PAK5激酶促进肺结核患者外周血单核细胞活化.pdf

1273论著浙江临床医学2023年9月第25卷第9期PAK5激酶促进肺结核患者外周血单核细胞活化郑高明 金育娇 范超明【摘要】目的 观察肺结核患者外周血中单核细胞的活化程度与p21活化激酶5（PAK5）的表达水平，探讨单核细胞活化与PAK5的相关性。方法 选择活动性肺结核患者（结核组）65例和体检健康者（对照组）65例，流式细胞术检测外周血单核细胞比例、单核细胞/淋巴细胞比值、活化单核细胞比例和数量、PAK5蛋白表达阳性率，荧光定量PCR检测PAK5基因mRNA水平，比较两组活化单核细胞中的PAK5表达差异。结果 结核组外周血中单核细胞比例11.1%2.3%高于对照组比例5.3%1.4%，单核细胞/淋巴细胞比值（0.490.20）高于对照组比值（0.160.05），差异均有统计学意义（P0.001）。结核组单核细胞活化比93.9%4.6%高于对照组活化比72.9%15.2%，单核细胞活化数（970334）个/L高于对照组活化数（281149）个/L，差异均有统计学意义（P0.001）。结核组活化单核细胞PAK5蛋白表达阳性率84.71%11.15%高于对照组阳性率75.33%11.64%，差异均有统计学意义（P0.001）。结核组活化单核细胞PAK5基因mRNA表达水平（0.970.06）高于对照组表达水平（0.160.07），差异均有统计学意义（P0.001）。结论 活动性肺结核患者外周血中的单核细胞活化与PAK5蛋白表达以及PAK5基因mRNA表达有关，PAK5蛋白能够促进单核细胞活化。【关键词】肺结核 单核细胞 活化 PAK5蛋白激酶【Abstract】Objective Toobservethedegreeofmonocyteactivationandtheexpressionlevelofp21-activatedkinase5(PAK5)intheperipheralbloodofpatientswithpulmonarytuberculosis,andtoexplorethecorrelationbetweenmonocyteactivationandPAK5.Methods 65patientswithactivepulmonarytuberculosis(tuberculosisgroup)and65healthypeople(controlgroup)werecollected.Flowcytometrywasusedtodetecttheproportionofperipheralbloodmonocytes,theratioofmonocytes/lymphocytes,theproportionandnumberofactivatedmonocytes,andthepositiverateofPAK5proteinexpression.FluorescencequantitativePCRwasusedtodetectthemRNAlevelofPAK5gene,andthedifferenceinPAK5expressioninactivatedmonocytesbetweenthetwogroupswerecompared.Results Thepercentageofmonocytesintheperipheralbloodofthepulmonarytuberculosisgroup11.1%2.3%washigherthanthatofthecontrolgroup5.3%1.4%,andtheratioofmonocytes/lymphocytes(0.490.20)washigherthanthatofthecontrolgroup(0.160.05),andthesedifferenceswerestatisticallysignificant(P0.001).Theactivatedratioofmonocytesinthepulmonarytuberculosisgroup93.9%4.6%washigherthanthatinthecontrolgroup72.9%15.2%,andtheactivatednumberofmonocytes(970334)/Lwashigherthantheactivationnumberofthecontrolgroup(281149)/L,whichwasstatisticallysignificant(P0.001).ThepositiverateofPAK5proteinexpressioninactivatedmonocytesinthepulmonarytuberculosisgroup84.71%11.15%washigherthanthatinthecontrolgroup75.33%11.64%,andthedifferenceswerestatisticallysignificant(P0.001).ThemRNAexpressionlevelofPAK5geneinactivatedmonocytesofthepulmonarytuberculosisgroup(0.970.06)washigherthanthatinthecontrolgroup(0.160.07),andthedifferencewasstatisticallysignificant(P0.001).Conclusion TheactivationofmonocytesintheperipheralbloodofpatientswithactivepulmonarytuberculosisisrelatedtotheexpressionofPAK5proteinandPAK5mRNA.PAK5proteincanpromotetheactivationofmonocytes.【Key words】Pulmonarytuberculosis Monocyte Activation PAK5proteinkinase近年来，结核病（tuberculosis，TB）发病呈上升趋势，包括艾滋病在内的免疫力低下人群以及重症监护室耐药菌感染者是 TB 发病的高危人群。世界卫生组织发布的2022 年全球结核病报告显示，2021 年全世界新发 TB 患者 1060 万例1。我国估算的新发结核病患者数为 78.0 万，占全球结核病例的 7.4%。结核分枝杆菌（mycobacteriumtuberculosis，MTB）是结核病的病原体，单核巨噬细胞是消灭 MTB 的“前线细胞”，活化的单核巨噬细胞吞噬并分解 MTB，将 MTB 抗原呈递给 T细胞，启动细胞免疫。但 MTB 能通过各种机制长期隐匿在单核巨噬细胞内，二者之间的斗争决定着疾病的转归2。p21 活化激酶 5（PAK5）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过与广泛的细胞内蛋白相互作用参与多个信号转导通路，调节细胞活化、增殖、迁移等3。MTB感染患者时，单核细胞活化与 PAK5 蛋白的关系尚不清楚。本文旨在评估肺结核患者外周血单核细胞活化与PAK5 的相关性，为借助 PAK5 增强单核细胞活性辅助治疗结核病提供依据。1 资料与方法1.1 临床资料 选取 2017 年 10 月至 2023 年 5 月杭州师范大学附属医院 65 例确诊为活动性肺结核患者（结核组），以及 65 例健康体检者（对照组）。结核组纳入标准：年龄 18 岁的活动性肺结核患者；排除标准：免疫缺陷者、糖尿病、心血管疾病、其它感染性疾病和肿瘤。活动性结核是基于结核病相关的临床症状和体征，及结核分枝杆菌病原学、病理学、影像学等检查有活动性结核诊断的证据，所有患者通过痰培养出结核分枝杆菌确诊。结核组中男 45 例，女 20 例；年龄（5120）岁。对照组中男 35 例，女 30 例；年龄（3210）岁。基金项目：浙 江 省 医 药 卫 生 科 技 计 划 项 目（2018KY589，2019KY500，2019309512），杭州市科技发展计划项目（20191203B102）作者单位：310015 杭州师范大学附属医院（郑高明 范超明）310023 杭州市西溪医院（金育娇）1274浙江临床医学2023年9月第25卷第9期1.2 方法（1）血常规检测：空腹采集 EDTA-K2 抗凝外周血，采用迈瑞 BC-6900 全自动血液分析仪（迈瑞，中国）检测白细胞数量，检测按仪器规程进行。