miR-150-5p在枸杞多糖缓解小鼠肾脏纤维化中的作用研究.pdf

宁夏医学杂志2 0 2 3年9月第45卷第9期NingxiaMed J,Sep.2023,Vol.45,No.9Doi:10.13621/j.1001-5949.2023.09.0769 769.论著miR-150-5p在枸杞多糖缓解小鼠肾脏纤维化中的作用研究陈俊儒,张馨予,康平”,田福燕,张执中1【摘要】目的探讨miR-150-5p在枸杞多糖(LBP)抑制小鼠肾脏纤维化过程中的作用。方法2 1只雌性的Balb/c小鼠随机分成假手术组（只暴露左侧输尿管,不结扎）、模型组（结扎左侧输尿管）和LBP干预组（在模型组的基础上灌胃0.1mg/gLBP）。通过实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测胶原蛋白I（Co l-I）、胶原蛋白（Co l-II）、纤连蛋白（FN）和平滑肌肌动蛋白（-SMA）的变化;通过RT-qPCR检测肾脏组织中miR-150-5p的表达；通过生物信息学数据库预测miR-150-5p的靶基因并用RT-qPCR进行验证。结果与假手术组相比，模型组小鼠肾脏湿重以及肾脏指数均显著减小,Col-I、C o l-、FN及-SMA的mRNA表达水平显著升高，miR-150-5p的表达水平显著降低;LBP干预后,小鼠肾脏指数和肾脏湿重均有明显增加,Col-I、C o l-、FN及-SMA的mRNA表达水平显著降低,miR-150-5p的表达水平显著上升。通过Targetscan数据库预测miR-150-5p的靶基因,筛选出与肝脏纤维化相关的靶基因总共有2 个,分别是Mtmrl和Prickle。验证靶基因Mtmrl 和PricklemRNA的表达情况,结果表明在模型组小鼠肝脏组织中Mtmrl和Prickle的表达显著增加；在LBP干预组小鼠肝脏组织中Mtmrl的表达水平明显降低,Prickle没有显著改变。结论LBP能够调节miR-150-5p的表达并改善肾脏纤维化的作用，其机制可能是通过靶向Mtmrl实现的。关键词miR-150-5p;肾脏纤维化;枸杞多糖中图分类号 R692Effects of miR-150-5p on Lycium barbarum polysaccharides in alleviating renal fibrosis in miceCHEN Junru,ZHANG Xinyu,KANG Ping,TIAN Fuyan,ZHANG Zhizhong.1.Department of Urology,Peoples Hospital ofNingxia Hui Autonomous Region,Yinchuan 750002,China;2.Northwest University for Nationalities,Lanzhou 730030,China;3.GuolongHospital of Yinchuan,Yinchuan 750003,ChinaCorresponding author:ZHANG Zhizhong,Email:m13519571016 Abstract Objective To investigate the role of miR-150-5p in the inhibition of renal fibrosis in mice by Lycium barbarumpolysaccharide(LBP).Methods 21 female Balb/c mice were randomly divided into three groups:sham operation group(only left ure-ter was exposed without ligation),model group(left ureter was ligated)and LBP intervention group(O.1 mg/g LBP,gavage on the basisof model group).The expression of collagen I(Col-I),collagen II(Col-II),fibronectin(FN),smooth muscle actin(-SMA)and miR-150-5p in kidney tissue were detected by real-time fluorescent quantitative PCR(RT-qPCR).The target gene of miR-150-5p was predicted by bioinformatics database and verified by RT-qPCR.Results Compared with the sham operation group,thekidney wet weight