GS抑制剂调节自噬影响肝癌细胞放疗敏感性.pdf

doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2023.05.006GS 抑制剂调节自噬影响肝癌细胞放疗敏感性何 媛1,2,钱俊超1,2,3(1.中国科学院合肥物质科学研究院,合肥 230031;2.中国科学技术大学研究生院科学岛分院,合肥 230026;3.中国科学院合肥肿瘤医院,合肥 230031)摘 要 为探究人类肝细胞癌细胞的放疗敏感性与谷氨酰胺合成酶(GS)和自噬之间的关系。HepG2 细胞经 X 射线照射后,采用 CCK-8、克隆集落形成实验来测量细胞经 GS 抑制剂(L-蛋氨酸亚磺酰亚胺,MSO)作用后的增殖能力。实时荧光定量 PCR 以及蛋白免疫印迹实验(Western Blot,WB)用于检测 MSO 对 GS 表达的影响,GS 活力检测试剂盒用于检测 MSO 对 GS 的活力抑制效率。单丹磺酰尸胺(MDC)染色以及 WB 实验技术用于检测细胞内的自噬情况,以确定 IR 及 MSO 对自噬的影响。结果表明,MSO 引起细胞内 GS 表达增加,但是 GS 的活力被其显著抑制。此外,MSO 可以降低放疗后细胞的增殖能力,并且抑制放疗诱导的自噬。结果表明 MSO 可通过抑制 GS 活力提高 HepG2 细胞的放疗敏感性,这与其对自噬流的调节密切相关。关键词 谷氨酰胺合成酶;细胞增殖;HepG2 细胞;自噬;放射治疗中图分类号 Q25;R735.7文献标识码 A文章编号 2095-1736(2023)05-0006-05Glutamine synthetase regulates autophagy toimprove radiotherapy sensitivity in hepatocellular carcinoma cellsHE Yuan1,2,QIAN Junchao1,2,3 1.Hefei Institutes of Physical Science Chinese Academy of Sciences Hefei 230031 China 2.Science Island Branch Graduate School of USTC Hefei 230026 China 3.Hefei Cancer Hospital Chinese Academy of Sciences Hefei 230031 China Abstract The aim of this study was to investigate the relationship among radiotherapy sensitivity glutamine synthetase GS and autophagy in human hepatocellular carcinoma cells.After X-ray irradiation CCK-8 and colony formation assay were used to measure the proliferation of HepG2 cells treated with GS inhibitor L-methionine sulfonimide MSO.Real-time fluorescence quantitative PCR and protein immunoblotting assays Western Blot WB were used to detect the effect of MSO on GS expression and GS activity assay kits were used to detect the efficiency of inhibition of GS activity by MSO.Monodansulfonyl cadaverine MDC staining as well as WB assay techniques were used to detect intracellular autophagy to determine the effect of IR and MSO on autophagy.The results indicated that MSO caused an increase in intracellular GS expression but GS activity was significantly inhibited.In addition MSO reduced the proliferative capacity of cells after radiotherapy and inhibited radiotherapy-induced autophagy.Results suggested that MSO could en-hance the sensitivity of HepG2 cells to radiotherapy by inhibiting GS activity which was closely related to its regulation of autophagic flow.Keywords glutamine synthetase cell proliferation HepG2 cells autophagy radiotherapy 原发性肝癌是全球第六大最常见的癌症,也是2020 年全球癌症死亡的第三大原因1。