（2）流式细胞术检测：取 EDTA-K2 抗凝全血 100L 加至流式分析管，溶血后洗涤，加入 PBS10L、5Bindingbuffer2.5L，CD45-FITC0.5L，CD14-APC0.5L，HLA-DR-PB 荧光抗体 0.5L（BioLegend，美国），室温避光孵育 15min，再加入二抗，室温避光孵育 30min，流式细胞仪（Navios，BeckmanCoulter，美国）上机检测单核细胞数量和比例。细胞固定后行透膜处理，加入PAK5 一抗（Abnova，中国台湾）或兔源 IgG 同型对照抗体（Invitrogen，美国），室温避光孵育 30min，加入山羊抗兔 IgG-AF488二抗（Thermo，美国），室温避光孵育 30min，流式细胞仪上机检测单核细胞内 PAK5 蛋白。（3）荧光定量 PCR 检测：单核细胞分离：取新鲜 EDTA 抗凝全血 2.5mL，加入等体积 PBS 稀释全血；在 15mL 离心管中加入 5mLFicoll 分离液（Biochrom，Germany），41,000g 离心 30min；吸取血浆与分离液之间的白膜层细胞至 15mL 离心管中，加入 PBS10mL洗涤白膜层细胞，4250g 离心 10min，弃上清液；加入 Percoll 分离液 4mL（1.8mLPercoll+2mLMinimalEssentialMediumEagle+0.2mL10EarleBalancedSaltSolution，Pharmacia，Germany），4420g 离心 30min，收集中间层富集的单核细胞。单核细胞 RNA 提取和定量 PCR：采用核酸提取纯化试剂盒（湖南圣湘公司，中国），按说明书要求提取并纯化单核细胞总 RNA。采用 TAKARA 逆转录试剂盒（RR037A），按说明书要求进行 RNA 逆转录反应。采用 TAKARA 定量 PCR 试剂盒（RR820A），按说明书要求进行荧光定量 PCR 反应，获得靶基因 PAK5 和 ACTB（内参基因）的 Ct 值，并计算 2-CT值进行统计学分析。相关引物序列见表 1。表1 荧光定量PCR使用的引物引物名称引物序列（5-3）PAK5ForwardAGTACATCTCCACGGCTTCCTACCPAK5ReverseGCTGCTGGTCGGAGGAGGAGActin-ForwardGGCACCACACCTTCTACAATGAGCActin-ReverseGATAGCACAGCCTGGATAGCAACG1.3统计学分析采用 SPSS23.0 统计软件。正态分布的计量资料采用（xs）表示，两组比较用 t 检验。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 单核细胞比例及单核/淋巴细胞比值 与对照组比较，结核组外周血中单核细胞占全部白细胞的比例11.1%2.3%高于对照组单核细胞占比5.3%1.4%，结核组外周血中单核/淋巴细胞比值（0.490.20）高于对照组单核/淋巴细胞比值（0.160.05），差异均有统计学意义（t=13.452，P0.001；t=9.870，P0.001）。见图3 两组活化单核细胞PAK5蛋白表达阳性率图4 两组活化单核细胞PAK5基因mRNA表达水平活化单核细胞中PAK5阳性百分比（%）PAK5/ACTB3 讨论结核病是严重威胁全球公共卫生的重大传染病，防治形势日趋严峻。MTB 是导致结核病的病原体，而单核巨噬细胞是机体抵抗 MTB 感染的主要效应细胞。活化的单核巨噬细胞不仅可启动固有免疫应答，分泌炎图 1。图1 两组外周血单核细胞比例和单核细胞/淋巴细胞比值外周血单核细胞百分比（%）外周血单核淋巴细胞比值2.2单核细胞活化比和活化数结核组单核细胞活化比 93.9%4.6%高于对照组单核细胞活化比72.9%15.2%，结核组单核细胞活化数（970334）个/L 高于对照组（281149）个/L，差异均有统计学意义（t=8.258，P0.001；t=11.511，P0.001）。见图 2。图2 两组外周血单核细胞活化比和活化数活化单核细胞百分比（%）活化单核细胞绝对值（个/L）2.3 活化单核细胞的 PAK5 蛋白表达阳性率 结核组活化单核细胞 PAK5 蛋白表达阳性率 84.71%11.15%高于对照组 75.33%11.64%，差异有统计学意义（t=2.207，P=0.035）。见图 3。