HPLC-ELSD高效液相色谱-蒸发光检测器同时测定美洛昔康注射液中甘氨酸、氯化钠和葡甲胺的含量.pdf

第3 7 卷第6 期2023年1 1 月天津化工Tianjin Chemical IndustryVol.37No.6Nov.2023HPLC-ELSD高效液相色谱蒸发光检测器同时测定美洛昔康注射液中甘氨酸、氯化钠和葡甲胺的含量孙立亚1,李芳1,王军波1,杨丽英1,孙京国2（1.百美达医药科技（北京）有限公司，河北石家庄0 5 0 0 0 0；2.河北师范大学化学与材料科学学院，河北石家庄0 5 0 0 0 0）摘要：目的：建立美洛昔康注射液中甘氨酸、葡甲胺和氯化钠同时定量的检测方法，为美洛昔康注射液一致性评价工作提供全面依据和参考。方法：采用HPLC-ELSD方法，色谱柱为TechMateTX（4.6 x 2 5 0 mm,5 m）；流动相为5 0 mmol/L的醋酸铵缓冲盐（pH值为5.0)-乙睛，梯度洗脱；柱温为室温；蒸发光检测器参数为漂移管温度40,载气(N2)流速1.5 L/min。结果：建立了美洛昔康注射液中甘氨酸、葡甲胺和氯化钠同时定量的检测方法，色谱峰峰形良好，能达到很好的分离，且样品测定不受其他物料干扰,各组分峰面积对数与进样量对数呈良好的线性关系(R20.99),回收率为 9 7.1%102.3%。结论：该方法样品处理简单，试剂易得，专属性好，准确度高，快速经济，适用于美洛昔康注射液中甘氨酸、葡甲胺和氯化钠的含量测定。关键词：高效液相色谱；蒸发光检测器；甘氨酸；葡甲胺；氯化钠doi:10.3969/j.issn.1008-1267.2023.06.024中图分类号：TQ056文献标志码：A文章编号:1 0 0 8-1 2 6 7(2 0 2 3)0 6-0 0 8 0-0 4美洛昔康注射液具有良好的解热镇痛和消炎作用，主要适用于类风湿性关节炎、疼痛性骨关节炎（关节病、退行性关节病）强直性脊柱炎的初始与短期症状性治疗，目前国家批准的参比原研产品是勃林格殷格翰生产的美洛昔康注射液。甘氨酸、葡甲胺和氯化钠是美洛昔康注射液中的主要辅料 2,美洛昔康是疏水难溶性药物,葡甲胺和甘氨酸作为助溶剂，增加了美洛昔康在注射液中的溶解度3;氯化钠作为张力调节剂,同样发挥着重要作用。目前尚未见到关于美洛昔康注射液中辅料的准确定量检测方法的报道。本文采用高效液相色谱法联合蒸发光检测器进行检测，使用泰克美TX色谱柱,可使甘氨酸、氯离子、钠离子和葡甲胺依次被洗脱出来，此方法专属性高、准确度好，甘氨酸和葡甲胺可以用外标法进行定量，由于美洛昔康注射液中还含有氢氧化钠，所以氯化钠可由氯离子结合氯化钠分子式计算得出。此方法可同时对美洛昔康注射液中的甘氨酸、葡甲胺和氯化钠进行准确定量(4-1 2 。1仪器与试药Thermo U3000型HPLC 仪（包括U3000四元泵,U3000自动进样器，Chromeleon7色谱工作站，赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；ELSD6000蒸发光散射检测器（奥泰公司）;XSE205分析天平（Mettler公司）;SE400-KpH计（Mettler公司）。甘氨酸、葡甲胺和氯化钠均为工作标准品，质量分数均大于9 9.5%。乙酸铵（色谱纯，阿拉丁试剂公司），冰乙酸（色谱纯，阿拉丁试剂公司），乙腈（色谱纯，Merk公司）,水为市售纯净水（杭州娃哈哈集团）。以勃林格殷格翰生产的美洛昔康注射液作为参比制剂（批号：M20803B-46,M20803B-14，收稿日期：2 0 2 3-0 9-1 7作者及通讯作者简介：孙立亚,女，从事化药原料药和制剂的研发,硕土。和阴性样品溶液色谱图见图1 图3。从图中可看第3 7 卷第6 期孙立亚等:HPLC-ELSD高效液相色谱-蒸发光检测器同时测定美洛昔康注射液中甘氨酸、氯化钠和葡甲胺的含量8 1M20814-03），并同时对自制样品（批号：Y10090，201101)进行对比研究。2方法2.1色谱条件采用泰克美TX色谱柱（4.6 2 5 0 mm，5.0m),蒸发光散射检测器(ELSD)运行参数：分流模式,漂移管温度为40,氮气(N2)作为载气，载气流速为1.5 L/min;流动相A为5 0 mmol/L乙酰胺缓冲溶液（冰乙酸调pH值至5.0）,流动相B为乙腈，按表1 程序进行梯度洗脱。表1 流动相梯度洗脱程序时间/min流速/(L/min)06.00.510.015.00.815.120.00.81)对照品溶液的制备。分别取适量的甘氨酸、葡甲胺和氯化钠工作标准品，精密称定，分别10080604020020406080 100 120140 160 180 200 220AmV8006004002000204060 80 100 120 140 160 180 200 220A图2 阴性样品-A（不含甘氨酸）和B（不含葡甲胺）用乙腈配制成0.5 mg/mL的甘氨酸、0.3 mg/mL的葡甲胺、0.6 mg/mL的氯化钠的对照品储备液。精密量取上述储备液各1.0 mL,置于同一1 0mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容，作为混合对照品溶液。2)供试品溶液的制备。称取美洛昔康注射液1.0g，置于1 0 0 mL量瓶中，乙腈稀释至刻度。