3-1-重组DNA技术的基本工具高二生物课后培优分级练(解析版).docx

3.1 重组DNA技术的基本工具
知识梳理

教学目标
课程标准
目标解读
基因工程是一种重组DNA技术。
1. 概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。
2. 阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
1. 阐明重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。
2. 认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
3. 进行DNA的粗提取和鉴定。
教学重点
1. 重组DNA技术所需的三种基本工具的作用。
2. DNA粗提取和鉴定。
教学难点
1. 基因工程载体需要具备的条件。

2. DNA的粗提取和鉴定。

一、基因工程
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术、基因拼接技术。
操作对象：基因
操作水平：DNA分子水平
操作原理：基因重组
操作环境：体外
基本过程：剪切→拼接→导入→表达
操作结果：定向地改造生物的遗传性状，获得符合人们需要的新的生物类型和生物产品
优点：定向改造生物体的性状，目的性强（与诱变育种相比）
育种周期短，克服远缘杂交不亲和障碍（与杂交育种相比）

二、基因工程的基本工具
1.“分子手术刀”—— 限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要从原核生物中分离出来。
（2）种类：约4000种
（3）作用:识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

（4）限制酶识别序列的长度最常见的为6个核苷酸，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个、或其他数量的核苷酸组成。
①在中轴线两侧切割，形成黏性末端。如：EcoRI限制酶能识别GAATTC序列，为6个核苷酸，并在G和A之间切开。

②在中轴线处切割，形成平末端。如：Sma I限制酶能识别CCCGGG序列，为6个核苷酸，并在G和C之间切开

2.“分子缝合针”—— DNA连接酶
(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。即把脱氧核糖和磷酸交替连接而构成的DNA骨架上的缺口连接起来。
(2)类型：

3.“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体
（1）载体作用：将目的基因载入受体细胞。利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。
（2）载体种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等
（3）最常用载体：质粒

特点：
①裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA外，具有自我复制能力的环状双链DNA。
②有一个至多个限制酶切割位点。
③在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
④有特殊的标记基因，如：抗生素的抗性基因（四环素抗性基因(tetr)、氨苄青霉素抗性基因(ampr)等）、荧光蛋白基因（绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)。
⑤对细胞无毒无害。
⑥大小适中，便于提取和操作。

三、DNA的粗提取与鉴定
（一)提取生物大分子的基本思路
选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
DNA粗提取的基本思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
（二)提取DNA的基本原理
1.DNA在NaCl中的的溶解性：

在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。当氯化钠的物质的量浓度为2mol/L时，DNA的溶解度最大；浓度为0.14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出。
2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
（1）对酶的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA没有影响。
（2）对温度的耐受性：大多数蛋白质不能忍受60～80 ℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性。
（3）对洗涤剂的耐受性：洗涤剂能够瓦解细胞膜，去除脂质和蛋白质但对DNA没有影响。
3.DNA在酒精溶液中的溶解性
DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。将DNA与蛋白质进一步分离。
（三）DNA的鉴定
沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色

