三原核生物的质粒市公开课金奖市赛课一等奖课件.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,三、原核生物质粒,定义：是一类小型闭合环状核外双螺旋DNA分子，能独立于细胞核进行自主复制。,大小：约为2100106Dalton，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。,性质：,能够在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也能够经过互换掺入染色体上，以附加体（episome）形式存在；,质粒是一个复制子（replicon），依据自我复制能力不同，可把质粒复制控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随,普通一个寄主细胞内只有少数几个（15）个拷贝；松弛型质粒复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止情况下仍能够进行复制，在细胞内数量能够达到10200个或更多。,第1页,第1页,能够通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒细胞；质粒转移时，它能够单独转移，也能够携带着染色体（片段）一起进行转移，因此它可成为基因工程载体。,对于细菌生存并不是必要,功效多样化,三、原核生物质粒,第2页,第2页,功效：,进行细胞间接合，并带有一些基因，如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功效等。,重组：,在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。,存在范围,：诸多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis、根癌土壤杆菌等,制备：,包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成份、清除RNA和蛋白质等环节。,鉴定：,电镜观测、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等办法,三、原核生物质粒,第3页,第3页,几种代表性质粒：,1.F,因子（fertility factor）,：又称致育因子或性因子，62,10,6,Dalton，94.5kb，相称于核染色体DNA2%环状双链DNA，足以编码94个中档大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用相关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。,第4页,第4页,Figure.Representative FERTILITY PLASMID.,A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes.In this figure the fertility plasmid also carries antibiotic resistant genes.,第5页,第5页,最初发觉于痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae），以后发觉还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。,R因子由相连两个DNA片段构成，即抗性转移因子（resistence transfor factor，RTF）和抗性决定R因子（r-determinant），RTF为分子量约为11,10,6,Dalton，控制质粒copy数及复制，抗性决定质粒大小不固定，从几百万到100,10,6,Dalton以上。其上带有其它抗生素抗性基因。,R-因子在细胞内copy数可从12个到几十个，分为严紧型和松弛型两种，经氯霉素处理后，松弛型质粒可达3000个/细胞。,2.R因子（resistence factor）,第6页,第6页,产大肠杆菌素因子。,大肠杆菌素是由E.coli一些菌株所分泌细菌素，能通过克制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子量约4,10,4,8,10,4,Dalton。大肠杆菌素都是由Col因子编码。,Col因子可分为两类，分别以ColE1和ColIb为代表。,ColE1分子量约为5,10,6,Dalton，无接合作用，是多copy；ColE1研究得诸多，并被广泛地用于重组DNA 研究和用于体外复制系统上。,ColIb,分子量约为80,10,6,Dalton，,它与F因子相同，,含有通过接合作用转移功效，属于严紧型控制，只有12个copy。,凡带Col因子菌株，由于质粒本身编码一个免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。