IRF4通过调控FOXP3影响支气管肺发育不良模型小鼠肺血管内皮细胞增殖.pdf

中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2023，39（8）：1366-1372杂志网址：http:/IRF4通过调控FOXP3影响支气管肺发育不良模型小鼠肺血管内皮细胞增殖*朱莹，何朗粤，江健锋，卢红艳（江苏大学附属医院儿科，江苏 镇江 212000）摘要 目的：通过分析干扰素调节因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4）和叉头框蛋白P3（forkhead box P3，FOXP3）的相互作用及其与肺血管内皮细胞（pulmonary vascular endothelial cells，PVECs）增殖的关系，探讨IRF4在支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）模型小鼠肺发育中的作用。方法：利用85%高氧暴露建立C57BL/6小鼠BPD模型，以空气暴露为正常对照，将小鼠分为常氧7 d（normoxia for 7 d，N7）组、高氧7 d（hyperoxia for 7 d，H7）组、常氧14 d（normoxia for 14 d，N14）组和高氧14 d（hyperoxia for 14 d，H14）组，每组6只。分别在空气或高氧暴露7 d和14 d取肺组织，苏木素-伊红染色观察肺组织病理情况；免疫组化染色检测PVECs增殖标志物血小板内皮细胞黏附分子1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）的表达；Western blot检测血管内皮生长因子 A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、血管生成素 1（angiopoietin-1，Ang-1）、FOXP3和IRF4蛋白的表达水平；免疫共沉淀检测IRF4和FOXP3蛋白的相互作用。结果：与同时间点常氧组相比，高氧组小鼠肺组织CD31阳性细胞平均光密度和肺血管密度均显著降低（P0.01）；高氧组小鼠肺组织VEGFA、Ang-1和FOXP3蛋白表达水平均显著降低，IRF4蛋白表达水平显著升高（P0.01）；免疫共沉淀提示IRF4和FOXP3存在相互作用，且高氧组较常氧组相互作用显著增强（P0.01）；IRF4 和 FOXP3 蛋白表达呈显著负相关（R=0.932，P0.01），FOXP3蛋白表达与CD31呈显著正相关（R=0.865，P0.01）。结论：在高氧诱导的BPD模型小鼠中，IRF4可能通过抑制FOXP3蛋白表达影响PVECs的增殖和肺血管发育。关键词 干扰素调节因子4；叉头框蛋白P3；肺血管内皮细胞；支气管肺发育不良中图分类号 R363.2；R722.6 文献标志码 A doi：10.3969/j.issn.1000-4718.2023.08.003IRF4 influences proliferation of pulmonary vascular endothelial cells in bronchopulmonary dysplasia model mice by regulating FOXP3ZHU Ying，HE Langyue，JIANG Jianfeng，LU Hongyan（Department of Pediatrics，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang 212000，China.E-mail：）ABSTRACT AIM：To study the function of interferon regulatory factor 4（IRF4）in the lung development of bronchopulmonary dysplasia（BPD）model mice by analyzing the interaction of IRF4 and forkhead box P3（FOXP3）and their relevance with the proliferation of pulmonary vascular endothelial cells（PVECs）.METHODS：The BPD model of C57BL/6 mice exposed to 85%hyperoxia was built，and the mice in normoxia group were used as normal control.These mice were randomly divided into normoxia for 7 d（N7）group，hyperoxia for 7 d（H7）group，normoxia for 14 d（N14）group and hyperoxia for 14 d（H14）group.The lung tissue was obtained at 7 and 14 d after exposure to normoxia or hyperoxia，and the pathological changes of lung tissues were observed by hematoxylin-eosin staining.The expression of platelet endothelial cell adhesion molecule-1（PECAM-1/CD31），a