沉默尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因OfUGT逆转亚洲玉米螟对Cry1Ie蛋白的抗性.pdf

39(4)834-841 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2023 年 8 月 收稿日期：2022-04-19 基金项目：现代农业产业技术体系（CARS-02）作者简介：林雅玲，硕士研究生，E-mail：；*通信作者，博士，副研究员，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2022.11.006 沉默尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因OfUGT逆转 亚洲玉米螟对Cry1Ie蛋白的抗性 林雅玲1,2，何康来1，王振营1，尚素琴2，张天涛1*（1.中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学全国重点实验室，北京 100193；2.甘肃农业大学植物保护学院，兰州 730070）摘要：转 Bacillus thuringiensis（Bt）基因作物在害虫防治中应用较多，但长期种植转 Bt 基因作物，靶标害虫不可避免会对杀虫蛋白产生抗性，如何进行抗性治理是当前面临的难题。本研究基于前期转录组分析结果，定量分析了尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因（OfUGT）在亚洲玉米螟 Cry1Ie 抗性品系（ACB-IeR）及敏感品系（ACB-BtS）的表达量，利用 RNA 干扰技术（RNAi）对 ACB-IeR 品系 OfUGT 基因进行沉默，并通过毒力测定试验来检验干扰效果。OfUGT 基因在 ACB-IeR 三龄幼虫中相对表达量高于 ACB-BtS，并且注射dsUGT后该基因表达量下降。Cry1Ie抗性品系的致死中浓度大于1000.00 g/g，在蛋白浓度为500.00 g/g时，注射 dsUGT 和 dsGFP 后的幼虫存活率没有显著性差异，但较空白对照组存活率显著降低；在蛋白浓度为 1000.00 g/g 时，注射 dsGFP 后的幼虫存活率较空白对照组降低，注射 dsUGT 后的幼虫存活率较空白对照和注射 dsGFP 的都显著降低。由结果可以看出 RNAi 沉默 OfUGT 基因后可以降低抗性品系亚洲玉米螟对 Cry1Ie 蛋白的抗性，但对抗性的逆转程度还需要后续更进一步的研究。关 键 词：亚洲玉米螟；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶；RNA 干扰；Cry1Ie；抗性逆转 中图分类号：S435.132 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2023)04-0834-08 Silencing of the UDP-glucuronyltransferase Gene(OfUGT)Reverses the Resistance of Ostrinia furnacalis to Cry1Ie LIN Yaling1,2,HE Kanglai1,WANG Zhenying1,SHANG Suqin2,ZHANG Tiantao1*(1.State Key Laboratory for the Biology of the Plant Diseases and Insect Pests/Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China;2.College of Plant Protection,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)Abstract:Bacillus thuringiensis(Bt)genetically modified crops are widely used in pest control,but with long-term planting of Bt genetically modified crops,the target pests will inevitably develop resistance to insecticidal proteins,and how to management the resistance is a difficult problem.Based on the results of previous transcriptome analysis,this study quantitatively analyzed the expression of UDP-glucuronyltransferase