课后培优练级练

培优第一阶——基础过关练
一、单选题
1. 下列有关基因工程的说法不正确的是（）
A. 基因工程得以实现的原因之一是不同的生物DNA的结构相同
B. 限制酶和DNA连接酶作用的化学键相同
C. EcoliDNA连接酶可以连接黏性末端和平末端
D. 质粒存在于原核细胞和某些真核细胞中
【答案】
C 
【解析】
【分析】
本题考查基因工程的知识点，熟知基因工程的原理和操作工具是解题的关键，题目难度适中。
【解答】
A.基因工程得以实现的原因之一是不同的生物DNA的结构相同，A正确；
B.限制酶和DNA连接酶作用的化学键相同，都是磷酸二酯键，B正确；
C.E.coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，可用于连接黏性末端和平末端，C错误；
D.质粒一般存在原核细胞体内，但是真核细胞也有，比如酵母菌，酵母菌的质粒存在于细胞质中，D正确。
​故选C。  
2. 我国科学家将含有人凝血因子基因的DNA片段注射到羊的受精卵中，由该受精卵发育而成的羊，分泌的乳汁中含有人的凝血因子，可治疗血友病。下列叙述错误的是(   )
A. 该羊分泌的乳汁中含有人的凝血因子基因
B. 该羊的后代也可能含有人的凝血因子基因
C. 这项研究说明人和羊共用一套遗传密码
D. 这项技术的工具包括限制酶、DNA连接酶和运载体
【答案】
A 
【解析】
【分析】
​本题考查基因工程及其应用相关知识，意在考查学生理解所学知识要点，把握知识间内在联系的能力，本题解题关键是理解凝血因子是基因表达产物。
【解答】
A.凝血因子基因不会进入到的羊分泌的乳汁中，A错误；
B.该羊是由转基因受精卵发育而成的羊，因此其生殖细胞中可能含有人凝血因子基因的DNA片段，可能传递给后代，B正确；
C.自然界中所有生物都共用一套遗传密码，这是生物界共性，C正确；
D.基因工程所使用的工具包括限制酶、DNA连接酶和运载体，D正确。
​故选A。  
3. 下列提到的物质不是基因工程常用的工具的是（）
①限制性核酸内切酶    ②DNA聚合酶   ③DNA连接酶   ④运载体   ⑤解旋酶．
A. ②④⑤ B. ①③④ C. ①②③ D. ②⑤
【答案】
D 
【解析】
【分析】
本题考查基因工程的相关知识，重点考查基因工程的工具，要求考生识记基因工程常用的工具及其作用，能根据题干要求做出准确的判断，属于考纲识记层次的考查。
DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。
1、限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
2、DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
3、运载体：常用的运载体有质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
【解答】
①限制性核酸内切酶是基因工程常用的工具，用于获取目的基因和构建基因表达载体，①错误；   
②DNA聚合酶不是基因工程常用的工具，②正确；
③DNA连接酶是基因工程常用的工具，用于构建基因表达载体，③错误；   
④运载体是基因工程常用的工具，用于将目的基因导入受体细胞，④错误；   
⑤解旋酶不是基因工程常用的工具，⑤正确。
故选D。  
4.  下列有关基因工程基本工具的叙述,错误的是 ( )
A. DNA连接酶与限制酶作用的化学键相同
B. 限制酶可以对烟草花叶病毒的核酸进行切割
C. 载体质粒的复制和表达也遵循中心法则
D. E·coli DNA连接酶来自大肠杆菌,只能连接黏性末端
【答案】
B 
【解析】
【分析】
本题考查基因工程基本工具相关知识，意在考查学生的识记与理解能力。
【解答】
A.DNA连接酶与限制酶都作用于磷酸二酯键，A正确；
B.烟草花叶病毒的核酸是RNA，限制酶切割的是DNA，B错误；
C.质粒是一种小型环状DNA分子，其复制和表达的过程也遵循中心法则，C正确；
D.E·coli DNA连接酶是从大肠杆菌中分离获得的，它只能连接黏性末端，D正确。  
5. 某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶（Amy）基因a，通过基因工程的方法，将基因a与载体结合后导人马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。结合图形分析下列有关这一过程的叙述，正确的是（）

A. 获取基因a的限制酶的作用部位是图中的①
B. 基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶、质粒
C. 连接基因a与载体的DNA连接酶的作用部位是图中的②
D. 一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子
【答案】
A 
【解析】
【分析】
本题考查基因工程，意在考查学生对知识的理解和记忆能力、分析题图获取信息的能力。
图中为某DNA分子片段，其中①部位为磷酸二酯键，是限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶的作用位点；②部位为氢键，是解旋酶的作用位点。
【解答】
A.获取基因a的限制酶其作用部位是图中的①磷酸二酯键，A正确；
B.基因工程所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶，B错误；
C.连接基因a与运载体的DNA连接酶其作用部位是图中的①磷酸二酯键，C错误；
D.一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子，D错误。
故选A。  
6. 下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是（）