proliferative marker of PVECs，was detected by immunohistochemical staining.Western blot was used to detect the protein expression levels of vascular endothelial growth factor A（VEGFA），angiopoietin-1（Ang-1），FOXP3 and IRF4.The interaction of IRF4 and FOXP3 proteins was detected by co-immunoprecipitation.RESULTS：Compared with normoxia group simultaneously，the average optical density of CD31 positive cells and the density of pulmonary vessels in hyperoxia group were significantly decreased（P0.01）.The expres文章编号 1000-4718（2023）08-1366-07 收稿日期 2023-06-01 修回日期 2023-07-14*基金项目 国家自然科学基金资助项目（No.82171702）；江苏省自然科学基金资助项目（No.BK20201226）通讯作者 Tel：[phone]；E-mail：1366sion of VEGFA，Ang-1 and FOXP3 proteins in the lung tissue of mice in hyperoxia group was substantially reduced（P0.01）.Co-immunocoprecipitation showed that there was association between IRF4 and FOXP3，and the correlation of hyperoxia group was significantly enhanced compared with the normoxia group（P0.01）.The expression of IRF4 and FOXP3 protein was significantly negatively correlated（R=0.932，P0.01），and the expression of FOXP3 protein was substantially positively correlated with CD31（R=0.865，P0.01）.CONCLUSION：IRF4 may impact the proliferation of PVECs and the development of pulmonary vessels by inhibiting the expression of FOXP3 protein in the hyperoxia-induced BPD model mice.KEY WORDS interferon regulatory factor 4；forkhead box P3；pulmonary vascular endothelial cells；bronchopulmonary dysplasia支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是一种以肺泡和肺血管发育障碍为特点的慢性肺部疾病。目前BPD的发病机制尚未明确，多发生于受各种产前或产后因素影响的早产儿，包括宫内感染、机械通气或氧疗和炎症等1-2。重症BPD患者可能伴有肺动脉高压及相关的心血管疾病，导致终生的慢性呼吸系统疾病3。肺血管内皮细胞（pulmonary vascular endothelial cells，PVECs）是肺血管的重要组成部分，通过增殖、迁移和成管等促进肺血管的生长发育4。血小板内皮细胞黏附分子 1（platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31）是PVECs的增殖标志物，血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）和血管生成素 1（angiopoietin-1，Ang-1）是调节 PVECs 功能和促进肺血管发育的关键调节因子。叉头框蛋白 P3（forkhead box P3，FOXP3）是调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）的核转录因子，在调节Treg的发育和功能中发挥着重要作用5。Xu等6研究表明，FOXP3表达水平的下调与肿瘤血管的生成减少有关。FOXP3表达减少造成的Treg功能受损，是发生肺血管重塑继而诱发肺动脉高压的重要原因之一7。干扰素调节因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4）是Treg的辅助转录因子，在信号通路中位于FOXP3的下游8。研究表明，IRF4在调节T细胞分化的过程中对FOXP3存在抑制作用，敲除 IRF4 的 T 细胞更容易诱导成为 Treg9。程文林等10研究表示，IRF4缺失能够明显促进血管内膜增生，有助于血管生成。但是，IRF4和FOXP3之间的这种相互作用，是否与高氧暴露所致BPD模型小鼠中PVECs的增殖和VEGFA、Ang-1的表达有关，是否参与了肺血管发育和BPD模型小鼠的发病机制尚不明确。