不同养殖环境下中华圆田螺肠道菌群多样性试验.pdf

水产养殖 2023 年第 10 期摘要：为了解 2 种不同养殖环境下中华圆田螺肠道微生物多样性，设置稻田养殖组（A）池塘养殖组（B），别取 A 组和 B 组田螺的肠道内容物进行总菌群 DNA 提取纯化，采用高通量测序技术进行 16S V3-V4 区域扩增子测序以及生物信息学分析。结果表明，2 组样本共得到 131 240 条序列，共涉及 25 门 215 属，其中共有菌属 169 种，特有菌属各 23 种。基于 97%的样本相似度，样本优化聚类为 609 个 OTU（Operational taxonomical unit）。A 组以拟杆菌门（51.32%）、变形菌门（32.15%）为主；B 组以拟杆菌门（43.12%）、变形菌门（25.12%）、厚壁菌门（18.57%）为主。在属水平上，A 组以拟杆菌类（Bacteroides）、气单胞菌（Aeromonas）、乳酸菌属（Cetobacterium）等属细菌为主，B 组以拟杆菌类（Bacteroides）、气单胞菌（Aeromonas）、变形菌属（Proteocatella）等属细菌为主。指出，A 组肠道菌群比 B 组肠道菌群具有更高的个体差异性、更丰富的物种多样性、更高的菌群丰度。关键词：中华圆田螺；养殖环境；肠道；菌群结构中图分类号：S965.9文献标志码：B文章编号：1004-2091(2023)10-0008-06中华圆田螺（Cipangopaludina cathayensis），俗名田螺、香螺，属软体动物门、腹足纲、田螺科、圆田螺属。分布于我国北方各省区；在国外主要分布于朝鲜和北美等国家。生活于湖泊、河流、水库、池塘及稻田内1，尤其喜栖息在水草茂盛的水域。其适应性强，对干燥及寒冷有较大的抗御力。足发达，适于水底爬行，常以水生植物和低等藻类为食，是淡水螺的主要养殖品种2。其肉质鲜美，营养丰富，高蛋白、低脂肪，具有食用、药用价值3-5；同时还具有净化水体的功能6，螺肉、螺壳可作为其他经济动物的饲料原料。水生动物肠道微生物菌群的结构、功能与水生动物的营养代谢、肠道发育以及免疫系统有密切的关系，维持其机体肠道内环境稳定。在不同养殖环境下，水产动物的肠道菌群也有各自特点，当养殖水环境发生变化或水体中受到某些因素影响时，其肠道菌群结构会发生变化，已适应新环境的细菌会大量繁殖，影响原有菌落平衡。李存玉等7研究发现，在池塘养殖与工厂化养殖条件下，牙鲆（Par原alichthys olivaceus）肠道菌群丰度与多样性及菌群结构存在显著差异；杨莺莺等8研究认为，对虾肠道菌群的定殖性受到外界环境影响时，如水质突变，极易引起对虾肠道菌群平衡失调，被病原菌侵入，暴发疾病。现开展不同养殖环境对中国圆田螺肠道菌群的影响试验。1材料与方法1.1时间与地点2022 年 11 月。试验地位于广西大学。1.2材料设置 A、B 2 组。A 组：中华圆田螺来自广西玉林陆川县养殖基地，采用微流水稻田养殖方式，养殖水温 26.5 益，籽（溶解氧）为（5.0依0.5）mg/L，pH 值不同养殖环境下中华圆田螺肠道菌群多样性试验黄明磊1，黄凯1*，宿志健2，王超男1，杨旭红1（1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁530004；2.南宁海宝路水产饲料有限公司，广西南宁530031）资助项目：广西科技重大专项创新驱动发展基金（桂科 AA20302019-6）作者简介：黄明磊（1998），男，在读硕士,研究方向为水产动物营养与饲料.E-mail：*通信作者：黄凯（1963），男，教授，博士，研究方向为水产动物营养与饲料.E-mail：研 究 与 综 述doi:10.3969/j.issn.1004-2091.2023.10.0028水产养殖 2023 年第 10 期组别barcode 信息原始 reads 数目QC 后剩余 reads 数目QC 后系列的平均长度/bqAACAGTG,GGTAGC87 92371 669424BGCCAAT,GGTAGC43 31733 650420表 3 样品 QC 之后序列统计为（7.0依0.4），籽（氨氮）约0.2 mg/L；B 组中华圆田螺来自邕江江边水池养殖，养殖水温为 26.4 益，籽（溶解氧）为（4.5依0.5）mg/L，籽（氨氮）约0.7 mg/L，pH 值为（6.8依0.3）。1.3试验方法1.3.1样品处理随机从 A、B 2 组选取 30 只外壳完好、健康、无机械损伤的中华圆田螺，置于无菌操作台灭菌的冰盘内，破壳取螺肠道置于 50 mL 灭菌离心管中，迅速放入液氮中冷冻 20 min 后，于-80 益超低温冰箱中保存。