核酸分离与纯化.pptx

1v核酸核酸是分子生物学实验的主要研究对象，是分子生物学实验的主要研究对象，许多分子生物学实验的第一步都要进行许多分子生物学实验的第一步都要进行核酸的提取，如核酸的提取，如PCRPCR、基因测序及分子、基因测序及分子克隆等克隆等.v提取核酸的提取核酸的种类种类:真核细胞基因组真核细胞基因组DNADNA、质粒质粒DNADNA、总、总RNARNA及及mRNA mRNA 第1页/共32页2v 提取的核酸样品的完整性和纯度直接提取的核酸样品的完整性和纯度直接 关系到最后实验的结果关系到最后实验的结果v 鉴定技术鉴定技术 :分光光度技术分光光度技术:样品定量、纯度鉴定样品定量、纯度鉴定 凝胶电泳技术凝胶电泳技术:样品定量、纯度鉴定样品定量、纯度鉴定 分子量测定分子量测定 、分离核酸片段、分离核酸片段 第2页/共32页3第一节核酸分离与纯化的基本过程第一节核酸分离与纯化的基本过程一、材料与方法一、材料与方法 1.材料：血液、尿液、唾液、组织、培养细胞材料：血液、尿液、唾液、组织、培养细胞 2.方法：方法：保证核酸一级结构的完整性保证核酸一级结构的完整性 原则原则 排除其他分子的污染，保证样品的纯度排除其他分子的污染，保证样品的纯度第3页/共32页4二、技术路线二、技术路线 1.核酸的释放核酸的释放 破碎细胞，释放核酸破碎细胞，释放核酸 方法：机械法方法：机械法 破坏线性破坏线性DNA 非机械法非机械法 2.核酸的分离与纯化核酸的分离与纯化 大分子污染物大分子污染物 污染物污染物 非需要的核酸分子非需要的核酸分子 对后续实验有影响的溶液和试剂对后续实验有影响的溶液和试剂 第4页/共32页5 3.核酸的浓缩、沉淀与洗涤核酸的浓缩、沉淀与洗涤 浓缩浓缩:沉淀：有机溶剂沉淀法沉淀：有机溶剂沉淀法 原理：原理：洗涤：用洗涤：用7075乙醇去除沉淀中的盐乙醇去除沉淀中的盐第5页/共32页6 4 4、鉴定与保存、鉴定与保存 1.1.）核酸的鉴定）核酸的鉴定 浓度、纯度、完整性浓度、纯度、完整性 浓度鉴定浓度鉴定 a a 紫外分光光度法紫外分光光度法 260nm260nm 在标准条件下，在标准条件下，1 1个吸光度单位相当于个吸光度单位相当于 5050 g/mlg/ml的双链的双链DNADNA 38 38 g/mlg/ml的单链的单链DNADNA或或RNARNA 33 33 g/mlg/ml的单链寡聚核苷酸的单链寡聚核苷酸 b b 荧光光度法荧光光度法 荧光染料：荧光染料：溴化乙锭溴化乙锭 发出发出橙红色橙红色荧光荧光 第6页/共32页7 纯度鉴定纯度鉴定 a 紫外分光光度法：紫外分光光度法：测测A260A280的比值判断是否有蛋白质污染的比值判断是否有蛋白质污染 （为什么）（为什么）A260A280比值为比值为1.8，纯，纯DNA A260A280比值为比值为2.0,纯纯RNA b 荧光光度法：用溴化乙锭为染料示踪核荧光光度法：用溴化乙锭为染料示踪核 酸电泳结果判断纯度酸电泳结果判断纯度第7页/共32页8 完整性鉴定：用溴化乙锭为染料示踪核酸完整性鉴定：用溴化乙锭为染料示踪核酸电泳结果判断完整性。电泳结果判断完整性。2）核酸的保存）核酸的保存 DNA的保存的保存 pH 影响影响DNA稳定性稳定性 pH7.08.0 EDTA 减少二价金属离子减少二价金属离子 氯仿氯仿 防止细菌污染防止细菌污染 温度温度 低温低温-70 保存数年保存数年 4 保存保存第8页/共32页9 RNA的保存的保存 a 0.3molL的醋酸钠或双蒸水，的醋酸钠或双蒸水，-70-80。若加入。若加入RNA酶抑制剂可延长保存时间。酶抑制剂可延长保存时间。b 将将RNA沉淀溶于沉淀溶于70乙醇溶液或去离子的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，甲酰胺溶液中，-20 可长期保存。可长期保存。小量分装保存小量分装保存第9页/共32页10第二节第二节 基因组基因组DNA的分离与纯化的分离与纯化一、分离与纯化的方法一、分离与纯化的方法 1.酚抽提法酚抽提法:EDTA裂解缓冲液裂解缓冲液 SDS 裂解细胞裂解细胞 蛋白酶蛋白酶K RNA酶酶 pH8.0的的Tris饱和酚抽提饱和酚抽提 醋酸铵、无醋酸铵、无水乙醇沉淀水乙醇沉淀 70乙醇洗涤乙醇洗涤 DNA 第10页/共32页11第11页/共32页122.DNA样品的进一步纯化样品的进一步纯化 方法方法:透析、层析、透析、层析、电泳电泳、选择性沉淀、选择性沉淀聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳第12页/共32页13二、二、DNA片段的回收片段的回收 (一一)原则与要求原则与要求 1.提高提高DNA片段的回收率片段的回收率 2.