肝细胞癌(HCC)是一种由肝细胞癌变引起的原发性肝癌,约占原发性肝癌组织学类型的 90%以上,是世界上发病率最高的癌症之一2。HCC 的推荐治疗方案包括肿瘤切除或肝移植、肿瘤放疗、化疗、消融和栓塞等3。其6第 40 卷第 5 期2023 年 10 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.5Oct.2023收稿日期:2023-02-20;最后修回日期:2023-05-08基金项目:国家自然科学基金资助项目(U1932158,81871085,82271519);山东省自然科学基金肿瘤 防治 联合基 金重点 项目(ZR2019LZL018);安徽省自然科学基金杰出青年项目(2208085J10)作者简介:何媛,硕士,研究方向为肿瘤生物学,E-mail:yuanhe99 通信作者:钱俊超,博士,研究员,研究方向为肿瘤发病机理及诊疗研究,E-mail:qianjunchao 中,放疗在肝癌治疗中的应用越来越多,因为电离辐射(IR)具有安全无创的特性4-5。放射治疗的新方式,如立体定向放疗(SBRT),可以在有效递送消融剂量的同时保留正常肝细胞,因此,接受放射治疗的 HCC 患者数量正在逐步增加6。虽然通过先进的照射技术,如借助呼吸门控强度调制和图像引导的放射治疗,可以在不损伤正常组织的情况下对肿瘤给予更适形的治疗和更高的辐射剂量7,但由于肿瘤固有的放射抵抗性和周围正常肝脏的低辐射耐受性,放疗对 HCC 的治疗效率较低8。因此,迫切需要能增加肿瘤的放射敏感性和减少正常组织并发症的策略。放射治疗中存活下来的癌细胞表现出放射抗性,能够促进肿瘤再生长和肿瘤复发。放疗抗性的原因主要是癌细胞激活补偿性存活信号,包括损伤修复信号、DNA 修复和自噬的诱导等9。自噬是一个分解代谢过程,在各种应激刺激下被证明可以促进肿瘤生长和进展,包括饥饿、缺氧、氧化还原应激、化疗药物和辐射等10。自噬还可以作为细胞重要的修复途径之一,通过这种途径细胞可以降解蛋白质和受损细胞器来回收营养物质从而继续生存11。此外,自噬抑制剂可通过诱导更明显和更长时间的 DNA 双链断裂(DSB)对某些肿瘤细胞起到放射增敏的作用12。谷氨酰胺代谢增加是癌症的标志,许多研究强调了谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酰胺在 HCC 发展中的关键作用13。GS 是一种代谢酶,通过谷氨酸和氨合成谷氨酰胺,参与肝脏中氨的解毒作用,相关研究表明,抑制 GS 会降低细胞存活、增殖和肿瘤发生14。以往的研究表明,GS 在部分 HCC 中过度表达且与 HCC患者的转移预后密切相关15,因此,靶向 GS 和相关通路可能为具有固有和获得性辐射抵抗的患者提供治疗益处。然而,GS 在 HCC 的肿瘤发生和治疗反应中的作用仍不清晰,目前还没有批准用于临床试验的安全且特异性靶向 GS 的药物16-17。L-蛋氨酸亚砜亚胺(MSO)是一种特殊氨基酸,可作为谷氨酸类似物抑制多种谷氨酸代谢酶。在哺乳动物中,MSO 是 GS 和-谷氨酰半胱氨酸合成酶的抑制剂,对 GS 有良好的且不可逆的抑制作用16-18。尽管在一些与 HCC 相关的研究中,MSO 已被用作 GS 的抑制剂19-21,但少有关于MSO 或 GS 对 HCC 放疗敏感性影响的报道。因此,本研究探讨了 GS 活力对 HCC 细胞系 HepG2 体外放疗敏感性的作用。1 材料与方法1.1 材料人肝癌细胞系 HepG2 购自 Procell 生命科学与技术公司(CL-0103);MSO(Sigma-Aldrich,M5379);基础培养基(MEM;Procell,PM150410);胎牛血清(Clark,FB25015);青霉素-链霉素溶液(Procell,PB180120);抗体(GS:Abcam;LC3:武汉赛维尔,GB11124);X 射线辐照仪(PXI,Connecticut,USA;源-面距:40 cm);MDC 染液(Solarbio,G0170);GS 活力检测试剂盒(上海生工,D799578);TransZol Up Plus RNA 分离试剂(Transgen Biotech,ER501-01);HiScript II Q Select RT SuperMix(+gDNA wiper)(Vazyme,R233);ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme,Q711);细胞活力检测试剂盒(CCK-8,上海生工,E606335),Bafilomycin A1(思科捷,SJ-MA0035)。