1.3.2样品中总 DNA 的提取与纯化分别取 A 组和 B 组田螺的肠道内容物（每个平行组随机取 5 只田螺的肠道内容物并混合），根据QIAampFast DNA Stool Mini Kit 进行总菌群 DNA提取纯化。将提取纯化的 DNA，用 1%琼脂糖凝胶电泳，电压为 120 V，时间 30 min，观察 DNA 片段完整性及大小，要求目的条带明显，无明显降解。1.3.3PCR 扩增及纯化取纯化后的 DNA 30 ng 置于无酶管中，加水稀释为 1 mg/L 作为模板。使含有 Barcode 的特异引物与高保真酶，对 V3V4 区域进行 PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 纯度。PCR 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶，在电压 170 V条件下进行 30 min 凝胶电泳，以检测目的条带的宽度，并用 AAMP（Agencourt AMPure XP）核酸纯化试剂盒纯化。PCR 扩增引物序列、拼接结果见表 1、表 2。1.3.4数据处理肠道菌群通过 Silva 与 Unite 数据库比对测序结果，并依靠 伯杰氏鉴定细菌学手册 及相关文献进行菌属功能的分类处理。2结果与分析2.1测序测序结果见表 3。由表 3 可见，过滤嵌合体后，最终用于后续分析的 Tags 序列平均长度为 422 bp。2 个样本共得到 131 240 条序列，A 组样本原始序列共 87 923 条，B 组样本原始序列共 43 317 条。其中质控后可用于后续分析的有效序列共 105 319 条，A 组样本剩余序列共 71 669 条，B 组样本原始序列共 33 650 条。表 1 PCR 引物扩增序列扩增区域引物序列16S V3要V4CCTAYGGGRBGCASCAGGGACTACNNGGGTATCTAAT组别原始标记处理标记操作分类单元A 组77 69973 793444B 组39 67235 210354表 2 拼接结果2.2物种多样性曲线将所得有效数据构建稀释曲线和等级聚类曲线，见图 1、2。由图 1 可见，2 个样本的稀释曲线逐渐趋于平稳，这可表明测序数据量渐进合理，更多的数据量基本上不会再产生较多的 OTUs。由图 2可见，曲线在水平方向的横轴上跨度较大，说明物种丰富度高；在垂直方向上曲线坡度较大，说明物种分布不均匀。2.3中华圆田螺样本菌群 alpha 多样性Alpha 多样性指数统计见表 4。由表 4 可见，2组之间的物种丰富度和均匀度差异较小，其中 OTU覆盖率分别为 99.6%和 99.9%。说明样品中有未被研 究 与 综 述9水产养殖 2023 年第 10 期组别物种观察指数香农指数辛普森指数物种总数菌落指数覆盖率/%多样性指数A3542.8930.699471.662484.590.99635.591B4444.0560.813452.573462.040.99941.655表 4 Alpha 多样性指数统计测出的序列的概率较低，测序数量已饱和，能够真正反映中华圆田螺的肠道微生物菌群结构及组成多样性。A 组的 chao1 指数最高为 471.662，表明 A 组的物种丰富度最大，B 组的 Shannon 指数比 A 组高。由图 1 样本稀释曲线序列数量/1035004003002001000AB03530252015105图 2 等级聚类曲线特种等级A 组B 组110-110-210-310-40500400300200100此可见，A、B 2 组的肠道群落物种多样性存在差异。2.4中华圆田螺样本菌群 OTU 分析在门和属的分类水平上分别对 2 种养殖模式下中华圆田螺肠道菌群组成进行鉴定，结果表明不同养殖模式下中华圆田螺肠道中的优势菌种类相同，但同种优势菌的数量分布存在较大差异。基于A 组和 B 组样品中全部 OTU 做 Venn 图（图 3），比较 2 组间的差异。A、B2 组共有 OTU 数目为 289，A组特有的 OTU 数量 155，B 组特有的 OTU 数量为65，A、B2 组 OTU 数目差异显著（孕0.05）。2.5中华圆田螺样本菌群物种丰度选取 A、B 2 组门（Phylum）水平排名前 10 物种，生成物种丰度柱状图（图 4）。在 A、B2 组不同养殖环境下，中华圆田螺中共检测到 22 类门水平菌群，选取物种丰度排名前 10 的菌门，共菌门有 9 门，衣原体菌门（Chlamydiae）为 B 组特有门类。拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）在 A、B2 组菌群中相对丰度最高，分别占 53.32%、32.48%和 43.12%、25.12%。