gene(OfUGT)in Cry1Ie resistant Asian corn borer strain(ACB-IeR)and susceptible strain(ACB-BtS).The OfUGT gene in ACB-IeR was silenced by RNA interference(RNAi)technology,and the effect of silencing OfUGT gene on ACB-IeR was evaluated by bioassay.The relative expression of the OfUGT gene in ACB-IeR third instar larvae was higher than that in ACB-BtS,and decreased after injection of dsUGT.The lethal concentration of the protein was greater than 1000.00 g/g in the Cry1Ie-resistant strain.When the protein concentration was 500.00 g/g,the survival rates of the dsUGT and dsGFP injected larvae did not have significant difference with control group.When the protein concentration was 1000.00 g/g,the survival rate of the dsGFP injected larvae was lower than control group,and the survival rate of dsUGT injected larvae was 第 4 期 林雅玲等：沉默尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因 OfUGT 逆转亚洲玉米螟对 Cry1Ie 蛋白的抗性 835 significantly lower than the control and dsGFP injected group.The results show that RNAi of the OfUGT gene could reduce the resistance of the resistant line of Asian corn borer to the Cry1Ie protein,but the reversal degree of resistance needs to be further studied.Key words:Ostrinia furnacalis;UDP-glucuronyltransferase;RNA interference;Cry1Ie;resistance reversal 亚洲玉米螟 Ostrinia furnacalis(Guene)（Asian corn borer，ACB）属鳞翅目 Lepidoptera，草螟科Crambidae，是玉米上重要的钻蛀性害虫，主要在心叶期和穗期造成为害，并且取食后的伤口更利于植物病原体的侵入1，对玉米的产量和品质造成直接或间接的损害，是制约玉米产业高质量发展的重要因素。苏云金芽胞杆菌 Bacillus thuringiensis（Bt）是迄今为止应用最成功的病原菌2。Bt 在孢子形成过程中产生的杀虫晶体蛋白对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等害虫具有特异性杀虫作用，但对人类和其他非靶标昆虫无害3,4。转 Bt 基因作物能够有效控制亚洲玉米螟，但长期种植转单一 Bt 基因作物，使害虫一直处于高选择压力之下，抗性的产生不可避免5。害虫的抗性进化是威胁转 Bt 作物杀虫效率的主要因素6。目前，对于抗性的治理可采用的策略主要是“高剂量/庇护所”策略和“多基因”策略7,8。但是 Kaduskar 等9利用 Crispr/cas9技术逆转黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 对拟除虫菊酯的抗性，使得利用基因编辑技术逆转昆虫的抗性成为一种可能。植物和昆虫之间的关系在不断发展，许多昆虫依靠生化策略来减轻在其食用植物中有毒化学物质的影响10。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UDP-glucuronosyl transferase，UGTs）参与糖基化反应，在植物体内是最大的糖基转移酶家族11，分布广泛，在动物、细菌及病毒中也皆存在。