基因供体
基因剪刀
基因针线
运载体
受体细胞
A
提供目的基因的生物
限制酶
DNA连接酶
质粒
大肠杆菌等
B
提供目的基因的生物
DNA连接酶
限制酶
质粒
大肠杆菌等
C
质粒
限制酶
DNA连接酶
提供目的基因的生物
大肠杆菌等
D
大肠杆菌等
DNA连接酶
限制酶
提供目的基因的生物
质粒
A. A B. B C. C D. D
【答案】
A 
【解析】
【分析】
本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及操作工具和操作步骤，能正确区分供体、受体，再结合所学的知识做出准确的判断。
1、基因工程又叫DNA重组技术，是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
2、基因工程的工具：
（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。
（2）DNA连接酶：连接的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
（3）运载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
【解答
基因工程中，供体是提供目的基因的生物，分子手术刀是限制性核酸内切酶，分子缝合针是DNA连接酶，载体常用质粒、噬菌体和动植物病毒，受体是大肠杆菌等。
故选A。  
7. 下列关于DNA连接酶的叙述，正确的是( )
①催化相同黏性末端的DNA片段之间的连接　②催化不同黏性末端的DNA片段之间的连接　③催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成　④催化两个核苷酸之间的磷酸二酯键的形成
A. ①③ B. ②④ C. ②③ D. ①④
【答案】
D 
【解析】
【分析】
本题考查基因工程的原理及技术，意在考查学生能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，形成知识的网络结构。
DNA重组技术至少需要两种工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、运载体；限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂；DNA连接酶：两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，形成重组DNA。
【解答】
①催化相同黏性末端的DNA片段之间的连接，形成磷酸二酯键，①正确；
②不同黏性末端的DNA片段之间不能连接，②错误；
③两个黏性末端互补碱基间氢键不需要酶的催化，③错误；
④DNA连接酶催化两个核苷酸之间的磷酸二酯键的形成，④正确；
综上所述，②③错误，①④正确，ABC错误，D正确。
故选D。  
8. 大肠杆菌经溶菌酶和阴离子去垢剂（SDS）处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中。利用上述原理可初步获得质粒DNA。下列关于质粒的粗提取和鉴定的分析错误的是（　　）

A. DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以用冷酒精析出上清液中的DNA
B. DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA
C. 用限制酶I和Ⅱ处理提取的产物，电泳出现图结果，说明未提取到质粒
D. 用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果
【答案】
C 
【解析】
【分析】
本题考查基因工程和质粒DNA的提取和鉴定，需要掌握实验的目的，流程及注意事项，需【解答】
1、DNA的鉴定：在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
2、DNA不容易酒精溶液，细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离。
A、通过分析可知，DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精，可以用冷酒精析出上清液中的DNA，A正确；
B、DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液，这样可以去除DNA中的某些杂质，提取的DNA可用二苯胺试剂在沸水加热条件下生成蓝色，B正确；
C、限制性酶Ⅰ和限制性酶Ⅱ处理提取的产物，只得到一条带，说明提取物是环状DNA，即提取物为质粒，C错误；
D、用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果，D正确。
故选：C。  
9. 如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是（   ）

A. ①②③④ B. ①②④③ C. ①④②③ D. ①④③②
【答案】
C 
【解析】
【分析】 
本题考查了不同酶作用原理的相关知识。意在考查考生能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系，形成知识网络结构的能力。此题容易混淆，基本知识必须扎实，易混知识必须区分清楚。 
【解答】
1.限制性核酸内切酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，如①形成末端；
2.DNA聚合酶将一个个脱氧核苷酸连接起来，形成子链，如④；
3.DNA连接酶是同时连接DNA双链的切口，在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，如②；
4.解旋酶是解开两条链之间的氢键，如③。
综上所述，C正确，ABD错误。
​​​​​​​故选C。 
二、填空题
10. 实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作，请根据表格回答问题。
试管
A
B
1
加2mol/L的NaCl溶液5mL
加2mol/L的NaCl溶液5mL
2
不加
加入提取的DNA丝状物并搅拌
3
加4mL二苯胺，混匀
加4mL二苯胺，混匀
4
沸水浴5min
沸水浴5min
实验现象
①
②
实验结论
③