and kidney index of mice in the model group were significantly decreased,the mRNA expression levels of Col-I,Col-II,FN and -SMA were significantly increased,and the expression levels of miR-150-5p was significantly reduced.After LBPintervention,the kidney index and kidney wet weight of the mice were significantly increased,the mRNA expression levels of Col-I,Col-II,FN and -SMA were significantly decreased,and the expression levels of miR-150-5p significantly increased.The targetgenes of miR-150-5p were predicted by the Target scan database,and a total of two target genes related to liver fibrosis were screenedout,namely Mtmrl and Prickle.The expression of the target gene Mtmrl and Prickle mRNA were verified,and the results showed that theexpression of Mtmrl and Prickle in the liver tissue of the mice in the model group significantly increased,the expression level of Mtmrl inthe liver tissue of the mice in the LBP intervention group was significantly reduced,and the expression of Prickle was not significantlyChange.Conclusion LBP can regulate the expression of miR-150-5p and improve renal fibrosis,and the mechanism may be a-chieved by targeting Mtmrl.Key words miR-150-5p;Renal fibrosis;Lycium barbarum polysaccharide【作者单位 1.宁夏回族自治区人民医院泌尿外科，宁夏银川7 50 0 0 22.西北民族大学，甘肃兰州7 30 0 303.宁夏银川国龙医院，宁夏银川7 50 0 0 3【作者简介 陈俊儒（198 7 一），男，硕士研究生，主治医师，主要从事泌尿系统结石研究。通信作者】张执中，副主任医师，Email：m 1351957 10 16 16 3.c o m【文献标识码 A众多慢性肾病(CKD)病程发展的终末阶段共同表现为肾脏纤维化1-3,表现为肾小管上皮间质细胞纤维化、肾小球出现硬化、肾小球滤过作用受阻、细胞外基质过度沉积,导致肾脏功能进行性减弱,甚至最770终丧失4。研究表明,LBP作为枸杞中发挥作用的主要活性成分之一,具有调节免疫系统功能、抵抗细胞氧化、预防衰老和抗肿瘤等作用5。有研究发现,LBP可以缓解心肌组织胶原纤维沉积，抑制慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化,改善大鼠心功能6 。在小鼠肾脏纤维化模型中的研究也表明,LBP能够缓解肾脏纤维化，但是具体机制尚不明确。目前许多证据表明微小RNA(miRNA)在肾脏纤维化调控过程中发挥着作用，通过靶向调控相关基因的表达从而影响疾病的进程7 。本研究通过结扎左侧输尿管构建肾脏纤维化模型,给予LBP干预后,探讨miR-150-5p在LBP抑制肾脏纤维化过程中的作用。1资料与方法1.1实验动物：实验所用小鼠均为18 2 0 g的雌性Balb/c小鼠,购自北京维通利华公司，适应性饲养1周，待小鼠适应环境后,采用手术的方法构建肾脏纤维化小鼠模型。1.2实验材料与试剂：枸杞多糖(纯度 95%)购自西安草根生物工程有限公司；所有荧光定量PCR引物均委托上海生工进行合成;RNA提取试剂盒和逆转录试剂购自Thermo公司;离心管等耗材购自武汉塞维尔公司。1.3实验方法1.3.1动物分组及模型的构建:2 1只雌性Balb/c小鼠随机分成3组,即假手术组、模型组和LBP干预组,每组7 只小鼠。