但肠道内容物与肠壁样品中厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度则有较大的差异。其中厚壁菌门（Firmicutes）在 A 组中的占比（3.01%）远小于 B 组（18.57%）。将 2 组样本肠道共有菌群属在（Genus）水平进行物种相对丰度排名，前 30 的菌属设为“主要共有菌属”（图 5）。其中 A 组中拟杆菌类（Bacteroides）（52.63%）、气单胞菌（Aeromonas）（22.97%）的菌属相对丰度值显著高于 B 组，为优势菌种。变形菌属（Proteocatella）（10.8%）显著低于B 组。其他所占比例较少。图 3 各试验组 OTU 数目韦恩图A65289155B研 究 与 综 述10水产养殖 2023 年第 10 期3讨论采用了高通量测序技术，选取了不同环境下的 2 组各 10 只中华圆田螺作为样本，提取其肠道内容物中微生物 DNA，并进行肠道微生物的多样性分析。通过对稀释曲线的测定可见，稀释曲线已达到饱和，说明样品测序量足够且合理，能够反映其肠道微生物多样性及结构组成。2 组样本共得到131 240 条序列，共涉及 25 门 215 属，其中共有菌属 169 种，特有菌属各 23 种。基于 97%的样本相似度，样本优化聚类为 609 个 OTU。本试验的 A 组和B 组 Chao1、ACE 指数标准差较大，表明 2 组物种丰富度在不同环境下会造成差异；Shannon 和 Simpson多样性指数的标准差较小，表明 2 组样品的微生物菌落的均匀度基本一致。微生物菌落多样性，对图 4 门（Phylum）水平上物种相对丰度堆积柱状图1.000.750.500.250AB组别其他披衣菌门未知细菌疣微菌门放线菌门梭菌门螺旋菌门软壁菌门厚壁菌门变形菌门拟杆菌门图 5 2 个试验组肠道主要共有菌属相对丰度AB组别其他温暖杆菌属鼠胞杆菌丙酸弧菌属噬几丁质属未鉴定窑胃菌属杆菌属故万菌属未鉴定伯克氏菌属类诺卡氏菌属罗丹诺杆菌属短小杆菌属沙雷氏菌属丙酸杆菌属氨基酸杆菌属丛毛单胞菌属土地杆菌属苍黄杆菌属多黏类芽孢杆菌蛇颈菌属杆菌不动杆菌醋酸杆菌属柠檬杆菌属费氏刺骨鱼菌不明梭菌目支原体鲸杆菌属变形菌属气单脚菌属拟杆菌属1.000.750.500.250研 究 与 综 述11水产养殖 2023 年第 10 期于维持生态具有重要作用，环境多样性的高低，可表示微生物菌落性能的高低，即多样性低菌落稳定性差，患病风险增大。孙笑非等9研究表明，动物肠道菌群的多样性与肠道菌群稳定性成正比；黄雪敏等10研究发现，当养殖水体中有更高的 Alpha多样性时，水体环境的稳定性更高，水产动物健康生长，反之则发病；杜世聪等11研究发现，Shannon指数下降，可作为对虾健康出现分化的标志。本试验在不同养殖环境下，中华圆田螺肠道主要菌群（3%以上）为：拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、软壁菌门（Tenericutes）4 类，其中 Bacteroidetes 菌门含量最高，A 组含量为 53%，B 组含量为 43%：其次为Proteobacteria，A 组含量为 32%，B 组含量为 25%。研究其他水生动物的肠道优势菌群后，发现在不同养殖环境下，中华绒蟹（Eriocheir sinensis）肠道细菌，大多数种系型属于变形菌门或拟杆菌门12；分析凡纳滨对虾的养殖环境及肠道微生物群落特征后，发现其所有样本中优势门类为变形菌门、拟杆菌门和放线菌门，其中变形菌门占绝对优势13；而在研究健康与患病的凡纳滨对虾肠道主要菌群差异后，发现其肠道主要菌群为变形菌门（51.2%）和放线菌门（27.2%），并无显著差异14；罗氏沼虾（Mac原robrachium rosenbergii）15与日本沼虾16肠道中，变形菌门和厚壁菌门为主要优势菌群。本试验中华圆田螺肠道优势菌群为拟杆菌门、变形菌门、厚壁菌门，与其他水生动物的肠道优势菌群基本一致。文献17-19研究表明，在动物的肠道中，琢-变形杆菌（Alpha proteobacteria）或者 酌-变形菌（Gam原ma proteobacteria）占优势地位，而变形菌门、纲细菌不占主要地位。本试验中，拟杆菌门在中华圆田螺肠道中含量最高，拟杆菌门同时也是人体肠道细菌的主要组成部分，拟杆菌门能与 DNA、脂肪及蛋白质等有机物质进行密切的转换，有机物的吸收和利用，是水环境中碳循环的重要组成部分。厚壁菌门和拟杆菌门在水产动物肠道的相对比例与宿主的食性和代谢成正比20-21，本试验中，A 组中相关菌群丰富度远大于 B 组，推测稻田环境下的中华圆田螺肠道菌群，比池塘环境中的更有优势。