCBP1 and KIF18A expression with the overall survival rate of HCC patients and thecorrelation between SHCBP1 and KIF18A in HCC tissues.The relationship between SHCBP1,KIF18A and clinico-pathological characteristics of HCC patients was analyzed.STRING database predicted the potential binding relation-ship between SHCBP1 and KIF18A.Human normal hepatocyte line HHL-5 and HCC cells(Huh-7,SNU-449 andHep3B)were cultured in vitro.RT-qPCR and Western blot examined SHCBP1 and KIF18A expression.Cell viabili-ty was estimated by CCK-8.Cell apoptosis,migration as well as invasion were respectively measured by TUNEL,wound healing and transwell assays.In vitro sphere formation assay evaluated the sphere formation ability of cells.Western blot tested the expression of apoptosis-,metastasis-associated proteins and stemness markers.Results:There were significant correlations between SHCBP1 and KIF18A expression and the degree of tumor differentiation,vascular invasion and distant metastasis in HCC patients(all P0.05).SHCBP1 and KIF18A were highly expressed【收稿日期】2023 03 23【修回日期】2023 06-25【基金项目】安徽省教育厅科学研究项目（编号：KJ2021A0322）【作者简介】宋磊（1994一），男，安徽合肥人，硕士，医师，研究方向：危重症相关研究。E-mail：18 356 96 9190 16 3.c o m【通信作者】高明（197 9），男，山东庆云人，博士，主任医师，研究方向：急腹症及急性炎症性疾病。E-mail:【文献标识码】AD0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.19.004现代肿瘤医学2 0 2 3年10 月第31卷第19 期in HCC tissues and cells(P 0.05)and associated with unfavorable prognosis.SHCBP1 knockdown hindered theproliferation,migration,invasion and stemness while potentiated the apoptosis of HCC cells(all P0.01).Additional-ly,SHCBP1 interacted with KIF18A.Further,KIF18A over expression reversed the impacts of SHCBP1 interferenceon HCC cell proliferation,apoptosis,migration,invasion and stemness(all P0.01).Conclusion:SHCBP1 might in-teract with KIF18A to further contribute to the malignant biological behaviors of HCC cells.Key words hepatocellular carcinoma,SHCBP1,KIF18A,cell stemness肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）属于原发性肝癌最多见的分型。近年调查数据表明,HCC已成为2 0 2 0 年全球范围内第六大常见癌症和第三大癌症死亡原因。流行病学研究指出，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒感染、吸烟、饮酒等是HCC 发生的主要风险因素2-3。对早期HCC患者而言,手术切除、肝移植、化疗是有效的治疗手段4；而晚期转移性HCC患者往往预后较差,总体生存水平较低5。因此,探究HCC潜在的转移机制并寻找有效的分子靶点对于改善HCC治疗方案有重要意义。SHC是细胞表面受体衔接蛋白，可调节细胞增殖、信号转导及各种蛋白在生物体内的表达6 。