假手术组小鼠麻醉后，侧卧位，分离出左侧输尿管，不结扎，清理伤口后缝合；模型组小鼠麻醉后，分离出左侧输尿管,6 号线结扎2 道，在其间剪断输尿管,清理伤口并缝合;LBP干预组小鼠在模型组的基础上每天灌胃0.1mg/g的LBP,假手术组和模型组小鼠灌胃10 0 L生理盐水,连续灌胃2 1d。取材后进行后续实验。1.3.2小鼠取材及肾脏指数的计算：称取小鼠体重后,眼球取血,摘取左侧肾脏组织,剔除多余的脂肪组织,用分析天平称重,计算各组小鼠肾脏指数。肾脏指数=肾脏湿重（g)/小鼠体重（g）10 0%。1.3.3小鼠肾脏RNA的提取与逆转录：上述摘取左侧肾脏组织用预冷的生理盐水洗去血液,剪碎后置于预冷的研钵中，加人适量液氮进行研磨。待其成为粉末后，转移至无酶EP管中,加入Trizol后彻底混匀，室温避光静置5min。避光加人2 0 0 L氯仿,剧烈混匀后静置5min，离心后吸取上层清液至新的EP管中，加人40 0 L异丙醇，室温静置10min,离心,加人预冷的7 5%酒精1mL,离心弃上清液,用50 L双蒸水重新悬浮。检测RNA的浓度宁夏医学杂志2 0 2 3年9月第45卷第9期NingxiaMed J,Sep.2023,Vol.45,No.9后按照试剂说明书进行逆转录。1.3.4小鼠肾脏基因表达水平的检测:将10 L2xSYBR GreenERTM qPCR Super Mix,0.5L上游引物,0.5L下游引物,1LcDNA模板,0.4LRox和7.6 LddH,0依次加入八联管,形成2 0 L的反应体系；反应条件为9 43min预变性,9 430 s变性,57 30 s退火,7 2 30 s是延伸过程，总共完成40 个循环,循环结束后，读取CT值，根据2-AACT方法计算基因与 GAPDH 的相对比值,将对照组的比值换算成1,绘制条形图。引物序列见表1。表1引物序列基因名称上游引物序列miR-150-5pTCTCCCAACCCTTGTACCAGTGCol-ITCCCAGCGGTGGTTATGCol-IGGCTCAAATGGCTCTCCAGFNGAGCGAGGAAGGAGATGA-SMATCCCTTGAGAAGAGTTACGAGTTGAPDHCAACGAATTGGCTACAGCA1.3.5ELISA检测小鼠血清中纤维化指标:向包被抗体的酶标板中加人稀释的小鼠血清（1:2 0 0）,置于37培养箱中孵育1h,PBST洗板3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37 培养箱中避光孵育30min,PBST洗板3次。加人底物,37 避光孵育10min,最后加人终止液，在酶标仪450 nm波长下读取数值。根据标准品的数值计算并绘制标准曲线，将各组的均值代人公式计算样品中各细胞因子含量。1.3.6生物信息学预测miR-150-5p靶基因：使用Targetscan数据库预测miR-150-5p靶基因,并利用qRT-PCR验证靶基因Mtmrl 和 PricklemRNA在各组肝脏组织中的表达。1.4统计方法：所有数据均采用xs表示，2 组之间的比较采用t检验,3组及以上之间比较采用单因素方差分析,以P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1LBP对左肾纤维化小鼠肾脏指数的影响：与假手术组相比,模型组小鼠肾脏湿重、小鼠体重以及肾脏指数均显著下降,LBP干预组小鼠肾脏湿重和小鼠体重显著下降（P0.05），肾脏指数没有明显改变;与模型组小鼠相比,LBP干预组小鼠肾脏湿重、小鼠体重均显著上升（P0.05），肾脏指数降低(P0.05),见表2。2.2LBP对左肾纤维化各组小鼠肾组织纤维化相关因子mRNA表达水平的影响：与假手术组相比,模型组小鼠肾脏组织中 Col-I、C o l-、FN 及 -下游引物序列CATCACAGAGGTTCCTGGAAGAGGTTGCAGCCTTGGTTAGGGCTCAAATGGCTCTCCAGCCTGTACCCTGTGATAGGTGTATGATGCTGTTGTAGGTGGTTAGGGGAGATTCAGTGTGGTG宁夏医学杂志2 0 2 3年9月第45卷第9期NingxiaMed J,Sep.2023,Vol.45,No.9SMA的mRNA的表达水平显著上升（P0.05）；LBP干预组小鼠肾脏组织中 Col-I、C o l-、FN及-SMA较假手术组显著上升（P0.05）;与模型组小鼠相比,LBP 干预组小鼠肾脏组织中 Col-I、C o l-I、FN及-SMA mRNA表达水平显著下降(P0.05),见图1(目次后)。表2 LBP对左肾纤维化小鼠体重、肾脏湿重及肾脏指数的影响(xs)组别肾脏湿重(g)假手术组70.890 0.050模型组70.450 0.090*LBP干预组70.630 0.040*#注：*与假手术组相比,P0.05；与模型组相比,P0.05。