1.2 方法1.2.1 细胞培养人肝癌细胞系 HepG2 用基础培养基(MEM)辅以10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液,并在 37、体积分数为 5%的 CO2空气中培养。实验时,GS 抑制剂MSO 以 0.001 mol/L 的浓度溶于培养基中使用。1.2.2 蛋白免疫印迹不同组别的细胞被清洗、收集和裂解。提取到的蛋白质用 10%12%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,然后转移到处理好的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用 5%脱脂奶阻断 1 h 后,用 GS 抗体在4 孵育过夜,以小鼠抗 GAPDH 蛋白作为内参蛋白。接下来,对膜进行清洗,在室温下孵育 1 h。使用仪器显影得到的印迹,并通过 Image J 软件进行蛋白定量。1.2.3 MDC 染色将对数生长期的 HepG2 细胞在 12 孔板(1105个/孔)中培养至约 60%融合,然后使用 10 Gy 的 X 射线照射,24 h 后使用单丹磺酰(MDC)检测自噬小体的形成。即先吸走培养基,用 PBS 洗两次,然后在 37 的无血清条件下,用 MDC 染色 40 min,用 PBS 冲洗掉多余的 MDC,并立即在荧光显微镜下观察细胞自噬情况。1.2.4 细胞活力测试HepG2 细胞被清洗、胰蛋白酶消化、计数并接种到96 孔板中,密度为每孔 3103,设置 5 个重复孔。细胞贴壁后,在含有或不含 MSO 的培养基中培养 6 h 以上,使用 X 射线辐照仪以 4.987 Gy/min 的剂量率照射10 Gy 的 X 射线。辐照后,细胞在37 下培养72 h,用细胞活力检测试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖。测量前2 h,在培养皿的每个孔中加入 10 L 的 CCK-8 试剂。使用酶标仪在 450 nm 处测量细胞样品的光密度(OD),然后计算相对增殖率。1.2.5 集落形成实验参考文献22所述方法进行集落形成实验,即将细胞计数后,铺板到 6 孔板(1103/孔),根据是否添加MSO、是否进行 IR 分成 4 组。菌落成长 1014 d,更换培养基的频率为每周 2 次,直到显微镜可以明显观察到菌落。菌落形成后吸走培养基用 PBS 洗涤 2 次,4%7第 40 卷第 5 期2023 年 10 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.5Oct.2023多聚甲醛固定 30 min,再用 PBS 洗 2 次,使用 1%结晶紫溶液染色 15 min,用纯水洗净晾干。结果使用 Image J 软件对菌落的数量进行计数、量化。1.2.6 GS 活力测试根据 GS 检测试剂盒的步骤,检测不同条件下细胞的 GS 活力。谷氨酰胺合成酶在 ATP 和 Mg2+的存在下,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺进一步转化为-谷氨酰基异肟酸,在酸性条件下其与铁形成红色的络合物,该络合物在 540 nm 处有最大吸收峰,可在酶标仪下被检测到。1.2.7 实时荧光定量 PCR使用 TransZol Up Plus RNA Kit 从 5106个不同组处理的 HepG2 细胞中提取总 RNA,并根据试剂制造商的说明转录成 cDNA。Q-PCR 使用 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 在 Roche LightCycler 96 Real-Time PCR 系统上进行。在结果中,GS 的相对 mRNA表达水平通过 GAPDH 的表达水平来进行标准化处理。设计并使用 GAPDH(F:5-ACAACTTTGGTATCGT-GGAAGG-3;R:5-GCCATCACGCCACAGTTTC-3)和GS(F:5-ATTTCAGATTGGACCTTGTG-3;R:5-GTGC-CGCTTGCTTAGTT-3)两种引物通过以下步骤 用于PCR 扩增:95 预变性 5 min;95 变性 10 s,60 退火和延伸30 s,共40 个循环。2-Ct法用于目标基因的相对定量。1.2.8 数据分析统计分析使用 GraphPad Prism 9 软件进行。采用非配对 t 检验比较两组之间的差异,多组之间的差异用单因素或双因素方差分析。每个数值以平均值标准差表示。2 结果与分析2.1 GS 抑制剂对 HepG2 细胞的影响我们探索了 GS 抑制剂 MSO 这种药物对 HepG2 肝癌细胞系的作用,与以往的研究结果一致23,MSO 会引起细胞内的负反馈调节,如图 1(b)(d)所示,辐照后 72 h,GS-mRNA 水平以及蛋白表达均显著上升。但是,GS 活力被 MSO 大幅抑制,具体如图 1(a)所示。2.2 GS 抑制剂提高 HepG2 细胞放疗敏感性对辐照后 72 h 的 HepG2 细胞进行了 CCK-8 活力检测,结果如图 2(a)所示,MSO 单独作用不会影响细胞活力,但是会进一步加强 IR 引起的活力下降。