SHC SH2 域结合蛋白 1(SHC SH2 domain-binding protein 1,SHCBP1)是 SHC 蛋白SH2结构域上的重要连接蛋白。多项研究表明,SHCBP1在前列腺癌7 、胃癌 、乳腺癌9、滑膜肉瘤10 、结肠癌等中表达上调,并促进肿瘤恶性进展。此外,近期研究发现，SHCBP1在HCC细胞中表达增加,并可作为HCC潜在的预后生物标志物12-13。TAO 等人研究进一步揭示,SHCBP1过表达可显著促进HCC 细胞增殖、存活和集落形成14。但SHCBP1对HCC转移的具体影响及潜在的调控机制仍待探究。驱动蛋白于19 8 5年被首次发现，可通过调控微管稳定性和有丝分裂进程进而参与恶性肿瘤发生和发展15-16 。据报道，驱动蛋白家族成员18 A（K in e s in f a m ily m e m b e r-18 A，KIF18A)与食管癌17 、前列腺癌18 、肺癌19 等进展有关,并主要发挥促癌作用。且研究发现,KIF18A可促进HCC细胞增殖、侵袭和转移2 0 基于上述报道,本研究旨在分析 SHCBP1对HCC 细胞恶性表型的影响,并探究 SHCBP1与KIF18A之间的调控机制。1材料和方法1.1材料1.1.1人体组织标本选取2 0 19 年0 3月至2 0 2 1年12 月安徽医科大学第二附属医院收治的33例HCC患者为研究对象,其中男性2 0 例，女性13 例,年龄(6 0.35 6.7 1)岁,所有患者均经手术病理证实为 HCC。患者手术前未接受过 HCC 的相关治疗,术中获取部分HCC组织与癌旁组织,置于-8 0 超低温冰箱内保存。本研究经安徽医科大学第二附属医院伦理委员会批准，所有患者知情且签署同意书。1.1.2实验细胞及试剂人正常肝细胞系HHL-5、T U NEL试剂购自上海雅吉生物科技有限公司;HCC细胞Huh-7、SNU-449、H e p 3B均购自美国菌种保藏中心（ATCC）；RPM I-16 40、D M EM、EM EM培养基、胎牛血清（FBS）、RI PA 裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL超敏化学发光试剂盒购自迈基生物科技有限公司；SHCBP1干扰质粒（sh-SHCBP1#1/2）及其阴性对照 sh-MODERN ONCOLOGY,Oct.2023,VOL.31,No.19NC、K I F18 A 过表达质粒（Ov-KIF18A）及空载体对照（Ov-NC)由上海吉玛公司提供；Lipofectamine2000转染试剂、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、ProteinAAgrose购自赛默飞世尔科技；Trizol试剂、CCK-8购自上海源叶生物科技有限公司;EvoM-MLV反转录试剂盒、SYBR?GreenProTaqHS预混型qPCR试剂盒购自艾科瑞生物；免抗SHCBP1、K I F18 A、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2）、Bc l-2 相关X蛋白（Bax）、C le a v e d c a s p a s e 3、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP.-9）、Na n o g、性别决定相关基因簇2（Sox2）、八聚体结合蛋白4（OCT4）、甘油醛-3磷酸脱氢酶(GAPDH）、b e t a 肌动蛋白（-actin)抗体和辣根酶（H RP）标记山羊抗兔IgG购自Abcam；基质胶、Transwell小室购自美国BD公司。1.2方法1.2.1数据库分析ENCORI数据库（https:/ I F18 A 在HCC组织中的表达、与HCC患者总体生存率之间的相关性以及HCC组织中SHCBP1与KIF18A表达相关性；STRING（h t t p s:/c n.s t r i n g d b.o r g/）分析SHCBP1蛋白和KIF18A蛋白互作关系。1.2.2细胞培养HHL-5细胞常规培养于 DMEM 培养基中;Huh7、SNU-449 细胞常规培养于RPMI-1640培养基中;Hep3B细胞常规培养于EMEM培养基中。所有培养基均含有10%FBS,并置于37、5%CO,环境下。1.2.3细胞转染待接种于6 孔板中（410/每孔)的Hep3B细胞生长融合度至6 0%7 0%时，严格按照Lipofectamine2000试剂说明转染SHCBP1干扰质粒（shSH C BP1#1/2）及KIF18A过表达质粒(Ov-KIF18A)。1.2.4实时荧光定量PCR(RT-qPCR)利用Trizol试剂分离HHL-5及HCC细胞中的总RNA，并经EvoM-MLV反转录试剂盒逆转录为cDNA,随后加入SYBR?GreenPro TagHS预混型qPCR试剂盒进行PCR扩增。扩增反应条件：42,30 min;94,5m i n；（94,15s；60,6 0 s)40 个循环,反应体系为2 5L。在PCR循环第二步6 0 时收集荧光信号。使用2-ACl法计算SHCBP1和KIF18A相对于内参GAPDH的表达水平。