在 UGT 酶的催化下，供体分子的糖基可转移到受体分子的糖苷配基上，对溶解度、稳定性和生物活性都有影响12，从而使受体的性质发生改变，能将疏水性物质转变成水溶性物质13,14，糖基化反应使得糖苷具有更强的极性，更容易溶于水，毒性更小，更容易排出15。昆虫可通过 UGT 酶的糖基化反应将食物中的有毒物质降解，以减少有毒成分对其产生的为害，糖基化反应在生物体排除和抑制内生或外源性的有毒物质的过程中至关重要。草地贪夜蛾 Spodoptera frugiperda 利用 SfUGT33F28 基因特异的 dsRNA 干扰沉默特定的 UDP-糖基转移酶使得玉米防御性物质苯并噁嗪类化合物失活，证明了 UGT 酶在体内糖基化中的作用16。然而，对昆虫 UGT 基因的特性，尤其是在功能水平上的研究仍然很少，对这种解毒酶超家族的研究不如细胞色素 P450 单加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase，P450）、谷胱甘肽 S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）和羧酸酯酶（carboxylesterase，CarE）等解毒酶的深入。RNA 干扰（RNA interference,RNAi）是通过双链 RNA（double-stranded RNA,dsRNA）诱导细胞内基因沉默的现象，dsRNA 降解了 mRNA 或调控靶标基因的表达，从而表现出相应的功能缺陷。RNAi 技术在病虫害防治中展示出巨大的应用潜力，且因其有效性和潜在靶标基因的多样性不易与其他杀虫剂等产生交互抗性，因此成为一种新兴的病虫害防控手段17,18。RNAi 技术在昆虫基因功能的研究方面应用较多，昆虫许多重要基因功能应用 RNAi 技术而得到阐明。Yang 等19使用 GST 基因特异的干扰 dsRNA 饲喂稻飞虱Nilaparvata lugens 若虫后继续饲喂含阿魏酸的饲料，发现若虫死亡率显著高于饲喂对照饲料的若虫，RNA干扰后增强了阿魏酸对稻飞虱的毒性。还有研究通过饲喂亚洲玉米螟膜结合海藻糖酶基因 dsRNA，发现48 h 后幼虫中肠几丁质合成酶基因表达量下降，并且导致幼虫发育迟缓，因此推测膜结合海藻糖酶基因可能是防治亚洲玉米螟的靶标基因20。本研究基于前期对抗性和敏感亚洲玉米螟转录组比较筛选出尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因OfUGT（GenBank 登录号：XM_028311489.1）21，为进一步研究其功能，我们以亚洲玉米螟抗 Cry1Ie 蛋白品系为研究对象，利用 RNAi 方法沉默该基因，明确沉默该基因后对抗性品系耐药性的影响。1 材料与方法 1.1 供试材料 1.1.1 供试昆虫 亚洲玉米螟各种群均饲养于中国农业科学院植物保护研究所玉米害虫组。饲养条件为温度（271），相对湿度 70%80%，光周期 16L:8D。敏感品系（ACB-BtS）在室内使用无琼脂半人工836 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 饲料22饲养，未接触任何Bt 制剂或蛋白；Cry1Ie 抗性品系是以敏感品系为虫源，在饲料中加入一定量 Cry1Ie蛋白筛选得到。1.1.2 供试蛋白 试验所用 Cry1Ie 蛋白购自北京安百胜生物科技有限公司。1.2 UGT 基因序列分析 通过 EditSeq 软件查找序列开放阅读框。利用 DNAMAN 软件进行氨基酸的翻译。1.3 UGT 基因在亚洲玉米螟不同品系中表达量测定 将亚洲玉米螟 3 龄幼虫置于冰上，待其昏迷后，用镊子取出肠道，放入 PBS 缓冲液中，剪去后肠，用解剖针将中肠撕开，洗去内容物，放到蒸馏水中再清洗一遍，用滤纸吸干水份，放入 200 L Trizol 中，5头幼虫中肠为 1 个处理，每个处理 3 个重复。采用 Trizol 法提取总 RNA，经 1%琼脂糖凝胶电泳检测质量和 Nanodrop 2000（Thermo Scientific，USA）测定浓度后，使用 TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（TransGen Biotech，China）试剂盒反转录成 cDNA 用于 qRT-PCR 试验。使用 Primer 3PLUS 设计引物，对引物的扩增效率进行验证后用于 qRT-PCR，以亚洲玉米螟核糖体蛋白 L8 OfRPL8（登录号：NW_021132278）基因为内参基因23，采用 2CT方法24计算目的基因的相对表达量。qRT-PCR 反应体系使用 PerfectStart Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech，China）试剂盒，采用 20 L 反应体积，包含 10 L 2PerfectStart Green qPCR SuperMix、0.8 L 正向引物、0.8 L 反向引物、0.4 L passive reference dye（50）、1.0 L cDNA 模板和 7.0 L 无离子水。