2.4 活化单核细胞 PAK5 基因 mRNA 表达水平 结核组活化单核细胞 PAK5mRNA 表达水平（0.970.06）高于对照组（0.160.07），差异有统计学意义（t=7.519，P0.001）。见图 4。1275浙江临床医学2023年9月第25卷第9期性因子杀伤或直接吞噬 MTB，还可以通过抗原递呈作用，激活获得性免疫应答2。机体感染 MTB 后，单核细胞可经 MCP-1、IFN-、TNF-等细胞因子刺激而活化，并向感染部位聚集，进入组织发育为组织特异性巨噬细胞，获得强大的吞噬杀菌能力，从而清除或携带MTB4。脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan，LAM）是 MTB 细胞壁的一种糖脂，可与单核细胞膜上的 Toll样受体 2（TLR2）结合，激活细胞内多条信号通路，诱导单核细胞向巨噬细胞转化5。而在感染早期，MTB分泌的小分子抗原 CFP10、ESAT6 等也可与单核细胞表面结合，激活相应的信号通路而活化单核细胞6。活化的单核巨噬细胞首先吞噬 MTB，然后迁移至局部淋巴结，表达和通过 MHC 分子递呈抗原而激活 T 细胞7，但 MTB 也可以阻碍单核巨噬细胞抗原递呈8，这些单核巨噬细胞不能杀灭细胞内的 MTB，且其显著的迁移能力将有助于 MTB 从感染部位向其它组织播散9。有研究发现，单核细胞膜上表达的模式识别受体，能帮其识别 MTB 病原体相关分子模式而使其激活，活化后的单核巨噬细胞增加表面 MHCI、MHCII 及协同刺激分子的表达，导致 MTB 抗原更好递呈给 T 细胞，使得T 细胞对 MTB 发挥更有效的杀伤作用10。同时活化的单核巨噬细胞也能通过产生一氧化氮（NO）、促进吞噬小体向吞噬溶酶体及自噬溶酶体成熟等发挥着抗结核作用11。因此，单核细胞的活化对于机体清除 MTB 非常重要。单核细胞活化的表面标志物主要是 HLA-DR、CD25、CD69 等。本研究结果显示，结核患者外周血中单核细胞膜上的 HLA-DR 等活化标志物的表达阳性率高于体检健康者，提示结核患者单核细胞活化比更高，结核分枝杆菌可以通过某种信号通路激活单核细胞，诱导其向巨噬细胞分化，进而参与机体对 MTB 的杀灭和清除。PAK5 是一个重要的信号转导分子，在多条信号转导通路中发挥作用。研究表明，单核细胞活化与 p65-NFB 通路激活密切相关12，提示 PAK5 蛋白可能通过磷酸化 p65-NFB，促进 HLA-DR 表达而活化单核细胞。本研究中，活动性肺结核患者的外周血中单核细胞比例增高，这个现象可能是由于结核病时，血循环中的单核细胞被激活而募集到肺部形成肉芽肿来控制 MTB 感染所致。此外，活动性肺结核患者单核细胞与淋巴细胞比值也增高，这可能是由于 MTB 感染人体后，骨髓造血干细胞有着向髓系分化的倾向，导致髓系及淋巴系比例增高13。与体检健康者相比较，活动性肺结核患者外周血中的活化单核细胞的 PAK5 蛋白表达阳性率增高，同时 PAK5 基因 mRNA 表达水平增高，这进一步提示 PAK5 蛋白参与单核细胞活化，诱导单核细胞向巨噬细胞分化增殖，并向感染灶迁移，发挥消灭MTB 的生物学功能。综上所述，活动性肺结核患者单核细胞比例、单核细胞活化比和活化数、PAK5 蛋白表达阳性率和 PAK5基因 mRNA 表达水平均增高，提示结核分枝杆菌感染时，PAK5 蛋白具有促进单核细胞向活化单核细胞转变的潜能，这为今后通过 PAK5 蛋白增强单核细胞功能控制结核病提供可能，且为目前抗结核辅助治疗提供新的方向。参考文献1 STEPHENSONJ.WHOreport:YearsofprogressinglobaltuberculosisupsetbyCOVID-19pandemicJ.JAMAHealthForum,2022,3(11):e224994.2 EHRTS,SCHNAPPINGERD,RHEEKY.MetabolicprinciplesofpersistenceandpathogenicityinMycobacteriumtuberculosisJ.NatRevMicrobiol,2018,16(8):496-507.3 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