其中SHCBP1引物序列为上游5-GCTACCGTGATAAACCAGGTTC-3，下游5-AGGCTCTGAATCGCTCATAGA-3;KIF18A引物序列为上游5AAAAAGTGGTAGTTTGGGCTGA3，下游5-CTTTCAAGGGAGATGGCATTAG-3；内参GAPDH引物序列为上游5-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3，下游为5-TGGAGGAGTGGGTGTCGC-31.2.5蛋白质印迹分析(Western blot)经RIPA裂解液从各实验分组细胞中提取蛋白后，使用3549.Modern Oncology 2023,31(19):3548-35573550BCA法检测其浓度。等量蛋白经SDS-PAGE、转膜、封闭后,加入稀释好的一抗4孵育过夜，加人按照1:30 0 0 稀释的HRP标记的二抗，室温摇床孵育2 h,ECL显色，暗室下X线胶片显影、定影。Quantity-One软件分析蛋白条带灰度值。1.2.6CCK-8 法检测细胞活性将各实验分组Hep3B细胞接种于96 孔板中（510 3个细胞/每孔）,分别于2 4h、48 h 和7 2 h后,加人10 LCCK-8试剂。2 h后，酶标仪于450 nm处检测光密度值。1.2.7TUNEL染色检测细胞凋亡收集转染后的Hep3B细胞并接种于96 孔板中，加入4%多聚甲醛和0.5%TritonX-100进行固定和透化处理，随后加人TUNEL试剂，严格按照试剂盒说明书于37 下反应45min。滴加DAPI后利用荧光显微镜随机选取五个视野观察细胞调亡情况。每次实验至少重复三次。1.2.8划痕实验检测细胞迁移收集转染后的Hep3B细胞并接种于6 孔板中,待细胞达到90%汇合度时,利用2 0 0 L无菌枪头制造划痕，经PBS洗涤后更换为无血清培养基继续培养。分别于0 和2 4h时计算伤口宽度，观察伤口愈合情况。每次实验至少重复三次。1.2.9Transwell实验检测细胞侵袭基质胶于4下溶为液态，并与无血清培养基按照1:5比例混合，提前使用50 L基质胶对Transwell上室进行包被。各实验分组Hep3B细胞(510 4个)经胰酶消化及PBSTab.1 The relationship between SHCBP1,KIF18A expression and clinicopathological characteristics of HCC patients x+sClinical parametersGenderMaleFemaleAge(years)5555Tumor differentiationWell/ModeratePoorTumor diameter(cm)3Vascular invasionYesNoDistant metastasisYesNo2.2SHCBP1 在HCC组织中过表达,并与不良预后相关通过ENCORI数据库分析发现,SHCBP1在HCC组织中表达上调（图1A）。此外，如图1B所示，SHCBP1高表达与HCC 患者总体生存率低相关。通过 RT-qPCR检测结果发现,与癌旁组织相比,SHCBP1 在HCC 组织中表达升高（P0.001)（图1C）。同样,RT-qPCR和Westernblot检测结果表明,与人正常肝细胞系HHL-5相比,SHCBP1在人肝癌细胞(Huh-7、SNU-449、H e p 3B)中的表达水平显著升高(P0.05,P0.001）（图1D）。后续选择SHCBP1相对表达量最宋磊，等SHC SH2域结合蛋白1对肝细胞癌细胞恶性生物学行为的影响及其作用机制清洗后，加至Transwell上室内并将50 0 L含10%FBS的EMEM培养基加至下室。2 4h后，清除表层残余细胞,加入4%多聚甲醛固定膜下侵袭细胞，0.1%结晶紫染色后于光学显微镜下观察侵袭细胞。每次实验至少重复三次。1.2.10体外成球试验检测细胞干性6孔板中培养各实验分组Hep3B细胞（510 3个细胞/每孔）,并置于含2 0 ng/mL表皮生长因子和10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基中，14天后于光学显微镜下计算肿瘤球数。每次实验至少重复三次。1.2.11 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)首先裂解Hep3B细胞，将ProteinAAgrose加至和SHCBP1和KIF18A抗体孵育过夜的细胞裂解液中，孵育过夜后离心，Westernblot分析沉淀出的蛋白复合物。1.3统计学分析数据处理采用SPSS22.0软件并表示为均数标准差（x s），独立样本t检验和单因素方差分析分别用于两组间和多组间比较。P0.05时,差异具有统计学意义。2结果2.1 SHCBP1、K IF18 A 与HCC 患者临床病理特征间的关系经数据统计显示,SHCBP1、K I F18 A 表达均与HCC患者肿瘤分化程度、脉管侵犯及远处转移之间具有显著相关性(均P0.05),详见表1。表1SHCBP1、K I F18 A 与HCC 患者临床病理特征间的关系xsTotal(n=33)SHCBP1202.14 1.37132.21 1.29192.31 1.21141.97 1.12161.54 0.87172.76 1.67182.23 1.02152.09 1.21172.67 1.56161.63 1.09192.59 1.34141.59 1.01t0.1470.823-2.6070.3612.2072.341高的Hep3B细胞进行实验。