3)阴性样品溶液的制备。称取阴性样品溶液1.0g,置于1 0 0 mL量瓶中,乙腈稀释至刻度。2.2方法学考察结果2.2.1专属性试验在上述色谱条件下，对照品溶液、样品溶液A缓冲液B乙睛10000901000图1对照品溶液A和样品溶液BmV800600400EE2000202406080100120140 160 180200 220B出，氯离子(Cl-）、甘氨酸（Glycine）、钠离子（Nat)和葡甲胺（Meglumine)的保留时间分别约为5.2、5.5、6.8 和7.2 min，样品中其他物料对目标物质的检测均没有干扰，说明此方法专属性好。1000900800700600500400300200020406080100_120140 160 180 200 220B821000mV800F6004002000204060 80100 120 140 160 180 200 220A2.2.2线性和定量限考察精密量取各个对照品储备溶液0.5、0.7、1.0、1.2、1.5 m L,分别置于1 0 mL量瓶中,乙腈稀释至刻度。在上述色谱条件下进行分析，以进样量的对数值和峰面积的对数值进行回归计算，结果见表2。以S/N10计，CI-的定量限为0.0 4g，甘氨酸的定量限为0.0 6 g，Na*的定量限为0.0 1 g，葡甲胺的定量限为0.0 9 g。表2 线性结果被测物质线性方程甘氨酸Y=1.346X+0.383葡甲胺Y=1.242X+0.292CI-Y=1.527X+0.872NatY=1.255X+1.1762.2.3精密度分别配制六份样品溶液，计算三种物质的检测结果，由于美洛昔康注射液中有氢氧化钠,所以氯化钠以Cl-的测定结果和氯化钠的相对分子质量折算得到氯化钠的含量，三种物质六个结果的相对标准偏差(RSD)均小于3%(见表3)。表3 精密度序号样品重量甘氨酸葡甲胺氯化钠11.065221.043731.006941.041651.030761.0268平均含量RSD/%天津化工1000mV800600400200020406080100120140160 180 200 220B图3阴性样品C（不含氯）和D(不含钠）2.2.4准确度通过在阴性样品中添加对照品溶液的方法，对三种物质按样品溶液中被测物质浓度的8 0%、100%和1 2 0%三个水平添加，每个浓度配制三个平行样进行检测，并计算回收率，结果被测物质的平均回收率为9 7.5%1 0 0.9%，RSD为0.7%1.8%(见表 4)。被测物质相关系数甘氨酸0.9980.9910.9990.9990.480.310.480.310.490.300.500.310.480.310.490.300.490.311.901.902023年1 1 月表4准确度结果添加量平均回收率/%3.897.54.899.06.099.1葡甲胺2.43.03.8氯化钠5.16.37.72.2.5样品测定分别对三批勃林格殷格翰的美洛昔康注射液和两批自制样品进行三种物质的检测，结果见表5。将参比产品与自制样品结果进行比较，甘氨表5 样品测定结果0.63甘氨酸/葡甲胺/氯化钠/0.62样品来源0.60勃林格殷格翰C20814-030.62F20803B-140.61M20803B-46自制Y100900.612011010.61平均质量分数/%1.70RSD/%RSD/%1.31.01.498.61.398.30.799.91.8100.91.6100.20.799.71.6批号(g/100mL)0.470.470.490.480.470.481.90(g/100mL)0.320.320.330.320.320.321.70(g/100mL)0.600.610.600.600.600.610.80第3 7 卷第6 期孙立亚等:HPLC-ELSD高效液相色谱-蒸发光检测器同时测定美洛昔康注射液中甘氨酸、氯化钠和葡甲胺的含量8 3酸、葡甲胺和氯化钠的平均质量分数为0.48%、0.32%和0.6 1%，相对标准偏差均小于2%，说明被测的三个物质在自制样品与参比产品中含量一致。3讨论本方法能同时对 CI-和Nat进行含量测定,且此方法与常用的滴定法和原子吸收光谱法相比，克服了制剂中来自于水或者其他物料对CI-或者Na+检测的干扰,具有较高的专属性,更科学更准确，同时也为其他产品中Na+和Cl-含量测定、或含有Nat或Cl-的物质的含量测定提供参考。本文建立的HPLC-ELSD测定方法，对比葡甲胺定量常用的旋光度法和高效液相联合示差检测器法，干扰少、精密度和灵敏度更高。且本方法能同时准确定量三种物质，在满足专属性、准确度和精密度的要求下，经济上更有优势。本方法能准确测定美洛昔康注射液中甘氨酸、葡甲胺和氯化钠的含量。为美洛昔康注射液一致性评价工作提供了可靠的检测结果与依据。参考文献：1】国家药品监督管理局.国家药监局关于发布仿制药参比制剂目录（第五十七批）的通告(2 0 2 2 年第3 8 号)DBIOLJ国家药品监督管理局，2 0 2 2.2 European medicines agency.Metacam:Summary of product informa-tion 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