2.3LBP对左肾纤维化小鼠肾组织miR-150-5p表达水平的影响：与假手术组相比,模型组、LBP干预组miR-150-5p表达均降低（P0.05）;与模型组相比，LBP干预组miR150 5p 的表达上升(P0.05）,见图2(目次后)。2.4miR-150-5p 靶基因的预测:经过 Targetscan在线数据库预测miR-1505p 靶基因,结果显示miR-150-5p靶基因总共有32 6 个,筛选出与纤维化相关的靶基因总共有2 个,分别是肌微管蛋白相关蛋白1（Mtmrl）,Pr ic k le，见图3（目次后）。2.5LBP对左肾纤维化小鼠肾组织miR-150-5p靶基因 Mtmrl 和 Prickle mRNA表达水平的影响：与假手术组相比,模型组Mtmrl与Prickle的mRNA表达水平均显著上升（P0.05）,LBP干预组MtmrlmRMNA表达水平显著上升（P0.05）。与模型组相比,LBP干预组Mtmrl mRNA表达水平显著降低（P0.05）,见图4（目录后）。3讨论肾脏纤维化是CKD发展到终末阶段的共同结果。截至目前肾脏纤维化机制尚未阐明,临床对肾脏纤维化病人的治疗措施也有限,这就使肾脏纤维化成为一种严重影响人类健康的疾病。枸杞多糖作为枸杞主要活性成分之一，已被证实具有免疫调节、抗衰老、抗氧化和抗肿瘤等作用。近年来有研究表明LBP具有抗纤维化作用，干预改善了心肌组织胶原纤维沉积,能够抑制慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化，改善心功能。左侧输尿管结扎是构建肾脏纤维化小鼠模型常用的一种方式8 。本研究通过该种方式构建实验动物模型,发现小鼠肾脏湿重和肾脏指数显著降低，此外 RT-qPCR结果也显示纤维化指标 Col-I、Co l-771、FN和-SMA的mRNA表达水平显著上升,这就表明肾脏纤维化小鼠模型构建成功。给予LBP干预后,小鼠肾脏湿重上升,纤维化指标 Col-I、C o l-I、FN和-SMAmRNA 表达显著下调,肾脏纤维化得到缓解,这就提示LBP具有缓解肾脏纤维化的作用，这与文献报道的LBP作用相同。miRNA是一种非编码RNA的参与多种生命活动的调节,如基因转录、蛋白质翻译等，长度约为2 2小鼠体重（g)肾脏指数23.820 0.6700.030 0.02020.460 0.860*0.050 0.010*21.950 0.400*#0.030 0.002*个核苷酸,其能够与靶基因miRNA的3-UTR完全或不完全配对，在转录水平上发挥抑制基因表达的作用9-12 。近年来大量研究表明miRNA广泛参与肾脏纤维化调控，这些靶向肾脏纤维化相关的miRNA可能成为抗纤维化治疗的潜在手段13。研究表明miR-34a通过下调klotho缓解肾脏纤维化141;miR-21 通过靶向阻断肾脏中的 PTEN 激活成纤维细胞,从而调节肾纤维化15。Peng 等人发现miR-135a可以结合circRNA_010383缓解糖尿病肾病引起的肾脏纤维化16 。越来越多的miRNA被鉴定出来,这些miRNAs 可以作为潜在的诊断和预后的生物标志物。本研究发现，在肾脏纤维化模型中miR-150-5p表达下调,LBP干预后miR-150-5p表达上调,这就表明miR-150-5p可能参与LBP抑制肾脏纤维化进程。通过生物信息学预测的miR-150-5p靶基因总共有32 6 个，经过筛选得到与纤维化相关的mRNA有2 个，分别是Mtmrl和Prickle。经验证发现Mtmrl和Prickle在模型组小鼠肾脏组织中显著上调,给予LBP干预后,Mtmrl表达水平显著下调,Prickle表达没有明显改变。这就提示miR150-5p可能上调缓解肾脏纤维化,这还需双荧光素酶报告基因进行证实。综上所述,LBP能够通过调节miR-150-5p的表达，起到改善肾脏纤维化的作用，其机制可能是通过靶向 Mtmrl实现的,这可能为肾脏纤维化的诊断和治疗提供新思路。参考文献1NASTASE M V,ZENG BJ,WYCRECKA M,et al.Targeting re-nal fibrosis:mechanisms and drug delivery systems J.AdvancedDrug Delivery Reviews,2018,129:295-307.2JING H,TANG S M,LIN S,et al.Adiponectin in renal fibrosisJ.Aging,2020,12(5):4660-4672.3WU Q F,SUN S R,WEI L,et al.Twistl regulates macrophageplasticity to promote renal fibrosis through galectin-3 JJ.CMLS-Cellular and Molecular