此外,使用集落形成实验进一步确定 MSO 长期作用下对细胞增殖的影响,与 CCK-8 的结果一致,MSO 可以在放疗后抑制 HepG2 细胞的增殖,但是在未辐照情况下对细胞增殖并未产生显著影响。2.3 IR 诱导 HepG2 细胞自噬如图 3 所示,通过 MDC 自噬体染料的染色结果观察到,细胞内自噬体会在 IR 后明显增加,提示自噬的激活,而 MSO 的参与进一步增加了自噬的数量,表明自噬流受到 MSO 的影响。(a)MSO 显著降低细胞内 GS 活力;(b)MSO 对 GS-mRNA 表达的影响;(c)MSO 对 GS 蛋白表达的影响;(d)LC3-II/GAPDH 灰度值分析。MSO 以 0.001 mol/L 的浓度溶于培养基中,处理时间均为 72 h。为 P0.05;为 P0.01。Con:对照组;MSO:MSO 处理组。图 1 MSO 对 HepG2 细胞的影响Figure1 Effects of MSO on HepG2 cells(a)CCK-8 检测 10 Gy 剂量单次辐照后 72 h 的相对细胞活力(ns为无显著差异;为 P0.001);(b)相对集落数量(为 P0.05);(c)不 同 IR 剂 量 下 集 落 形 成 情 况。MSO 浓 度 为0.001 mol/L。Con:对照组;MSO:MSO 处理组;IR:辐照组;IR+MSO:辐照与 MSO 共同处理组。图 2 MSO 对 HepG2 细胞增殖的影响Figure 2 Effect of MSO on HepG2 cell proliferation2.4 GS 抑制剂调节 IR 诱导的自噬为确定 MSO 对自噬流的具体影响,对自噬相关蛋白的表达进行了测定。如图 4 所示,研究结果表明,MSO 的参与会引起放射治疗后 LC3 蛋白含量的变化,8第 40 卷第 5 期2023 年 10 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.5Oct.2023尤其是与自噬流密切相关的 LC3-II 蛋白。IR 后 72 h,细胞内 LC3-II 的水平大幅下降,这可能与 IR 诱导的自噬流水平的上升以及后续自噬体的顺利降解有关。然而,MSO 抑制 GS 活力之后,LC3-II 蛋白大量堆积,提示自噬流可能被抑制。在辐照后 48 h 使用 Bafilomycin A1(Baf-A1)阻断自噬降解以确定辐照和 MSO 对自噬的影响,结果表明,Baf-A1 使得 IR 后的 LC3-II 蛋白堆积而对 IR+MSO 共同作用组无明显影响,表明 IR 激活了自噬,而 MSO 抑制了 IR 诱导的自噬。10 Gy 剂量单次辐照后 24 h,使用 MDC 染料观察 HepG2 细胞在不同处理条件下的自噬形成情况,MSO 的浓度为 0.001 mol/L。(a)对照组;(b)MSO 处理组;(c)辐照组;(d)辐照与 MSO 共同处理组;倍数:200;标尺:100 m。图 3 MDC 染色观察 HepG2 细胞自噬体形成情况Figure 3 Autophagosome formation in HepG2 cells observedby MDC staining(a)10 Gy 剂量单次辐照后 72 h,Western Blot 检测不同条件下自噬相关蛋白的表达情况;(b)LC3-II/GAPDH 的灰度值分析。MSO 浓度:0.001 mol/L;Baf-A1 浓度:0.000 000 05 mol/L。ns 为无显著差异;为 P0.05;为 P0.01。Con:对照组;MSO:MSO 处理组;IR:辐照组;IR+MSO:辐照与 MSO 共同处理组。图 4 MSO 影响 IR 后 HepG2 细胞自噬水平Figure 4 Effect of MSO on the level of autophagy in HepG2 cells after IR3 讨论与结论本研究使用 MSO 来抑制 GS 的活性,通过 CCK-8和集落形成实验分别测试了 HepG2 细胞在放疗后短期和长期的增殖效率,分别使用 MDC、Western Blot 检测辐照后细胞内自噬水平。结果表明,放疗诱导自噬产生,并且 GS 活力抑制能够有效影响自噬调节从而提高 HepG2 细胞的放疗敏感性。这是首次对肝癌细胞放疗敏感性与其 GS 活性相关性的研究。自噬起着多种病理生理作用,它有助于癌症细胞的生存和死亡,其在癌症中具有双重作用24-25。据报道,缺乏自噬相关蛋白 Atg5 或 Atg7 的小鼠会发展为肝癌26。然而,越来越多的证据表明,自噬对正常细胞中的早期致癌过程具有抑制作用,但在癌症细胞中,它有助于肿瘤生长、恶性转化和治疗抵抗27。在 HCC 相关研究中,FOXO3 表达的抑制被证明可以通过加速自噬赋予 HCC 细胞对索拉菲尼的抵抗性28,而自噬的抑制则会增强索拉非尼的敏感性29。此外,自噬是具有放射抗性的癌细胞中一种保守的细胞生存策略,因为它在清除受损的细胞器和蛋白质方面发挥着关键作用,这对维持细胞内稳态和细胞健康至关重要30。