本研究通过建立高氧暴露所致小鼠 BPD 模型，探究转录因子 IRF4、FOXP3的相互作用及其对PVECs增殖和肺血管发育的影响。材料和方法1动物SPF级C57BL/6孕鼠24只，体质量2836 g，由江苏大学动物中心提供，动物许可证号为 SCXK（苏）2018-0012。2主要试剂RIPA 裂解液（强）、5上样缓冲液和山羊抗兔IgG 抗（HRP标记）均购自北京康为世纪公司生物科技有限公司；PMSF溶液和蛋白酶抑制剂均购自上海碧云天生物技术有限公司；SDS-PAGE配胶试剂盒和ECL化学发光底物试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；兔VEGFA单克隆抗体、兔Ang-1单克隆抗体和兔CD31单克隆抗体为Abcam产品；通用型免疫（共）沉淀工具箱购自亚科因生物技术有限公司；山羊抗小鼠 FOXP3 多克隆抗体为 Santa Cruz 产品；预览蛋白 Marker为 Fermentas产品；小鼠-actin单克隆抗体和兔IRF4单克隆抗体为CST产品；山羊抗小鼠IgG 抗（HRP标记）购自南京福麦斯生物技术有限公司。3主要方法3.1高氧暴露新生小鼠BPD模型建立及分组利用高氧暴露模拟 BPD 模型11，C57BL/6 孕鼠孕 22 d自然娩出新生小鼠，以常氧暴露为正常对照，将小鼠分为常氧 7 d（normoxia for 7 d，N7）组、高氧 7 d（hyperoxia for 7 d，H7）组、常氧 14 d（normoxia for 14 d，N14）组和高氧14 d（hyperoxia for 14 d，H14）组，每组6只。高氧组小鼠置于氧箱中，氧浓度维持在85%，常氧组小鼠置于同一室内常压空气中；代哺乳母鼠每12 h在常氧组和高氧组间更换1次，以避免氧中毒并排除不同组间代哺乳母鼠的影响，每日观察小鼠及母鼠情况并记录。在空气或高氧暴露后7 d和14 d时，每组分别各取6只小鼠进行麻醉、气管插管，用4%多聚甲醛气管内注射原位固定，取出肺组织。左肺用于石蜡包埋，进行HE染色及免疫组织化学检1367测。右肺组织置于80 冰箱保存备用，用于相关蛋白检测。3.2新生小鼠肺组织病理检查石蜡包埋肺组织以4 m厚度连续切片，行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，显微镜下观察肺组织形态学变化。3.3免疫组化检测肺组织中CD31表达各组各时间点肺组织切片常规脱蜡至水、修复抗原、阻断内源性过氧化物酶、BSA 封闭，加入兔源抗 CD31（1 300）和抗IgG（1 200），DAB染色，苏木素复染、脱水、封片。采用ImageJ图像采集系统分析，以细胞中存在棕黄色颗粒为阳性染色，以阳性细胞平均光密度值记为该肺组织标本中CD31含量，并计算肺血管密度。肺血管密度（）=肺组织CD31免疫染色阳性的内皮细胞所占面积/肺实质细胞总面积100%。3.4 Western blot 检 测 肺 组 织 中 VEGFA、Ang-1、FOXP3及IRF4蛋白表达RIPA裂解液（含PMSF、蛋白酶抑制剂）提取各组肺组织细胞总蛋白，按每泳道取 10 L 总蛋白进行 SDS-PAGE 分离，湿式电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉溶液37 封闭1 h后，分别加 入 抗VEGFA 抗 体（1：500）、Ang-1 抗 体（1 2 000）、FOXP3抗体（1 500）、IRF4抗体（1 1 000）及-actin抗体（1 1 000）4 孵育过夜，洗膜，添加抗IgG（1 5 000），37 孵育1 h，ECL化学发光显色。以目的蛋白与-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达水平。3.5免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）检测肺组织中IRF4和FOXP3表达称取0.1 g组织，加入1 mL非变性裂解缓冲液、1 L蛋白酶抑制剂混合物，匀浆器研磨，冰上裂解5 min，4、7992g离心10 min，收集上清。取20 L上清作为Input，加入5上样缓冲液煮沸10 min。每管离心管中加入20 L的Protein A/G磁珠，置于磁分离架上，静置10 s，吸弃上清，加入1 mL 1洗涤液重悬洗3次。分别加入10 L FOXP3 抗体、2 L 小鼠 IgG，室温摇摆孵育 30 min，留底、洗弃3次。加入0.25 mL蛋白上清，4 摇摆过夜，留底、洗弃3次。加入30 L 1上样缓冲液混合均匀，100 加热5 min，35g离心1 min，收集上清液，进行Western blot检测。4统计学处理采用 GraphPad Prism 8.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数标准差（meanSD）表示，两组样本间比较采用t检验；两样本间相关性采用 Pearson 相关分析。以 P0.05 为差异有统计学意义。结果1各组新生小鼠肺组织病理变化与同时间点常氧组相比，高氧组各时点肺组织结构紊乱，肺间隔增厚，且肺泡逐渐融合增大，数量减少，大小不一，见图1。2各组肺血管内皮细胞增殖及肺血管密度变化免疫组化结果显示，与同时间点常氧组比较，高氧组小鼠肺组织CD31阳性细胞平均光密度值及肺血管密度均显著降低（P0.01），见图2。