本试验共检测出 215 个菌属，这其中 A、B2组中华圆田螺肠道共有菌属 169 种，特有菌属各23 种，特有菌属其含量均低于 0.01%。丰富度前10 中共检测出，拟杆菌属（Bacteroides）、气单胞杆菌属（Aeromonas）、蛋白乳杆菌属（Proteocatella）、乳酸菌属（Cetobacterium）、支原体属（Mycoplasma）、未鉴定的梭状芽孢杆菌属（unidentified_Clostridi原ales）、葡萄皮杆菌属（Epulopiscium）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、乙酰拟杆菌属（Acetobacteroides）、不动杆菌属（Acinetobacter）。其中共检测到 3 种益生菌属：芽孢杆菌属（Bacillus Cohn）、蛭弧菌属（Bdellovibrio）、拟杆菌属（Bacteroides）；检测出 4 种致病菌属：气单胞菌属（Aeromonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）、弧菌属（Vibrio）、黄杆菌属（Xan原thomonas），与孙振丽等22对南美白对虾养殖环境及其肠道细菌多样性研究中分离的益生菌一致。文献23研究表明，稻田相较于池塘，其多项水质指标得到改善，种类组成更为健全。在本试验中，A 组中益生菌拟属杆菌属（Bacteroides）丰富度显著高于 B 组，分别为 59.63%与 39.97%，致病菌属气单胞菌属（Aeromonas）占比相近，由此推测在稻田环境下的中华圆田螺肠道健康状况优于池塘环境。研究发现24，微生物在水产养殖中扮演着重要的角色，其可以通过分解有机物、维持水体稳定性、防止病害发生、促进营养循环、改善水质等多种方式调节养殖水体环境，对水产养殖系统的健康至关重要。水生动物肠道微生物菌群的结构、功能，对水产动物的营养代谢、肠道发育以及免疫系统有密切的关系，是维持机体肠道内环境稳定的重要因素25。食物的消化，是通过水生动物消化系统和菌群生物产生的酶共同完成26。但是，在不同养殖环境下，水产动物的肠道菌群也有各自特点。本试验通过对不同养殖环境下中华圆田螺肠道菌群的研究，有助于了解中华圆田螺消化生理特性、营养需求，对于维持中华圆田螺的健康养殖、饲料开发、饲料添加剂的研发具有重要意义。同时，一些经肠道疾病，往往与肠道细菌密不可分，研究肠道菌群，有助于了解疾病的发生和病变过程，能将肠道内益生菌与其他有益菌，制成复合菌剂投喂水生动物，可以增强抗研 究 与 综 述12水产养殖 2023 年第 10 期渊 下转第 46 页冤病力、免疫力，对生产动物生长繁殖有利27。中华圆田螺肠道微生物菌群特征，与其养殖环境、饵料、自身发育息息相关，密不可分，体现在养殖水域中微生物含量、温度、盐度、饵料发育阶段，这些因素对于中华圆田螺肠道菌群结构均有影响。本试验发现，相对于池塘养殖的中华圆田螺，稻田养殖的中华圆田螺，具有天然饵料丰富、食物丰富的优点，这种养殖模式，造就了稻田养殖型中华圆田螺肠道中更高的细菌多样性、更健康的菌群组成、更高的细菌总数以及更高的物种丰度。4结论根据中华圆田螺肠道 16s rRNA 测序结果显示，稻田养殖中华圆田螺肠道菌群比池塘养殖中华圆田螺肠道菌群具有更高的个体差异性、更丰富的物种多样性、更高的菌群丰度。中华圆田螺肠道中的优势细菌为测序文库中高比例 Proteobacteria 和Bacteroidetes。参考文献：1 杨东辉.中华圆田螺的生态养殖技术研究D.武汉：华中农业大学，2006.2 杨立平.中华圆田螺养殖技术J.内陆水产，2007，31（1）：40-40.3 吴开志.田螺的营养价值J.农村养殖技术，1998，3（10）：12.4 林蒲田.洞庭螺肉鲜J.内陆水产，1990，2（3）：40.5 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environments,a paddy field culture group(A)and a pond culture group(B)were set up.Theintestinal contents of group A and group B were extracted and purified for total flora DNA.High-throughput se原quencing technology was used for 16 S V3V4 region amplicon sequencing and bioinformatics analysis.The re原sults showed that