多项研究结果表明,自噬的抑制可以进一步降低辐照后肿瘤的发生,例如膀胱癌31、结直肠癌32和前列腺癌33等。在食管癌症中,肝激酶B1 通过 AMP 激活的蛋白激酶途径诱导的自噬亦被证明可以增强放射抗性34。此外,ATG5 或 Beclin 1 敲除的癌症细胞由于自噬抑制而表现出更强的放射敏感性35。并且最近研究表明,肝癌细胞放疗后的自噬通量会影响细胞的辐射抗性,GABARAP 蛋白表达减少抑制了 HCC 细胞的自噬,并增强了其放射敏感性36。我们的结果也表明,放疗后 HepG2 细胞内的自噬水平会明显增加,这也与其放疗抗性密切相关。谷氨酰胺合成酶(GS)是谷氨酰胺代谢中的一种关键酶,参与多种原核生物和真核生物的氮代谢、酸碱平衡和细胞信号转导37。谷氨酰胺合成酶在放射治疗中也发挥重要作用,有研究发现 GS 可以在辐照后促进肿瘤细胞的核苷酸代谢和随后的 DNA 损伤修复38。此外,GS 在调节自噬方面也发挥重要作用,FOXO3 介导的 GS 表达诱导自噬对细胞存活十分重要39,且在肝癌细胞中-catenin 也可以调节 GS 的表达并引发一系列的代谢变化从而诱导自噬40。我们的研究结果也证实了放疗后 GS 对自噬的调节作用,GS 活力的下降会抑制放疗诱导的自噬,也暗示 MSO 可以通过抑制放疗后肝癌细胞内 GS 介导的自噬水平升高来降低细胞的自我修复能力,从而降低细胞增殖能力。总之,实验结果已经证实,HepG2 细胞放疗后增殖能力与其自噬的诱导以及 GS 活力密切相关。由于细胞内负反馈调节,MSO 虽然引起了 GS-mRNA 和蛋白9第 40 卷第 5 期2023 年 10 月生 物 学 杂 志JOURNAL OF BIOLOGY Vol.40 No.5Oct.2023表达的增加,但是其对 GS 活力的抑制能够有效抑制放疗后细胞自噬流的进行,从而提高 HepG2 细胞的放疗敏感性。参考文献 1 SUNG H FERLAY J SIEGEL R L et al.Global cancer statistics 2020 GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries J.CA-Cancer Journal for Clini-cians 2021 71 3 209-249.2 FORNER A REIG M BRUIX J.Hepatocellular carcinoma J.Lancet 2018 391 10127 1301-1314.3 BRUIX J SHERMAN M.Management of hepatocellular carcinoma J.Hepatology 2005 42 5 1208-1236.4 CHEN W CHIANG C L DAWSON L A.Efficacy and safety of ra-diotherapy for primary liver cancer J.Chinese Clinical Oncology 2021 10 1 9.5 PREZ-ROMASANTA L A GONZLEZ-DEL PORTILLO E RODRGUEZ-GUTIRREZ A et al.Stereotactic radiotherapy for hepatocellular carcinoma radiosensitization strategies and radiation-immunotherapy combination J.Cancers 2021 13 2 192.6 KAMIMURA K TERAI S.The promise of radiotherapy for hepato-cellular carcinoma J.Hepatology Research the Official Journal of the Japan Society of Hepatology 2021 51 8 837-838.7 FUSS M SALTER B J HERMAN T S et al.External beam radia-tion therapy for hepatocellular carcinoma potential of intensity-mod-ulated and image-guided radiation therapy J.Gastroenterology 2004 127 5 Suppl 1 S206-S217.8 LEE D S WOO J Y KIM J W et al.Re-irradiation of hepatocellu-lar carcinoma clinical applicability of deformable image registration J.Yonsei Medical Journal 2016 57 1 41-49.9 KIM W LEE S SEO D et al.Cellular stress responses in radio-therapy J.Cells 2019 8 9 1105.10 WEI H WANG C CROCE C M et al.p62/SQSTM1 