（1）根据上图，完成表格空白处的实验内容。
①______________________________________________________________________________；
②______________________________________________________________________________；
③_________________________________________
（2）对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何？______________________________。
（3）在沸水浴中加热的目的是_____________________________________________________，同时说明DNA对高温有较强的____________。
（4）A试管在实验中的作用是____________。
（5）B试管中溶液颜色的变化程度主要与______________________________________有关。
【答案】
（1）溶液不变蓝色；溶液逐渐变蓝色；DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色（2）溶液颜色基本不变
（3）加快颜色反应速度；耐受性
（4）对照
（5）加入试管中的DNA的多少 
11. 人乳铁蛋白是一种重要的药用保健蛋白。下图表示利用乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白的过程，图中Tetr表示四环素抗性基因，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，五种限制酶的识别序列及切割位点如表所示，请回答以下问题：

限制酶
BamHⅠ
HaeⅢ
BclⅠ
Sau 3A Ⅰ
NotⅠ
识别序列
及切割位点

（1）①过程常采用的方法是_______。
（2）要将人乳铁蛋白基因插入质粒，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是_____。
（3）据图分析，筛选含有重组质粒的受体细胞首先需要在含_______（填“四环素”或“氨苄青霉素”或“四环素或氨苄青霉素”）的培养基上进行。
（4）若BamH I酶切的DNA末端与BclI酶切的DNA末端连接起来，连接部位的6个碱基对序列为____________，对于该部位，这两种酶________（“都不能”或“只有一种能”）切开。
【答案】
（1）显微注射法
（2）Sau3AⅠ
（3）氨苄青霉素
（4） ；都不能 
【解析】
【分析】
本题考查基因工程的知识点，熟知基因工程的原理和操作过程是解题的关键，题目难度适中。
【解答】
（1）①过程将目的基因导入动物细胞，常采用的方法是显微注射法。
（2）从表中可知，Sau3AⅠ可以切割限制酶BclⅠ和BamHⅠ的识别序列，因此要将人乳铁蛋白基因插入质粒，若只允许使用一种限制酶，应选择的限制酶是Sau3AⅠ。
（3）据图分析，Sau3AⅠ切割破坏了四环素抗性基因，但不会破坏氨苄青霉素抗性基因，所以筛选含有重组质粒的受体细胞首先需要在含氨苄青霉素的培养基上进行。
（4）若BamH I酶切的DNA末端与BclI酶切的DNA末端连接起来，连接部位的6个碱基对序列为，对于该部位，这两种酶都不能切开。
故答案为：
（1）显微注射法
（2）Sau3AⅠ
（3）氨苄青霉素
（4） ；都不能  

培优第二阶——拓展培优练
一、 单选题
1. 关于基因工程下列说法正确的有（）
①限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列  ②基因工程是在DNA上进行的分子水平的设计施工  ③重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶和运载体  ④只要目的基因进入受体细胞就能成功实现表达  ⑤所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列   ⑥基因工程可以将一种生物的优良性状移植到另一种生物身上  ⑦质粒是基因工程中惟一用作运载目的基因的运载体
A. 2项 B. 3项 C. 4项 D. 5项
【答案】
A 
【解析】
【分析】
本题属于简单题，属于考纲中识记层次的要求，考查了基因工程的工具和操作步骤等方面的知识，要求考生能区分工具和工具酶，并且理解细菌作为受体细胞的优点等知识。 
1、基因工程：是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 
2、基因工程技术的基本步骤： 
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 
3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
【解答】 
①一种限制酶都只能识别一种特定的核苷酸序列，其具有特异性，所以限制酶的切口不都是GAATTC碱基序列，①错误； 
②基因工程又称转基因技术，是在DNA上进行的分子水平的设计施工，②正确； 
③重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、DNA连接酶，运载体不属于工具酶，③错误； 
④目的基因进入受体细胞需要检测和鉴定，不一定能成功实现表达，④错误； 
⑤一种限制酶都只能识别一种特定的核苷酸序列，即具有特异性，⑤错误； 
⑥基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，因而可以将一种生物的优良性状移植到另一种生物身上，⑥正确； 
⑦基因工程常用的运载体有质粒噬菌体的衍生物、动植物病毒等，⑦错误。 
综上，A正确，BCD错误。
故选A。  
2. 下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图 1、图 2 中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列说法正确的是（）