3各组新生小鼠肺组织VEGFA、Ang-1、FOXP3及IRF4蛋白表达Western blot结果表明，生后7 d和14 d，与常氧组相比，高氧组小鼠肺组织VEGFA、Ang-1和FOXP3蛋白表达水平显著降低（P0.01），IRF4蛋白表达显著增加（P0.01），见图3。4新生小鼠肺组织中IRF4和FOXP3免疫共沉淀表达Co-IP 结果显示，IRF4 和 FOXP3 蛋白质间存在相互作用。生后7 d和14 d，与常氧组相比，高氧组IRF4和FOXP3相互作用增加（P0.01），见图4。5相关性分析高氧暴露 BPD 模型小鼠中，肺组织 IRF4 和FOXP3表达呈负相关（R=0.932，P0.01）；FOXP3Figure 1.HE staining observation of lung tissue morphology in each group of mice.In compared with normoxia group，the hyperoxia group has disordered lung tissue structure，thickened pulmonary septum and varying sizes of alveoli.图1HE染色观察各组小鼠肺组织形态1368表达和 PVECs 增殖标志物 CD31表达呈正相关（R=0.865，P0.01），见图5、6。讨论BPD是一种常见于早产儿的慢性肺部疾病，其主要疾病特点包括肺泡化障碍和肺血管发育不良等。本研究采用高氧暴露建立小鼠BPD模型，肺组织形态学可见肺间隔增厚、肺泡结构简化、大小不一等，符合经典 BPD 的病理特点，提示造模成功。PVECs在诱导肺血管生成中起着决定性作用，而肺血管在肺发育过程中积极促进肺泡的生长，有助于维持肺泡结构，促进肺发育12-13。高氧暴露极易使PVECs 发生氧化应激，导致细胞水肿增加、功能障碍、存活和生长受损14-15。CD31是一种细胞黏附分子，在发育和成熟个体所有内皮细胞中均高度表达，可用来作为 PVECs 的增殖标志物16-17。本研究显示，BPD模型小鼠肺组织CD31表达和肺血管密度均下降，提示高氧易使BPD模型小鼠PVECs增殖减少，从而影响肺血管发育及肺泡化进程。VEGFA 是一种有效的 PVECs 特异性丝裂原和存活因子，可以促进PVECs的增殖和分化，从而促进肺血管的生长和重塑。VEGFA是肺血管生长的关键调节因子，对早期肺血管发育至关重要18。Ang-1是特异性作用于PVECs的血管生长因子，和VEGFA具有协同作用，可以在体内诱导新生肺血管的形成并维持血管的稳定性19。本研究显示，与同时间点常氧组相比，BPD模型小鼠肺组织中VEGFA、Ang-1表达显著减少，提示高氧诱导的BPD模型小鼠肺血管发育存在障碍。已有文献报道，PVECs在体外高氧暴露条件下，VEGFA表达的减少会影响PVECs的迁移、成管过程，使肺血管发育受阻20。Sudhadevi等21在小鼠体外实验中检测到Ang-1蛋白表达下降与PVECs活性及肺泡化障碍有关。此外，王玲等22研究也显示 BPD 模型大鼠肺泡发育受阻可能与VEGFA及Ang-1蛋白表达减少有关。因此，结合本研究结果，提示高氧暴露下 PVECs 增殖相关蛋白VEGFA和Ang-1表达的下降，可能参与了模型小鼠BPD的病理生理过程。FOXP3是Treg的核转录因子，可能是Treg发挥抗炎和血管保护作用的重要中间介质。研究报道，在肿瘤血管中拮抗 FOXP3 的表达会降低血管密度23。在肺动脉高压中，FOXP3表达也被证实与肺血管发育有关，可能对肺血管存在保护作用8。本研究结果显示，与同时间点常氧组相比，BPD模型小鼠肺组织中 FOXP3 表达减少，与 VEGFA、Ang-1、CD31及肺血管密度表达趋势一致，提示FOXP3表达减少可能与 PVECs 增殖减少和肺血管发育障碍有关。IRF4是IRF家族成员之一，主要发挥免疫调控作用，可能参与调节肺的氧化应激等免疫反应。Wang等24研究表明，肺固有淋巴细胞依赖于IRF4发Figure 2.Immunohistochemical detection of CD31 expression in lung tissues of the mice in each group.The number of pulmonary vessels in hyperoxia groups is less than that in normoxia groups at the same time point.AOD：average optical density；PVD：pulmonary vascular density.MeanSD.n=6.*P0.01 vs N7 group；#P0.01 vs N14 group.图2免疫组化检测各组小鼠肺组织CD31表达1369挥促炎作用，而敲除IRF4的小鼠在面对外部环境刺激时能够明显减轻细胞促炎反应，提示IRF4可能和肺部炎症反应有着密切关系。本研究结果也观察到BPD模型小鼠肺组织中IRF4表达增加，且高氧暴露14 d时较7 d升高，提示IRF4过表达可能参与了BPD模型小鼠肺损伤的发生发展。另有研究观察到，在白细胞介素21和转化生长因子共同存在的条件下培养IRF4-/-Th细胞，FOXP3显著上调25。此外，在过敏性哮喘小鼠模型中也检测到FOXP3表达下降，而IRF4表达增强26。在此基础上，本研究聚焦于BPD模型小鼠，观察到肺组织中IRF4和FOXP3之间存在蛋白互作，提示高氧暴露下IRF4可能对FOXP3存在抑制作用。