,3.Col因子（colicinogenic factor）,第7页,第7页,降解性质粒,只在假单胞菌属中发觉。它们降解性质粒可为一系列能降解复杂物质酶编码，从而能利用普通细菌所难以分解物质做碳源。这些质粒以其所分解底物命名，比如有分解CAM（樟脑）质粒，XYL（二甲苯）质粒，SAL（水杨酸）质粒，MDL（扁桃酸）质粒，NAP（奈）质粒和TOL（甲苯）质粒等。,4.降解性质粒,第8页,第8页,即诱癌质粒。,存在于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中,可引起许多双子叶植物根癌,。当细菌侵入植物细胞中后，在其细胞中溶解，把细菌DNA释放到植物细胞中。这时，含有复制基因Ti质粒小片段与植物细胞中核染色体发生整合，破坏控制细胞分裂激素调整系统，从而使它转变成癌细胞。,Ti质粒长200kb，是一个大型质粒。当前，Ti质粒已成为植物遗传工程研究中主要载体。一些含有主要性状外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中，并进一步使之整合到植物染色体上，以改变该植物遗传性，达到哺育植物优良品种目的。,5.Ti质粒（tumor inducing plasmid,）,第9页,第9页,是近年来在Rhizobium（根瘤菌属）中发觉一个质粒，分子量为200300,10,6,Dalton，比普通质粒大几十倍到几百倍，故称巨大质粒，其上有一系列固氮基因。,6.巨大质粒（,mega,质粒）,第10页第10页,基因,：能够表示和产生基因产物（蛋白质或RNA）DNA序列。,原核生物基因系统：,启动子（基因）,操纵子 操纵子（基因）,基因调控系统 结构基因,调整基因,第11页,第11页,细胞水平：大部分或全部DNA都集中于细胞核或核质体中，不同种类微生物或同种不同细胞中细胞核数目不同,染色体水平：真核微生物每个细胞核内含有一定数量染色体；而原核微生物中一个核质体就是一个裸露、光学显微镜下不能看到环状染色体。,第12页,第12页,一些真核生物和原核生物基因组比较,生 物 单倍体分子量 核苷酸 已知染色体数 约数（Da）对数 基因数,人 32 35 10,12,57 10,9,4000,黑腹果蝇 4 7.9 10,10,8.0 10,7,50006000,粗糙脉孢菌7 2.8 10,10,4.5 10,7,500,大肠杆菌1 2.5 10,9,3.8 10,6,1027,噬菌体T41 1.1 10,8,2.0 10,5,135,噬菌体,1 3.2,10,7,4.8,10,4,35,噬菌体MS21 1.1 10,6,3.5 10,3,3,第13页,第13页,遗传密码,：指DNA链上各个核苷酸特定排列顺序,密码子（coden）,：由3个核苷酸顺序决定，负载遗传信息基本单位,不对称转录,：只有DNA双链一股才作为故意义链被转录，这种现象又称不对称转录。,起始密码子,：AUG，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸,终止密码子,：UAA、UGA、UAG,第14页,第14页,核外DNA种类,核外染色体,真核生物“质粒”,原核生物质粒,线粒体,细胞质基因叶绿体,（质体）中心体,动 体,共生生物：卡巴颗粒,酵母菌2,m质粒,F因子,R因子,Col质粒,Ti质粒,巨大质粒,降解性质粒,第15页,第15页,第二节 基因突变和诱变育种,突变（,mutation,）：,指生物体表型忽然发生可遗传改变。,染色体畸变,细胞学上能够看到染色体改变,突变,基因突变,细胞学上看不到遗传物质改变,突变体（mutant）,：发生了突变微生物细胞或菌株,野生型（wild type）：,从自然界分离到任何微生物在其发生突变前原始菌株,第16页,第16页,依表型改变分为：,形态突变型,营养缺点型,因突变而丧失产生某种生物合成酶能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才干生长突变类型。,发酵突变型,丧失产生某种生物合成酶能力突变型,抗性突变型,因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子抗性,条件致死突变型,突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖突变型,抗原突变型,因突变而引起抗原结构发生改变,产量突变型,（一）基因突变类型,第17页,第17页,按是否比较容易、快速地分离到发生突变细胞来分：,选择性突变株（selective mutant）：,含有选择标识（如营养缺点性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。,非选择性突变株（non-selective mutant）,：无选择标识（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能判别这种突变体惟一办法是检查大量菌落并找出差别。,第18页,第18页,第19页,第19页,定义：,每一细胞在每一世代中发生某一性状突变几率。