2.3干扰SHCBP1抑制HCC细胞增殖并诱导细胞凋亡为阐明SHCBP1对HCC 细胞恶性表型的影响,我们将SHCBP1干扰质粒转染至Hep3B细胞,RT-qPCR和Westermblot检测发现,经sh-SHCBP1#1/2质粒转染后,SHCBP1表达明显减少（P0.001)（图2 A），后续选择干扰效率较为显著的sh-SHCBP1#2质粒进行实验。CCK-8实验结果表明,sh-SHCBP1 组较 sh-NC 组细胞活性显著降低(P0.01,P0.001）（图2 B）。反之,TUNEL实验结果发现，与P0.8840.4170.0140.7210.0350.026KIF18A3.02 1.763.15 1.663.11 1.693.02 1.722.21 1.323.88 1.823.02 1.453.13 1.393.65 1.612.46 1.293.55 1.632.42 1.38t-0.2120.1503.0010.2212.3342.097P0.8340.8820.0050.8260.0260.044现代肿瘤医学2 0 2 3年10 月第31卷第19期sh-NC 组相较,sh-SHCBP1 组凋亡细胞数目显著提升（图2C）。此外，Westernblot测定调亡相关蛋白Bcl-2、Ba x 和Cleaved caspase 3/Caspase 3表达,结果表明,与sh-NC 组相GroupLow0.25High+(Low,1)+(High,i)Cancerlog2(FPKM)Normallog2(FPKM)BoxploroCGieneexpresD54321A:ENCORI数据库检测SHCBPI在HCC组织中的表达BENCORI数据库检测SHCBP1表达与HCC患者总体生存率的关系；C：RT-qPCR分析SHCBP1在HCC组织中的表达；D：RT-q PCR和Westernblot分析SHCBP1在人正常肝细胞系和HCC细胞中的表达（*P0.05,*P0.001 vs HHL-5)。A:ENCORI database examined SHCBP1 expression in HCC tissues.B:ENCORI database detected the correlation of SHCBP1 expression with the overallsurvival of HCC patients.C:Examination of SHCBP1 expression in HCC tissues by RT-qPCR.D:Examination of SHCBPI expression in human normalhepatocyte line and HCC cells by RT-qPCR and Western blot(*P0.05,*P0.001 vs HHL-5).sh-Nh-SHCBP1#2ControlBCControl1.4sh-NCsh-SHCBP11.21.00.80.60.40.224hMODERN ONCOLOGY,Oct.2023,VOL.31,No.19比,SHCBP1干扰导致Bcl-2蛋白表达降低,Bax和Cleavedcaspase 3/Caspase 3蛋白表达增加(P0.001)（图2 D)。ASHCBPE with 374 cancer and 50 normal samples in LIHC2.52.5A3551B1.00Data Source:starBase v3.0 projcct。Hep3图1SHCBP1 在 HCC 组织中过表达,并与不良预后相关Fig.1 SHCBP1 is overexpressed in HCC and associated with poor prognosis1.21.00.80.60.40.20Overall survival for SHCBPl inLIHCcancer,LowNum=1850.75HighNum=184Hazard Ratio=1.600.50025Time(months)SHCBP1GAPDH-nNS449-NC*48hCLog-RankP=0.00865075100125449luhHep3SHCBP1GAPDHsh-NCTUNEL*DAPI72hMerged54321-0541-5Huh-SNU.1.21.00.80.60.40.20Controlsh-SHCBP12572015100Control*NormalTumorHep3DBcl-2BaxCleavedcaspase3320.4321Caspase3GAPDHON-4SContr0ON-SCont图2 干扰SHCBPI抑制HCC细胞增殖并诱导细胞凋亡A:RT-qPCR和Westernblot检测SHCBP1干扰质粒的转染效率;B:CCK-8实验检测Hep3B细胞活力;C:TUNEL实验检测Hep3B细胞凋亡（2 0 0);D:W e s t e r m b l o t 检测凋亡相关蛋白表达（*P0.01，*P 0.0 0 1v s s h-NC)。