A. 重组 DNA 技术所用的工具酶是限制酶、DNA 连接酶和运载体
B. 只有用同种限制酶切割 DNA 产生的粘性末端才能互补
C. 用图中质粒和外源基因 DNA 构建重组质粒，可使用 SmaⅠ切割
D. 使用 EcoRⅠ同时处理质粒和外源 DNA，可能会发生质粒或者目的基因的自身环化
【答案】
D 
【解析】
【分析】
本题考查了基因工程的工具和操作步骤等方面的知识，要求考生能认真审题并区分工具和工具酶、熟悉基因工程的操作步骤等知识是解题关键。DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。每一种限制酶都具有特异性。
【解答】
A.重组 DNA 技术中常用的工具酶有限制酶和DNA连接酶，运载体不属于工具酶，A错误；
B.可用同种限制酶切割DNA 产生互补的粘性末端，也可用双酶切法切割DNA产生互补的粘性末端，B错误；
C.若使用SmaⅠ切割质粒和外源基因DNA 会导致质粒中抗生素抗性基因（标记基因）和目的基因被破坏，C错误；
D.使用 EcoRⅠ同时处理质粒和外源DNA，可能会产生质粒与质粒的结合、目的基因与目的基因的结合即自身环化，D正确。
故选D。  
3. 番茄红素（C40H56）是一种重要的类胡萝卜素，具有较强的抗氧化活性，能防止动脉粥样硬化和冠心病等，目前利用基因工程生产的大肠杆菌能大量生产番茄红素。据此有关的下列叙述，正确的是（  ）
A. 该大肠杆菌细胞内含4种碱基、4种核苷酸
B. 番茄红素在核糖体上合成，经加工分泌到细胞外
C. 该大肠杆菌可遗传变异来源有基因突变和基因重组
D. 基因工程常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和运载体
【答案】
C 
【解析】A、大肠杆菌细胞内含有两种核酸: DNA和RNA，DNA中含有A、C、G、T四种碱基，RNA中含有A、C、G、U四种碱基，因此该大肠杆菌细胞内含5种碱基、8种核苷酸（4种脱氧核苷酸和4种核糖核苷酸)，A错误;
B、核糖体是蛋白质合成的场所，番茄红素是一种类胡萝卜素，不属于蛋白质，B错误;
C、由题意"利用基因工程生产的大肠杆菌能大量生产番茄红素"可知:该大肠杆菌可遗传变异来源有基因突变和基因重组，C正确;
D、基因工程常用的工具有限制酶、DNA连接酶和运载体，其中限制酶和DNA连接酶属于工具酶，D错误。
故选C。
4. 下列关于载体的叙述中，错误的是（）
A. 载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子
B. 对某种限制酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点
C. 目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒
D. 载体具有某些标记基因，便于对其进行切割
【答案】
D 
【解析】
【分析】
关于运载体，考生可以从以下几方面把握：
（1）常用的运载体：质粒（质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并具有自我复制能力的双链环状DNA分子）、噬菌体的衍生物、动植物病毒。
（2）作为运载体必须具备的条件：①要具有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选③能在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。
（3）天然的质粒不能直接作为载体，基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
本题考查运载体的相关知识，要求考生识记基因工程常用的运载体种类，掌握基因表达载体的构建过程及作为基因工程运载体需要具备的条件，能结合所学的知识作出准确的判断。
【解答】
A.运载体与目的基因结合后，就会形成一个重组DNA分子，A正确；
B.运载体中，对某种限制酶而言，最好只有一个切点，但还要有其他多种限制酶的切点，便于与目的基因定向连接，B正确；
C.目前常用的运载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒，C正确；
D.运载体上要具有某些标记基因，便于筛选重组子，D错误。
故选D。
5. 某种线性DNA含有限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ的1个酶切位点。该DNA样品(甲)经EcoR Ⅰ酶切后，在DNA连接酶催化下形成产物乙。则反应液中产物乙共有()