a total of 131 240 sequences were obtained from the two groups of samples,involving 25 phylaand 215 genera,including 169 common genera and 23 endemic genera.Based on 97%of the sample similarity,the sample optimization clustering was 609 OTUs(Operational taxonomical units).Group A was dominated byBacteroidetes(51.32%)and Proteobacteria(32.15%).Group B was dominated by Bacteroidetes(43.12%),Proteobac原teria(25.12%)and Firmicutes(18.57%).At the genus level,group A was dominated by Bacteroides,Aeromonas,and Cetobacterium,while group B was dominated by Bacteroides and Aeromon.Key words:Cipangopaludina cathayensis;Farming environment;Intestinal tract;Flora structureIsolation and Identification of Elisabeella andKlebsiella in BullfrogsZHAO Jing1,LIN Xuye1,2*,CHEN Hansi2,ZOU Weibin2(Zhongkai University of Agriculture and Engineering 悦ollege of 粤nimal 杂cience and 栽echnology Guangzhou,Guangdong 510630,China;2.Haitaida Biotechnology Ltd,Guangzhou,Guangdong 510630,China)Abstract:In order to investigate the pathogenic pathogen of bullfrog suffering from external cataract diseasein a bullfrog farm in Jiangmen,two dominant strains,JM2023A and JM2023B,were isolated from the brain andinternal tissues of dying bullfrog with typical symptoms of tilted head cataract disease.JM2023A and JM2023Bwere identified as Elizabethia milieri and Klebsiella pneumoniae by morphological,physiological and biochemicalanalysis,16S rDNA sequence comparison and phylogenetic tree analysis.The drug sensitivity test of 30 kinds ofdrugs showed that the two kinds of bacteria were resistant to most antibiotics.The results of animal regression testshowed that both Elisabeth Mille and Klebsiella pneumoniae could cause the death of bullfrog from cataract tilt原ing.Elisabeth Mille was the main pathogenic bacteria,and the two bacteria had a synergic effect when they co-caused the disease.Key words:Bullfrog;Mil Elizabeth bacteria;Klebsiella pneumoniae;Susceptibility testing;Animal regres原sion experiments;Jiangmen研 究 与 综 述46