synergizes with autophagy for tumor growth in vivo J.Genes&Develop-ment 2014 28 11 1204-1216.11 CODOGNO P MEIJER A J.Autophagy and signaling their role in cell survival and cell death J.Cell Death and Differentiation 2005 12 1509-1518.12 ITO H DAIDO S KANZAWA T et al.Radiation-induced auto-phagy is associated with LC3 and its inhibition sensitizes malignant glioma cells J.International Journal of Oncology 2005 26 5 1401-1410.13 MATS J M CAMPOS-SANDOVAL J A SANTOS-JIMNEZ J L et al.Dysregulation of glutaminase and glutamine synthetase in cancer J.Cancer Letters 2019 467 29-39.14 BOTT A J PENG I C FAN Y et al.Oncogenic Myc induces ex-pression of glutamine synthetase through promoter demethylation J.Cell Metabolism 2015 22 6 1068-1077.15 OSADA T NAGASHIMA I TSUNO N H et al.Prognostic signif-icance of glutamine synthetase expression in unifocal advanced hep-atocellular carcinoma J.Journal of Hepatology 2000 33 2 247-253.16 RONZIO R A ROWE W B MEISTER A.Studies on the mecha-nism of inhibition of glutamine synthetase by methionine sulfoximine J.Biochemistry 1969 8 3 1066-1075.17 ROWE W B RONZIO R A MEISTER A.Inhibition of glutamine synthetase by methionine sulfoximine.Studies on methionine sulfox-imine phosphate J.Biochemistry 1969 8 6 2674-2680.18 JEITNER T M COOPER A J.Inhibition of human glutamine syn-thetase by L-methionine-S R-sulfoximine-relevance to the treatment of neurological diseases J.Metabolic Brain Disease 2014 29 4 983-989.19 TARDITO S CHIU M FRANCHI-GAZZOLA R et al.The non-proteinogenic amino acids L-methionine sulfoximine and DL-phos-phinothricin activate mTOR J.Amino Acids 2012 42 6 2507-2512.20 TARDITO S CHIU M UGGERI J et al.L-Asparaginase and in-hibitors of glutamine synthetase disclose glutamine addiction of-catenin-mutated human hepatocellular carcinoma cells J.Current Cancer Drug Targets 2011 11 8 929-943.21 CHIU M TARDITO S PILLOZZI S et al.Glutamine depletion by crisantaspase hinders the growth of human hepatocellular carcino-ma xenografts J.British Journal of Cancer 2014 111 6 1159-1167.22 FRANKEN N A RODERMOND H M STAP J et al.Clonogenic as-say of cells in vitro J.Nature Protocols 2006 1 5 2315-2319.23 PALMIERI E M MENGA