A. 1种 B. 2种 C. 3种 D. 4种
【答案】
C 
【解析】
【分析】
本题考查基因工程的原理及技术，要求考生掌握基因工程的工具酶，重点掌握限制酶和DNA连接酶的特点及作用，明确DNA连接酶能够连接相同的黏性末端，最后选出正确的答案，考生易错选A项。
【解答】
根据题意可知，线性DNA含有限制性核酸内切酶EcoR I的1个酶切位点，因此经过该酶切割后会形成两个相同的黏性末端，但是黏性末端两侧的序列不同，可以分别用a和b表示。由于a和b具有相同的黏性末端，因此利用DNA连接酶催化后，能够产生aa连接、bb连接、ab连接三种产物。
​综上所述，C符合题意，ABD不符合题意。
故选C。  
6. 据图分析，下列有关基因工程的说法不正确的是（　　）

A. 为防止目的基因与质粒任意结合而影响基因的表达，应用限制酶Ⅰ、Ⅱ同时切割二者
B. 限制酶、DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键
C. 与启动子结合的是RNA聚合酶
D. 能够检测到标记基因表达产物的受体细胞中，也一定会有目的基因的表达产物
【答案】
D 
【解析】解：A、限制酶Ⅰ和酶Ⅱ识别的核苷酸序列不同，所以用限制酶Ⅰ和酶Ⅱ同时切割目的基因和质粒可防止二者任意结合，A正确；
B、限制酶、DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键，前者是切割磷酸二酯键，后者是连接磷酸二酯键，B正确；
C、启动子和终止子都是一段有特殊结构的DNA片段，其中启动子是RNA聚合酶的结合位点，能启动转录过程，而终止子能终止转录过程，C正确；
D、重组DNA分子上的抗性基因可用于目的基因的检测与鉴定，但是有目的基因也不一定表达，D错误。
故选：D。
基因表达载体的构建：
1、过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。
2、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。
3、基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。
（1）启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；
（2）终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；
（3）标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。
本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理、工具、操作步骤及应用，掌握各步骤中的相关细节，能运用所学的知识准确判断各选项，属于考纲识记和理解层次的考查。
7. 下列有关如图所示的黏性末端的说法，错误的是（    ）

A. 甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的
B. 甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子但甲、丙之间不能
C. DNA连接酶的作用位点是b处
D. 切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段
【答案】
C 
【解析】
【分析】
本题结合三种DNA片段，考查基因工程的相关知识，重点考查限制酶和DNA连接酶的相关知识，要求考生识记限制酶的特点，能根据图中信息判断三种限制酶的识别序列；识记DNA连接酶的作用，能结合所学的知识准确判断各选项。
【解答】
A.甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的，A正确；
B.甲、乙具有相同的黏性末端、可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能，B正确；
C.DNA连接酶的作用位点是磷酸二酯键a，不是氢键b，C错误；
D.切割甲的限制酶的识别序列和甲、乙片段形成的重组DNA分子序列不同，因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子，D正确。
故选C。  
8. 基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据图判断下列操作正确的是 (  )

A. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B. 目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
C. 质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
D. 质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
【答案】
D 
【解析
【分析】​本题主要考查基因工程相关知识，意在考查考生能理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力。​
【解答】
限制酶I的识别序列和切点是-G↓GATCC-，限制酶II的识别序列和切点是-↓GATC-，可知限制酶II能够识别和切割限制酶I切割后的黏性末端。据题图可知，目的基因两端分别是限制酶I的识别序列和切点是-G↓GATCC-和限制酶II的识别序列和切点是-↓GATC-，只有用限制酶II才能将目的基因切割下来。质粒有GeneI和GeneⅡ表示两种标记基因，分别有限制酶II的识别序列和限制酶I的识别序列；如果用限制酶II切割，则GeneI 和GeneⅡ都被破坏，造成重组质粒无标记基因；用限制酶I切割，则破坏GeneⅡ，保留GeneI，其黏性末端和切割目的基因所在DNA的黏性末端相同，可以连接形成重组DNA，故选D。  
9. 某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA。下列分析错误的是 ( )