为进一步明确IRF4对FOXP3是否存在抑制作用，这种抑制作用是否与PVECs增殖减少和肺血管发育障碍有关，本研究通过相关分析得出结论，IRF4和FOXP3呈负相关，FOXP3与CD31表达呈正相关，提示IRF4可能通过下调FOXP3的表达影响了PVECs的增殖和肺血管发育，这可能与高氧诱导BPD模型小鼠的发病机制有着重要联系，但仍需进一步研究。综上所述，在高氧诱导的 BPD 模型小鼠中，PVECs 的增殖减少和肺血管发育障碍可能与 IRF4Figure 3.Western blot detection of VEGFA，Ang-1，FOXP3 and IRF4 protein expression in lung tissues of the mice in each group.MeanSD.n=6.*P0.01 vs N7 group；#P0.01 vs N14 group.图3Western blot检测各组小鼠肺组织VEGFA、Ang-1、FOXP3、IRF4蛋白表达1370对FOXP3的抑制作用相关。应用基因敲除技术或拮抗剂抑制IRF4的功能，或许能调控FOXP3蛋白的水平，但其对于高氧暴露所致BPD模型小鼠中PVECs的增殖、肺血管发育和肺发育是否具有保护作用有待进一步研究。参考文献1Doyle LW.Postnatal corticosteroids to prevent or treat bronchopulmonary dysplasia J.Neonatology，2021，118（2）：244-251.2Gilfillan M，Bhandari A，Bhandari V.Diagnosis and management of bronchopulmonary dysplasiaJ.BMJ，2021，375：n1974.3Wang SH，Tsao PN.Phenotypes of bronchopulmonary dysplasia J.Int J Mol Sci，2020，21（17）：6112.4王思思，伍金林.高氧诱导肺血管内皮细胞损伤与支气管肺发育不良的研究进展 J.中华妇幼临床医学杂志（电子版），2021，17（3）：368-372.Wang SS，Wu JL.Research progresses of hyperoxia-induced injury of pulmonary vascular endothelial cells in bronchopulmonary dysplasiaJ.Chin J Obset Gynecol Pediatr（Electr Ed），2021，17（3）：368-372.5Sakaguchi S，Mikami N，Wing JB，et al.Regulatory T cells and human disease J.Annu Rev Immunol，2020，38：541-566.6Xu L，Xia H，Ni D，et al.High-Dose dexamethasone manipulates the tumor microenvironment and internal metabolic pathways in anti-tumor progressionJ.Int J Mol Sci，2020，21（5）：1846.Figure 4.Co-immunoprecipitation detection of IRF4 and FOXP3 proteins in mouse lung tissues.A：the samples are taken from the lung tissues of newborn mice exposed to hyperoxia for 14 d；B：comparison of the interaction between IRF4 and FOXP3 proteins at different time points in the 2 groups.MeanSD.n=6.*P0.01 vs N7 group；#P0.01 vs N14 group.图4小鼠肺组织IRF4和FOXP3蛋白的免疫共沉淀检测Figure 5.Correlation analysis diagram of IRF4 and FOXP3 protein expression（R=0.932.P0.01）.图5IRF4与FOXP3蛋白表达相关分析图Figure 6.Correlation analysis diagram of FOXP3 and CD31 protein expression（R=0.865，P0.01）.AOD：average optical density.图6FOXP3蛋白表达与CD31表达相关分析图13717Savai R，Pullamsetti SS，Kolbe J，et al.Immune and inflammatory cell involvement in the pathology of idiopathic pulmonary arterial hypertensionJ.Am J Respir Crit Care Med，2012，186（9）：897-908.8Alvisi G，Brummelman J，Puccio S，et al.IRF4 instructs effect or Treg differentiation and immune suppression in human cancer J.J Clin Invest，2020，130（6）：3137-3150.9Arnold 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