Life Sciences,2022,79(3):137.4NOGUEIRA A,PIRES M J,OLIVEIRA P A.Pathophysiologicalmechanisms of renal fibrosis:a review of animal models and thera-peutic strategiesJ.In Vivo,2017,31(1):1-22.772Doi:10.13621/j.1001-5949.2023.09.0772小胶质细胞介导的T细胞应答在大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎中的致病作用宁夏医学杂志2 0 2 3年9月第45卷第9期NingxiaMed J,Sep.2023,Vol.45,No.9著论周翔鱼,李娜,王佳,储晨晨,祁莉凤,杨世胜,华冰，曹羿【摘要目的探讨大鼠维持中枢神经系统(（CNS炎症的小胶质细胞、T细胞亚群之间的相互效应关系,以期部分解释实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE)中中枢神经系统（CNS持续存在病理损伤的原因。方法用鼠源性髓鞘碱性蛋白MBP68-86抗原肽制备Lewis大鼠EAE模型，透射电子显微镜观察脑组织超微结构，免疫荧光染色、Western blot、流式细胞术和RT-qPCR检测外周血、脾脏、脑组织中相关分子的表达。结果MBP6s-86抗原肽成功制备出EAE模型。流式细胞及免疫荧光分析发现EAE模型组外周血CD4*T(28.01%）、C D 8*T（12.8 1%）细胞的数量及脾脏中MHC的表达明显上调(P0.05）。同时,在中枢神经系统中小胶质细胞的CD86+CD206-M1样巨噬细胞的数量明显多于CD86-CD206+M2样巨噬细胞。Westernblot和RT-qPCR结果显示EAE模型组小胶质细胞及脑组织中MHCI、IL-10、T G F-、CD 32 b，G r a n z y me B、Pe r f o r i n、FA SL分子表达明显上调（P0.05）。结论大鼠EAE免疫应答过程中,CNS存在一个由CTL和Th2细胞共同参与的免疫应答环路,这可能是维持MS/EAE时间-空间多发性的主要机制。【关键词实验性自身免疫性脑脊髓炎;Th 细胞;CTL细胞;MHCI中图分类号R285.5The pathogenic role of microglia-mediated T cell responses in experimental autoimmune encephalomyelitis in ratsZHOU Xiangyu,LI Na,WANG Jia,CHU Chenchen,QI Lifeng,YANG Shisheng,HUA Bing,CAO Yikun.Center for Neurological Dis-eases,the First Peoples Hospital of Shizuishan,Shizuishan 753200,ChinaCorresponding author:CA0 Yikun,Email:caoyk4040 Abstract Objective To investigate the interaction between microglia and T cell subsets that maintain central nervous system(CNS)inflammation,in order to partially explain the persistent pathological damage of the central nervous system(CNS)in experimen-tal autoimmune encephalomyelitis(EAE).Methods EAE model of lewis rat was prepared by MBPs-s6 antigenic peptide of mouse5程曦，黄凝，李鸿泉，等.枸杞多糖通过调节免疫在肿瘤免疫治疗中的应用前景分析J.中医药学报,2 0 2 2,50（2）：1-4.6孟立立.枸杞多糖通过TCF1/Smad3信号通路改善慢性心衰大鼠心肌纤维化J.