A. 用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒,可得到2条DNA片段
B. 不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因
C. 构建重组DNA时,需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA
D. 导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长
【答案】
C 
【解析】限制酶HindⅢ和PstⅠ在质粒上各有一个识别切割位点，用HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段，A正确；AluⅠ的识别、切割位点位于目的基因中，用AluⅠ酶切割外源DNA会破坏目的基因，B正确；选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，质粒中的两个标记基因均会被破坏，C错误；选择HindⅢ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA，会破坏质粒中的氯霉素抗性基因，保留四环素抗性基因，所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。
二、探究题（本大题共1小题，共15.0分）
10. 下面是将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程及有关资料，请分析回答下列问题。
资料1　巴斯德毕赤酵母菌是一种甲基营养型酵母菌，能将甲醇作为其唯一碳源，此时AOX1基因受到诱导而表达[5'AOX1和3'AOX1（TT）分别是基因AOX1的启动子和终止子]．
资料2　巴斯德毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以科学家改造出了图1所示的pPIC9K质粒用作载体，其与目的基因形成的重组质粒经酶切后可以与酵母菌染色体发生同源重组，可以将目的基因整合于染色体中以实现表达。

（1）如果要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，应该在HBsAg基因两侧的A和B位置接上 ______ 、 ______ 限制酶识别序列，这样设计的优点是避免质粒和目的基因自身环化。
（2）酶切获取HBsAg基因后，需用 ______ 将其连接到pPIC9K质粒上，形成重组质粒，并将其导入大肠杆菌以获取 ______ ．
（3）步骤3中应选用限制酶 ______ 来切割重组质粒获得重组DNA，然后将其导入巴斯德毕赤酵母菌细胞。
（4）为了确认巴斯德毕赤酵母菌转化是否成功，在培养基中应该加入卡拉霉素以便筛选，转化后的细胞中是否含有HBsAg基因，可以用 ______ 方法进行检测。
（5）转化的酵母菌在培养基上培养一段时间后，需要向其中加入 ______ 以维持其生活，同时诱导HBsAg基因表达。
（6）与大肠杆菌等细菌相比用巴斯德毕赤酵母菌细胞作为基因工程的受体细胞，其优点是在蛋白质合成后，细胞可以对其进行 ______ 并分泌到细胞外，便于提取．
【答案】
（1）SnaBⅠAvrⅡ
（2）DNA连接酶    大量重组质粒（重组质粒不得分）    
（3）BglⅡ
（4）DNA分子杂交    
（5）甲醇       
（6）加工（修饰） 
【解析】
【分析】
本题结合将乙肝病毒控制合成病毒表面主蛋白的基因HBsAg导入巴斯德毕赤酵母菌生产乙肝疫苗的过程图，考查基因工程的原理及技术，要求考生识记基因工程的原理、工具及操作步骤，能结合题干和图中信息答题，有一定难度。
分析题图：图中质粒含有SnaB、AvrⅡ、BglⅡ和SacI限制酶切割位点，其中SacI位于启动子上，BglⅡ位于终止子上。要将HBsAg基因和pPIC9K质粒重组，只能用限制酶SnaB和AvrⅡ切割质粒，要获取含有5′AOX1--3′AOX1段基因，应选用限制酶BglⅡ来切割。5′AOX1--3′AOX1段基因含有卡那霉素抗性基因，在培养基中加入卡那霉素以便筛选导入重组质粒的目的菌。
【解答】
（1）重组质粒上的目的基因若要表达，需要目的基因的首尾含有启动子和终止子。而SnaBⅠ、AvrⅡ识别的序列在启动子与终止子之间，只要在目的基因两侧A和B位置分别接上这两种序列，并用SnaBⅠ、AvrⅡ这两种内切酶对质粒