使用 ABI 7500 fast real-time PCR系统，采用两步法进行反应，95 变性 30 s 后进行 40 次循环：95（10 s）和 60（20 s），然后进行熔解曲线分析，评价扩增的特异性。1.4 dsRNA 合成及沉默效率验证 采用 T7 Ribo MaxTM Express RNAi System（Promega，USA）试剂盒合成 dsRNA；dsRNA 纯化后测定浓度并分装保存于80 冰箱中备用。随机选取 Cry1Ie 抗性品系 3 龄幼虫注射，以注射 GFP 基因 dsRNA 的幼虫为对照，通过 qRT-PCR 检测对 UGT 基因沉默效率。将 3 龄亚洲玉米螟幼虫放到冰上麻醉 5 min，使用 NANOJECT（Drummond，USA）显微注射器将体外合成 UGT 基因的 dsRNA 从第 3 对腹足注射到幼虫体内，每头幼虫注射 100.00 nL浓度为 3000.00 ng/L 的 dsRNA，注射相同含量 GFP dsRNA 的幼虫为对照，每组处理各注射 45 头；24 h、48 h 及 72 h 后分离中肠，并提取总 RNA，使用 qRT-PCR 进行定量分析。每个处理包括 3 个生物学重复，每个重复 5 头幼虫。1.5 沉默 UGT 基因前后生测试验 将3 龄幼虫注射 300.00 ng 的 dsRNA后，放到普通饲料饲养 48 h 后，转移到蛋白毒素浓度为 500.00 g/g和 1000.00 g/g 的饲料上进行试验，设置空白对照组 CK，7 d 后统计存活数，比较注射 dsUGT 和 dsGFP后的致死效果。1.6 数据统计与分析 使用 Excel 2016 进行数据处理和分析。利用 GraphPad Prism 9.0 软件进行差异显著性分析（P0.05）。2 结果与分析 2.1 UGT 基因序列分析 OfUGT（XM_028311489.1）cDNA 序列全长 1610 bp，开放阅读框的长度为 1545 bp，编码 514 个氨基酸（图 1），相对分子质量为 187.47 kDa，等电点（PI）为 6.57。2.2 UGT 基因在亚洲玉米螟抗性和敏感品系中表达量差异 与敏感品系相比，UGT 基因在 ACB-IeR 中相对表达量显著增高 22.52 倍（P0.0026）（图 2）。试验中所用引物列于表 1。2.3 亚洲玉米螟抗性品系注射 UGT 基因和 GFP 的 dsRNA 后表达量差异 注射 dsRNA 后，24 h、48 h 及 72 h 的亚洲玉米螟目的基因 UGT 的相对表达量均低于对照 GFP（图 3），第 4 期 林雅玲等：沉默尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因 OfUGT 逆转亚洲玉米螟对 Cry1Ie 蛋白的抗性 837 图 1 亚洲玉米螟 OfUGT 基因开放阅读框及其推导的氨基酸序列 Fig.1 Open reading frame of the O.furnacalis UGT gene and its deduced amino acid sequence ACB-BtSACB-IeR010203040*注：“*”表示差异极显著（P0.01）。Note:“*”means extremely significant difference(P0.01).图 2 OfUGT 基因在亚洲玉米螟抗性品系（ACB-IeR）和敏感品系（ACB-BtS）3 龄幼虫中的表达量 Fig.2 The expression of OfUGT in resistant strain(ACB-IeR)and susceptible strain(ACB-BtS)of Asian corn borer 3rd instar larvae 表 1 qRT-PCR 和合成 dsRNA 所用引物 Table 1 Primers for qRT-PCR and dsRNA synthesis 引物用途 Usage of primers 基因 Gene 引物序列 Primer sequence(53)OfUGT-F ACCTTGGTGGGATGCATCAG OfUGT-R GGAGTGCGTCCAGGTAGTTC OfRPL8-F ACTGCGGAAAGAAGGCTACA 实时荧光定量 PCR qRT-PCR OfRPL8-R ACGTTTGGCATCAGGATTGT dsUGT-F ggatcc taatacgactcactataggTCCCAAATGGAACTGCACCA dsUGT-R ggatcc taatacgactcactataggCGTTGAGTTTCTCTCGCAAGG dsGFP-F ggatcc taatacgactcactataggGTGGTCCCAATTCTCGTGGAAC 合成双链 RNA Synthesis dsRNA dsGFP-R ggatcc taatacgactcactataggGCTTGAAGTTGACCTTGATGCC 注：引物中小写字母表示 T7 启动子序列。