,突变率为10,8,是指该细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也能够用每一单位群体在每一世代中产生突变株（mutant，即突变型）数目来表示。如一个含10,8,个细胞群体，当其分裂为210,8,个细胞时，即可平均发生一次突变突变率也是10,8,。,突变率突变细胞数/分裂前群体细胞数,突变是,独立,。某一基因发生突变,不会影响,其它基因,突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变几率是极低，由于双重突变型几率只是各个突变几率乘积。,由于突变几率普通都极低，因此，必须采用检出选择性突变株手段，尤其是采用检出营养缺点型恢复突变株（back mutant或reverse mutant）或抗性突变株尤其是抗药性突变株办法来加以拟定。,（二）突变率,第20页,第20页,若干细菌某一性状自发突变率,菌 名 突变性状突变率,E.coli抗T1噬菌体3 10,8,E.coli抗T3噬菌体1 10,7,E.coli不发酵乳糖1 10,10,E.coli 抗紫外线1 10,5,Staphylococcus aureus 抗青霉素1 10,7,S.aureus 抗链霉素1 10,9,Salmonella typhi抗25,g/L链霉素,1 10,6,Bacillus megaterium 抗异烟肼5 10,5,第21页,第21页,（三）突变特点,适合用于整个生物界，以细菌抗药性为例。,不相应性,：突变性状与突变原因之间无直接相应关系。,自发性,：突变能够在没有些人为诱变原因处理下自发地产生。,稀有性,：突变率低且稳定。,独立性,：各种突变独立发生，不会互相影响。,可诱发性,：诱变剂可提升突变率。,稳定性,：变异性状稳定可遗传。,可逆性,：从原始野生型基因到变异株突变称为正向突变（forward mutation），从突变株回到野生型过程则称为回复突变或回变（back mutation或reverse mutation）。,第22页,第22页,（四）基因突变自发性和不相应性证实,在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去相称长时间内对这种抗性产生原因争论十分激烈。,一个观点认为，突变是通过适应而发生，即各种抗性是由其环境（指其中所含抵抗对象）诱发出来，突变原因和突变性状间是相相应，并认为这就是“定向变异”，也有些人称它为“驯化”或“驯养”。,另一个见解则认为，基因突变是自发，且与环境是不相正确。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等各种原因错综在一起，因此难以探究问题实质。,从1943年起，通过几种严密而巧妙试验设计，主要攻克了检出在接触抗性因子前已产生自发突变株难题，终于处理了这场纷争。,第23页,第23页,变量试验又称波动试验或彷徨试验。,1943年，S.E.Luria 和M.Delbrck 依据统计学原理，设计了左方试验。,1.,变量试验,fluctuation test,第24页,第24页,2.涂布试验,原理与变量试验相同，办法更为简便，且可计算突变率。,第25页,第25页,涂布试验中突变率计算,初始接种量：5 10,4,个/皿,培养5小时，繁殖了12.3代，每个微菌落约含5100个细菌,这时，每个平皿上细胞数为：,5100 5 10,4,2.6 10,8,个/皿,在6个平板上，比接种时增长细胞数为：,6（2.6 10,8,5,10,4,）=15.6 10,8,在未涂布平板上共发觉28个突变，故,突变率=28/15.6 10,8,=1.8 10,8,第26页,第26页,3.平板影印培养试验（replica plating）,1952年，J.Lederberg夫妇论文平板影印培养法和细菌突变株间接选择，更加好地证实了微生物抗药性是在未接触药品前自发地产生，这一突变与对应药品环境毫不相干。,平板影印培养法，是一个能达到在一系列培养皿相同位置上出现相同遗传型菌落接种培养方法：把长有许多菌落母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布木质圆柱印章上，使其沾上来自平板上菌落。然后可把这一“印章”上菌落一一接种到不同选择性培养基平板上。待这些平板培养后，对各平板相同位置上菌落作对比后，就可选出适当突变型菌株。据报道，用此法可把母平板上1020%量细菌转移到丝绒布上，并可利用这一“印章”接种8个子培养皿。因此，经过影印培养法，就能够从在非选择性条件下生长细菌群体中，分离出各种类型突变株。,第27页,第27页,第28页,第28页,平板影印培养法,在主线未接触过任何一点链霉素情况下，就能够筛选到大量抗链霉素突变株，充足阐明了突变是自发产生，链霉素只是起到了一个检出作用。,平板影印培养不但在微生物遗传理论研究中有主要应用，并且在育种时间和其它研究中都有应用，值得较好地领略。,第29页,第29页,（五）基因突变机制,基因突变原因是各种多样，能够是自发或诱发，诱变又,可分为点突变和畸变。详细类型,可归纳下列：,第30页,第30页,