转氨酶活性的测定.doc

实验4 转氨酶活性的测定
（一）原 理
转氨酶是体内重要的一类酶。转氨酶催化α–氨基酸的α–氨基与α–酮酸的α–酮基之间的相互转化，从而生成一种新的氨基酸与一种新的酮酸，这种作用称为转氨基作用。它在生物体内蛋白质的合成、分解等中间代谢过程中，在糖、脂及蛋白质三大物质代谢的相互联系、相互制约及相互转变上都起着很重要的作用。
在动物机体中活力最强、分布最广的转氨酶有两种：一种为谷氨酸丙酮酸转氨酶（简称GPT），另一种为谷氨酸草酰乙酸转氨酶（简称GOT）。它们的催化反应如下：
GPT
丙氨酸 + α– 酮戊二酸 谷氨酸 + 丙酮酸
37℃

GOT

天冬氨酸 +α– 酮戊二酸 草酰乙酸 + 谷氨酸
37℃

GOT催化生成的草酰乙酸在柠檬酸苯胺的作用下转变为丙酮酸与二氧化碳。由上可见此反应最终产物都是丙酮酸。测定单位时间内丙酮酸的产量即可得知转氨酶的活性。
丙酮酸可与2,4 – 二硝基苯肼反应，形成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色。再与同样处理的丙酮酸标准液进行比色，计算出其含量，以此测定转氨酶的活性。

丙酮酸 + 2,4 – 二硝基苯肼 丙酮酸二硝基苯腙（棕红色）

转氨酶的活性单位为：每毫升血清与基质在37℃下作用60min，生成1μmol丙酮酸为1个单位。
（二）试 剂
1．磷酸盐缓冲液（pH7.4）：
甲液：1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）9.47g（或Na2HPO4·12H2O 23.87g）溶于蒸馏水，定容至1 000 ml。
乙液：1/15 mol/L磷酸二氢钾溶液：称取磷酸二氢钾（KH2PO4）9.078g，溶于蒸馏水，定容至1 000 ml。
取甲液825 ml，乙液175 ml，混合，测其pH为7.4即可使用。
2．GPT基质液：称取a – 酮戊二酸29.2 mg及DL – 丙氨酸1.78g，溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液20ml 中，溶解后再加缓冲液70ml, 并移入100ml容量瓶内。加1mol/L的NaOH溶液0.5ml，校正pH至7.4。再以pH7.4的磷酸缓冲液定容至100ml。贮存于冰箱备用，可用1周。
3．GOT基质液：称取a – 酮戊二酸29.2 mg及DL – 天冬氨酸2.66g，溶于pH7.4的磷酸盐缓冲液20ml 中，溶解后再加缓冲液70ml, 并移入100ml容量瓶内。加1mol/L的NaOH溶液0.5ml，校正pH至7.4。再以pH7.4的磷酸缓冲液定容至100ml。贮存于冰箱备用，可用1周。
4. 2,4 – 二硝基苯肼溶液：称取2,4 – 二硝基苯肼20mg，先溶于10ml浓盐酸中（可加热助溶），再以蒸馏水稀释至100ml（有沉渣可过滤），棕色瓶内保存。
5．丙酮酸标准液（1ml=2μmol丙酮酸）：精确称取丙酮酸钠22mg，溶解后转入100ml容量瓶中，用磷酸缓冲液（1/15 mol/L，pH7.4）稀释至刻度。
6．0.4 mol/L氢氧化钠溶液。
7．血清
8．柠檬酸苯胺溶液：取柠檬酸50克溶于50ml蒸馏水中，再加苯胺50ml充分混合即成，低温出现结晶时，可置于37℃水浴中，待溶解后应用。
（三）操 作
1．标准曲线制作：取6支试管按下表操作。

试 剂（ml） 1 2 3 4 5 6
丙酮酸标准液 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
GPT（GOT）基质液 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25
pH7.4磷酸缓冲液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
水浴37℃，10min
2，4二硝基苯肼溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
水浴37℃，20min
0.4mol/L氢氧化钠溶液 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
（ml）
相当活性(单位数) 空白 100 200 300 400 500
混匀后，在520nm波长处，以空白调“0”点，读取各管光密度。以单位值为横座标，
光密度为纵座标，绘制标准曲线。
2．G PT（GOT）测定：取2支洁净的试管按下表操作。

试 剂 （ml） 空 白 测 定
血 清 0.1 0.1
G PT（GOT）基质液 -- 0.5
混匀, 37℃水浴，60min
G PT（GOT）基质液 0.5 --
柠檬酸苯胺溶液 （滴） 1 1
2,4二硝基苯肼溶液 0.5 0.5
混匀, 37℃水浴，20min
0.4mol/L氢氧化钠 （ml） 5.0 5.0
混匀，放置5min，在波长520nm处测定，以空白调“0”点，读取光密度。GPT测
定不加柠檬酸苯胺溶液，其他操作方法同GOT测定法。
（四）计 算
1．由所测得之光密度值直接查标准曲线，即可得知活性单位。
2．若用标准管法测定，可用丙酮酸标准液（1ml = 2μmol）0.1ml，按操作测知标准管光密度，按下列方式计算结果：
（测定管光密度/标准管光密度）×200 = 转氨酶活性 (单位数) / 100ml血清