Note:The lowercase letters in primers indicate T7 promoter sequence.838 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 dsGFP00.51.01.524 hns00.51.01.548 h*00.51.01.572 h*dsUGTdsGFPdsUGTdsGFPdsUGT 注：柱形图中“ns”表示同一时间处理组与对照组间差异不显著；“*”表示差异显著（P0.05）；“*”表示差异极显著（P0.01）。Note:“ns”means no significant difference between the treatment group and the control group at the same time;“*”means significant difference(P0.05);“*”means extremely significant difference(P0.01).图 3 RNA 干扰对 Cry1Ie 亚洲玉米螟抗性品系 3 龄幼虫 UGT 基因相对表达量的影响 Fig.3 Effects of RNAi on relative expression of UGT gene in Cry1Ie ACB-IeR 3rd instar larvae 且处理后 48 h 显著降低 75%（P0.0053），处理后 72 h 显著降低 60%（P0.0101）。结果表明，通过显微注射 dsRNA 能够沉默亚洲玉米螟 UGT 基因。2.4 沉默抗性品系亚洲玉米螟 UGT 基因后对 Cry1Ie 蛋白抗性变化 经过基因沉默效率验证，结果表明在处理后 48 h，对 Cry1Ie 抗性品系中 UGT 基因沉默效率最高。因此，在注射 dsRNA 48 h 后进行生测，将幼虫转移至浓度为 500.00 g/g 和 1000.00 g/g 的混合 Cry1Ie 蛋白的人工饲料上，7 d 后，对照组在蛋白毒素浓度为 1000.00 g/g 时的存活率较浓度为 500.00 g/g 时降低4.17%，但无显著性差异；亚洲玉米螟注射 dsGFP 后在不同浓度蛋白中存活率也无显著性差异，但注射dsUGT 后亚洲玉米螟在蛋白毒素浓度为 1000.00 g/g 时的存活率显著降低（P0.001，图 4）。在蛋白毒素浓度为 500.00 g/g 时，注射 dsUGT 和 dsGFP 的抗性亚洲玉米螟存活率无显著性差异，分别为 80.56%和 81.94%；在蛋白毒素浓度为 1000.00 g/g 时，注射 dsUGT 后的抗性玉米螟较注射 dsGFP 的存活率显著降低（P0.01），分别为 55.56%和 79.17%（表 2）。表 2 不同处理亚洲玉米螟 Cry1Ie 抗性品系 3 龄幼虫在不同浓度 Cry1Ie 蛋白饲料上的存活率 Table 2 Survival rates of different treated Cry1Ie ACB-IeR 3rd instar larvae at different concentrations of Cry1Ie protein Cry1Ie 蛋白蛋白浓度 Cry1Ie protein concentration(g/g)不同处理 Different treatment 存活率 Survival rate(%)CK 90.281.97 A dsGFP 81.941.96 B 500.00 dsUGT 80.561.96 B CK 86.111.97 a dsGFP 79.173.40 a 1000.00 dsUGT 55.565.20 b 注：相同字母表示没有显著性差异，不同字母表示具有极显著性差异（P0.01）。大写和小写字母分别代表不同浓度。Note:The same letter means no significant difference,and different letters mean extremly significant difference(P0.01).Uppercase and lowercase letters represent different concentrations.3 讨论 靶标害虫对 Bt 毒素的抗性是影响转基因作物长期使用的关键，昆虫抵抗外源性有毒物质的机制十分复杂25，因此，了解抗性的产生原因对于开发和实施新的病虫控制策略非常重要。对抗性产生关键基因进行改造，实施针对性的研究成为迫切的需要。