A MARTN-PREZ R et al.Pharma-cologic or genetic targeting of glutamine synthetase skews macropha-ges toward an M1-like phenotype and inhibits tumor metastasis J.Cell Reports 2017 20 7 1654-1666.24 WHITE E DIPAOLA R S.The double-edged sword of autophagy modulation in cancer J.Clinical Cancer Research An Official Journal of the American Association for Cancer Research 2009 15 17 5308-5316.25 SINGH S S VATS S CHIA A Y et al.Dual role of autophagy in hallmarks of cancer J.Oncogene 2018 37 9 1142-1158.26 TAKAMURA A KOMATSU M HARA T et al.Autophagy-defi-cient mice develop multiple liver tumors J.Genes&Develop-ment 2011 25 8 795-800.27 AMARAVADI R K KIMMELMAN A C DEBNATH J.Targeting autophagy in cancer recent advances and future directions J.Cancer Discovery 2019 9 9 1167-1181.28 LIN Z NIU Y WAN A et al.RNA m 6 A methylation regulates sorafenib resistance in liver cancer through FOXO3-mediated auto-phagy J.The EMBO Journal 2020 39 12 e103181.29 SHIMIZU S TAKEHARA T HIKITA H et al.Inhibition of auto-phagy potentiates the antitumor effect of the multikinase inhibitor sorafenib in hepatocellular carcinoma J.International Journal of Cancer 2012 131 3 548-557.30 YAO Q ZHENG R XIE G et al.Late-responding normal tissue cells benefit from high-precision radiotherapy with prolonged fraction delivery times via enhanced autophagy J .Scientific Reports 2015 5 1 9119.31 LIN T ZHANG Q YUAN A et al.Synergy of tumor microenvi-ronment remodeling and autophagy inhibition to sensitize radiation for bladder cancer treatment J.Theranostics 2020 10 17 7683-7696.32 LI Y CHO M H LEE S S et al.Hydroxychloroquine-loaded hol-low mesoporous silica nanoparticles for enhanced autophagy inhibition and radiation therapy J.Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society 2020 325 100-110.33 MUKHA A KAHYA U DUBROVSKA A.Targeting glutamine metabolism and autophagy the combination for prostate cancer radi-osensitization J.Autophagy 2021 17 11 3879-3881.34 HE Q LI J DONG F et al.LKB1 promotes radioresistance in e-sophageal cancer cells exposed to radiation by suppression of apop-tosis and activation of autophagy via the AMPK pathway J.Mo-lecular Medicine Reports 2017 16 2 2205-