Fig.2 Interference with SHCBP1 suppresses HCC cell proliferation and induces cell apoptosisA:RT-qPCR and Western blot examined the transfection efficacy of SHCBP1 interference plasmids.B:CCK-8 assay detected Hep3B cell viability.C:TUNEL assay estimated Hep3B cell apoptosis(200).D:Examination of the expression of proteins implicated in apoptosis by Western blot(*P0.01,*P0.001 vs sh-NC).1.2-35522.4干扰SHCBP1可抑制HCC细胞迁移和侵袭sh-SHCBP1 组较sh-NC 组迁移细胞数目下降(P0.001)(图3A)。此外,与 sh-NC组相比,sh-SHCBP1组细胞侵袭能力明显减弱（P0.001）（图3B）。W e s t e r n b lo t分析显示，敲低SHCBP1可抑制转移相关蛋白MMP-2和MMP-9 表达(P0.001)(图3C)。宋磊，等SHC SH2域结合蛋白1对肝细胞癌细胞恶性生物学行为的影响及其作用机制2.5干扰 SHCBP1可抑制 HCC 细胞干性此外,如图4A所示,体外成球实验结果表明，与 sh-NC组相较，shSH CBP1组细胞成球能力明显减弱。Westernblot测定干性标志物表达水平,结果发现 sh-SHCBP1组较 shNC 组Nanog、So x 2、O C T 4蛋白表达均显著降低(P0.001)(图 4B)。AControloh24hSh-NCsh-SHCBPI1.0-0.80.60.4-0.2-0-ControlNCControlBCMMP-2GAPDHMMP-9GAPDHsh-NC1.2-1.00.80.6-0.4.2-Controlsh-sh-SHCBP1Sh-SHCBPI-NC21.00.8-0.6-0.4-0.201.21.00.80.60.40.2Controlsh图3干扰SHCBP1可抑制HCC细胞迁移和侵袭A：划痕实验评估Hep3B细胞迁移能力;B:Transwell实验评估Hep3B细胞侵袭能力（结晶紫染色2 0 0);C:Westernblot分析转移相关蛋白表达(*P0.001 vs sh-NC)。Fig.3 Interference with SHCBPI suppresses HCC cell migration and invasionA:Wound healing assay assessed Hep3B cell migration.B:Transwell assay evaluated Hep3B cell invasion(Crystal violet staining 200).C:Examina-tion of the expression of proteins implicated in metastasis by Western blot(*P0.001 vs sh-NC).AControlsh-NCsh-SHCBP1BSox2OCT4-actinNanog-actinContr1.20.60.40.2NC1.21.00.80.60.40.21.2-1.00.80.60.40.2-0Control图4干扰SHCBP1可抑制HCC细胞干性A：体内成球实验检测Hep3B细胞成球能力（2 0 0）;B:Westernblot检测干性相关蛋白表达（*P0.001vssh-NC)。Fig.4Interference with SHCBPI suppresses HCC cell stemnessA:In vitro sphere formation assay evaluated the sphere formation ability of Hep3B cells(200).B:Examination of the expression of proteins implicatedin stemness by Western blot(*P0.001 vs sh-NC).现代肿瘤医学2 0 2 3年10 月第31卷第19期2.6KIF18A在HCC组织和细胞中高表达,并与 SHCBP1相互作用经ENCORI数据库分析发现,KIF18A在HCC组织中表达上调（图5A）；且KIF18A高表达与HCC患者总体生存率低相关（图5B）。ENCO RI数据库分析进一步发现，SHCBP1与KIF18A在HCC组织中呈显著正相关（图5C）。通过RT-qPCR实验发现与癌旁组织相比,KIF18A在HCC组织中表达升高（图5D）。此外,SHCBP1与KIF18A在HCC组织中A4226XCancerlog2(FPKM)Boxplot.GeneexpressionsD64MODERN ONCOLOGY,Oct.2023,VOL.31,No.19的表达呈正相关（图5E）。ST RING 数据库表明，SHCBP1与KIF18A存在潜在的互作关系（图5F）。同样,RT-qPCR和Western blot 检测结果表明,与人正常肝细胞系 HHL-5相比,KIF18A在肝癌细胞Hep3B中的表达水平显著升高（P0.001）（图5G)。