Kaduskar 等9使用 CRISPR/Cas9 编辑的果蝇抗性品系逆转了对拟除虫菊酯的抗性，使得将抗杀虫剂种群恢复到敏感状态成为可能，这种成功的先例使我们看到利用基 第 4 期 林雅玲等：沉默尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶基因 OfUGT 逆转亚洲玉米螟对 Cry1Ie 蛋白的抗性 839 存活率 Survival rate(%)注：柱形图中“ns”表示不同浓度间存活率差异不显著；“*”表示差异极显著（P0.001）。Note:“ns”means no significant difference between different concentrations;“*”means extremely significant difference(P0.001).图 4 亚洲玉米螟 Cry1Ie 抗性品系幼虫沉默 UGT 基因后在不同浓度 Cry1Ie 蛋白饲料上的存活率比较 Fig.4 Comparison of survival rates of Cry1Ie ACB-IeR larvae with the knockdown UGT gene on different concentrations of Cry1Ie protein 因编辑技术逆转昆虫抗性的可能性。故而，当前研究利用 RNAi 方法验证 UGT 基因在抗性亚洲玉米螟中的功能，为逆转亚洲玉米螟对 Bt 毒素的抗性奠定基础。解毒酶是昆虫代谢杀虫剂和植物次生物质的主要措施之一，在降解外源性有毒物质发挥着重要的作用26。昆虫主要的三大解毒酶是 P450、GST 和 CarE27，此外，有报道认为 UGTs 在昆虫解毒过程中也扮演重要角色28。UGT 酶属二相代谢酶，它通过糖苷结合参与多种亲脂性物质的生物转化，从而达到解毒和排除外源有毒物质的作用29。前人研究发现昆虫可以利用 UGTs 代谢寄主植物中的有毒物质，如亚洲玉米螟可利用 UGT 酶降解玉米中的有毒物质环状异羟肟酸（cyclic hydroxamic acids，cHx）30。此外，Li 等29对小菜蛾 Plutella xylostella 中的 UGT 进行了全基因组鉴定，当小菜蛾暴露于杀虫剂的半致死浓度时大多数 UGT基因的表达受到影响。可见，昆虫对 Bt 毒素产生抗性可能不仅仅与受体基因突变或缺失相关，值得注意的是，相关研究表明 UGT 与几种昆虫对氯虫苯甲酰胺、拟除虫菊酯、噻虫嗪等杀虫剂的抗性有关，UGT基因被抑制后可增加昆虫对杀虫剂的敏感性。Pan 等31研究发现 UGT344M2 基因被抑制后显著增加了抗性品系棉蚜 Aphis gossypii 若虫对螺虫乙酯的敏感性。还有报道指出32，UGT2B17 基因在四个氯虫苯甲酰胺抗性品系中相对表达量上调，RNAi 沉默该基因后，氯虫苯甲酰胺对小菜蛾的毒性显著增加；并且该研究在使用 UGT 酶抑制剂磺吡酮和 5-硝基尿嘧啶处理后，氯虫苯甲酰胺对小菜蛾 3 龄幼虫的毒性也显著增加了，由此推断 UGT 基因表达量的上调可能在昆虫对杀虫剂产生耐药性中起重要作用。此外，Du 等33从转录组数据中鉴定并克隆了烟粉虱 Bemisia tabaci 两个 UGT 基因，命名为 UGT352A4 和 UGT352A5，RT-qPCR验证两个 UGT 基因在噻虫嗪抗性品系中相对于敏感品系过度表达，并且 RNAi 后，UGT352A5 在烟粉虱抗性品系中表达量下降，导致了抗性品系死亡率显著升高。这是解毒基因在外源有毒物质代谢分解中起关键作用的证据。与前人报道一致，当前研究的 UGT 基因（XM_028311489.1）在 ACB-IeR 中相对表达量与 ACB-BtS相比显著上调。ACB-IeR 3 龄幼虫注射 dsUGT 后，UGT 基因表达量下降。Cry1Ie 抗性品系 3 龄幼虫在 Cry1Ie蛋白浓度为 1000.00 g/g 时存活率为 86.11%，故其致死中浓度大于 1000.00 g/g，所以对照组在 Cry1Ie蛋白浓度为 1000.00 g/g 时的存活率低于浓度为 500.00 g/g 时，但无显著性差异。在浓度为 500.00 g/g的 Cry1Ie 蛋白毒素中，注射 dsUGT 和 dsGFP 后的幼虫的存活率没有显著性差异，但较空白对照组存活率显著降低；然而注射 dsGFP 后的幼虫在浓度为 1000.00 g/g 的 Cry1Ie 蛋白毒素中存活率较空白对照组降低，但无显著性差异，推测是由于注射造成的伤害带来的差异。此外，注射dsUGT后的幼虫在浓度为1000.00 g/g 的 Cry1Ie 蛋白毒素中的存活率较空白对照和注射 dsGFP 的都显著下降，由此可以看出 RNAi 沉默840 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 OfUGT 基因后可以降低抗性品系亚洲玉米螟对 Cry1Ie 蛋白的抗性，但对抗性的逆转程度还需要后续更进一步的研究。参 考 文 献 1 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