中国实验诊断学,2 0 2 1,2 5（2）：2 42-2 47.72ZHANG A Q,LI M,WANG B,et al.MiRNA-23a/27a attenu-ates muscle atrophy and renal fibrosis through muscle-kidneycrosstalkJ.Journal of Cachexia,Sarcopenia and Muscle,2018,9(4):755-770.8WU M Y,XIA W W,JIN Q Q,et al.Gasdermin E deletion attenu-ates ureteral obstruction-and 5/6 nephrectomy-induced renal fi-brosis and kidney dysfunction J.Front Cell Dev Biol,2021,9:754134.9HILL M,TRAN N.MiRNA interplay:mechanisms and conse-quences in cancer J.Disease Models&Mechanisms,2021,14(4):dmm047662.10CORREIA DE SOUSA M,GJORGJIEVA M,DOLICKA D,et al.Deciphering miRNAs action through miRNA editing J.Interna-【基金项目 国家自然科学基金项目（8 16 6 0 2 12【作者单位 宁夏石嘴山市第一人民医院神经疾病研究中心，宁夏石嘴山7 532 0 0【作者简介 周翔鱼（197 1一），男，博士研究生，副主任医师，主要从事神经免疫基础研究。【通信作者曹羿垫，主管检验师，Email：c a o y k 40 40 16 3.c o m文献标识码 Ational Journal of Molecular Sciences,2019,20(24):6249.11TIWARI A,MUKHERJEE B,DIXIT M.MicroRNA key to angio-genesis regulation:miRNA biology and therapy J.Current Canc-er Drug Targets,2018,18(3):266-277.12FABIAN M R,SONENBERG N.The mechanics of miRNA-me-diated gene silencing:a look under the hood of miRISC JJ.NatureStructural&Molecular Biology,2012,19(6):586-593.13李思睿，赵迅霞，张玲，等.MiR-133b在紫檀芪抑制肾脏纤维化的作用研究J.热带医学杂志，2 0 2 0,2 0（3）：30 9313，封3.14LIU Y,BI X J,XIONG J C,et al.MicroRNA-34a promotes re-nal fibrosis by downregulation of klotho in tubular epithelial cellsJ.Molecular Therapy,2019,27(5):1051-1065.15 ZHAO S,LI W,YU W M,et al.Exosomal miR-21 from tubularcells contributes to renal fibrosis by activating fibroblasts via targe-ting PTEN in obstructed kidneys J.Theranostics,2021,11(18):8660-8673.16 PPENG F F,CONG W Q,LI S T,et al.CircRNA_010383 acts asa sponge for miR-135a,and its downregulated expression con-tributes to renal fibrosis in diabetic nephropathy J.Diabetes,2021,70(2):603-615.收稿日期 2 0 2 3-0 3-31【责任编辑 李洁Doi:10.13621/j.1001-5949.2023.09.07692.5mA2.01.51.00.50.02.0B1.51.00.50.0联联A1.5斤1.0联蔬道0.5C1.5D2.01.51.01.00.50.50.00.00.0模型组福图1 LBP对左肾纤维化小鼠肾组织Col-I、Co l-II、FN及-SMAmRNA表达水平的影响图2 LBP对左肾纤维化小鼠肾组织miR-150-5p表达水平的影响Position 239-246 of Mtmr 3UTRMmu-miR-150-5pPosition 4355-4361ofPrickle23UTR5.UAUAGAGUACAACUAUUGGGAGC.Mmu-miR-150-5p5.UCUUGUACAGGUAGCUUGGGAGA.3*GUGACCAUGUUCCCAACCCUCU3*GUGACCAUGUUCCCAACCCUCU图3Target预测miR-150-5p靶基因AB.51.01.00.50.50.00.0模型组图4LBP对左肾纤维化小鼠肾组织miR-150-5p靶基因Mrmt1和PricklemRNA表达水平的影响