除去回收除去回收DNA样品中的污染样品中的污染 (二二)回收方法：回收方法：1.DEAE纤维素膜插片电泳法纤维素膜插片电泳法 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 2.电泳洗脱法电泳洗脱法 3.压碎与浸泡法压碎与浸泡法 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶第13页/共32页14第三节第三节 质粒质粒DNA的提取与纯化的提取与纯化一、提取与纯化一、提取与纯化 基本过程：基本过程：细菌培养细菌培养 细菌裂解细菌裂解 提取质粒提取质粒 1.提取方法：提取方法：碱裂解法碱裂解法 煮沸裂解法煮沸裂解法 SDS裂解法裂解法 2.纯化方法：纯化方法：氯化铯氯化铯-溴化乙锭等密度梯度溴化乙锭等密度梯度超速离心法超速离心法（CsCI-EB法）法）聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法第14页/共32页15 裂解细胞裂解细胞 细胞蛋白质、染色体变性细胞蛋白质、染色体变性 释放质粒释放质粒DNA 调调pH中性中性 质粒质粒DNA恢复天然结构恢复天然结构 沉淀（质沉淀（质粒粒DNA溶于上清液中）溶于上清液中）取上清液取上清液无水乙醇沉淀质粒无水乙醇沉淀质粒DNA 70乙醇洗涤乙醇洗涤质粒质粒DNApH12.012.6高浓度盐高浓度盐第15页/共32页16第16页/共32页17二、质粒二、质粒DNA的回收的回收 提取纯化的质粒提取纯化的质粒DNA 凝胶电泳凝胶电泳 回收回收第17页/共32页18第四节第四节 RNA的分离与纯化的分离与纯化rRNA 8085%tRNA 1520%总总RNAmRNA 15%mRNA一、一、RNA制备的条件与环境制备的条件与环境 RNase 注意：注意：1.细胞外细胞外RNase的污染的污染 2.抑制细胞内抑制细胞内RNase 第18页/共32页19措施：措施：1.洁净的实验室洁净的实验室 2.戴手套与口罩戴手套与口罩 3.一次性的实验材料和新包装的试剂一次性的实验材料和新包装的试剂 4.玻璃器皿用玻璃器皿用DEPC处理处理 5.冰浴条件下进行操作冰浴条件下进行操作第19页/共32页20二、总二、总RNA的分离与纯化的分离与纯化 （异）硫氰酸胍（异）硫氰酸胍-酚氯仿一步法酚氯仿一步法 硫氰酸胍硫氰酸胍+-巯基乙醇巯基乙醇 裂解细胞裂解细胞酚氯仿抽提裂解溶液酚氯仿抽提裂解溶液 异丙醇沉淀异丙醇沉淀75乙醇洗涤乙醇洗涤 RNApH4.0第20页/共32页21三、三、mRNA的分离与纯化的分离与纯化 细胞内细胞内mRNA特点：含量少特点：含量少 种类多种类多 分子大小不一分子大小不一 mRNA结构特点多聚腺苷酸尾（结构特点：多聚腺苷酸尾（polyA）方法：方法：oligo(dT)-纤维素柱层析法纤维素柱层析法 oligo(dT)-纤维素液相结合离心法纤维素液相结合离心法第21页/共32页22第22页/共32页23第五节第五节 DNA测序测序v 主要方法主要方法:双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法 Maxam-Gilbert化学降解法化学降解法 DNA自动化测序自动化测序第23页/共32页24一、双脱氧末端终止法一、双脱氧末端终止法 原理：原理：模板：单链模板：单链DNA（待测序的待测序的DNA）酶：大肠杆菌酶：大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 引物：引物：5端标记的寡核苷酸链端标记的寡核苷酸链 底物：底物：dNTP(AGCT)ddNTP(AGCT)第24页/共32页25 反应体系：四组独立的反应体系反应体系：四组独立的反应体系 每组均含有每组均含有dNTP(AGCT)ddNTP(一种一种)操作：操作：1.获得标记片段组获得标记片段组 2.电泳电泳 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 3.显影显影 4.读序读序第25页/共32页26第26页/共32页27第27页/共32页28二、二、Maxam-Gilbert化学降解法化学降解法 待测待测DNA标记标记 四组独立反应体系四组独立反应体系 针对某一种碱基进行切割针对某一种碱基进行切割第28页/共32页29第29页/共32页30第30页/共32页31三、三、DNA测序自动化测序自动化 DNA自动测序仪，凝胶电泳、数据收集、自动测序仪，凝胶电泳、数据收集、序列分析均自动化。序列分析均自动化。原理：四组反应体系均含有原理：四组反应体系均含有dNTP和和ddNTP及一种荧光标记的引物，并且四组反应及一种荧光标记的引物，并且四组反应体系的引物用不同颜色的荧光染料标记。体系的引物用不同颜色的荧光染料标记。第31页/共32页32第32页/共32页