Co-I P实验证实,SHCBP1与KIF18A存在靶向结合关系（图5HI）。实验结果进一步发现，与sh-NC组相较，sh-SHCBP1组KIF18A表达显著减少(P0.001)(图 5J)。KIF18Awith374cancerand50BOverall survival forKIF18Ain LIHCcancernormal samples inLIHCData Source:starBasev3.0 project(FPKM)3553C SHCBP1 vs KIF18A,374 samples(LIHC)Data Source:starBasev3.0project1.00Log-RankP=0.00067LowNum=1850.75HighNum=184Hazard Ratio=1.840.50Group0.25-HighLoW+(High,1)0+(Low,1)Normal log202550Time(months)E6-4Regression(y=0.8235x-0.7094)r=0.845,P-value=6.20e-1032024-675100125Fr=0.7706P0.001-87.5-5-2.502.55SHCBP1,Expresion level:log2(FPKM+0.01)KIF18ASHCBP1221:210G432S-THH1SHCBP1KIF18A0十NormalTumor*KIF18AGAPDHTHH1.21.00.80.60.450.20012345Relative SHCBP1mRNAexpressionHKIF18A2.01*工1.51.00.50.0-THH1.210.40.201.211.00.8SHCBP10.60.40.2J1.21.00.80.60.40.201.21.00.80.60.40.20andulKIF18A*工GAPDH1.00.80.60.40.20OHS-s*图5KIF18A在HCC组织和细胞中高表达，并与SHCBP1相互作用A:ENCORI数据库检测KIF18A在HCC组织中的表达;B:ENCORI数据库检测KIF18A表达与HCC患者总体生存率的关系;C:ENCORI数据库检测SHCBP1与KIF18A表达在HCC组织中的相关性;D:RT-qPCR检测KIF18A在HCC组织中的表达（*P0.001);E：采用Pear-Son相关分析SHCBP1与KIF18A表达在HCC组织中的相关性;F:STRING数据库预测SHCBP1与KIF18A的结合关系；G:RT-qPCR和Westernblot分析KIF18A在人正常肝细胞系和HCC细胞中的表达（*P0.001vsHHL-5);H-I:Co-IP实验验证SHCBP1与KIF18A间的结合关系;J:RT-qPCR和Westernblot检测干扰SHCBP1后KIF18A的表达（*P0.001vssh-NC)。Fig.5 KIF18A is highly expressed in HCC tissues and cells and interacts with SHCBP1A:ENCORI database examined KIF18A expression in HCC tissues.B:ENCORI database detected the correlation of KIF18A expression with the overallsurvival of HCC patients.C:ENCORI database detected the correlation between SHCBPI expression and KIF18A expression in HCC tssues.D:RT-qPCR examined KIF18A expression in HCC tissues(*P 0.001).E:Pearsons correlation analysis was employed to disclose the relationship be-tween the expressions of KIF18A and SHCBP1.F.STRING database predicted the binding relationship between SHCBP1 and KIF18A.G:Examination ofKIF18A expression in human normal hepatocyte line and HCC cells by RT-qPCR and Western blot(*P0.001 vs HHL-5).H-I:Co-IPassay verified the interaction between SHCBPland KIF18A.J:RT-qPCR and Western blot analyzed KIF18A expression after SHCBPI was silenced(*P0.001 vs sh-NC).35542.7上调KIF18A部分逆转了SHCBP1干扰对HCC细胞增殖、凋亡的作用为进一步验证SHCBP1是否通过与KIF18A相互作用进而调控HCC恶性进展，我们将KIF18A过表达质粒