DACT3在卵巢癌中的表达及其意义.pdf

交通医学 2023 年第 37 卷第 4 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.4咱文章编号暂1006-2440渊2023冤04-0341-04咱引文格式暂徐慧，王璇，韩勇，等.DACT3 在卵巢癌中的表达及其意义 J.交通医学，2023，37（4）：341-344.*基金项目 南通市科技项目（JC2021148；JC2021150）。*作者简介 徐慧，女，汉族，江苏宿迁人，生于 1995 年 11 月，硕士。研究方向：妇科肿瘤。通信作者：石宇，E-mail：DACT3 在卵巢癌中的表达及其意义*徐慧1袁2*袁王璇2袁韩勇3袁4袁石宇3渊1淮安市第二人民医院妇产科袁江苏 223002曰2南通大学医学院曰3南通大学附属医院肿瘤放疗科曰4上海交通大学附属第一人民医院肿瘤中心冤摘要目的院探究 茁-环连蛋白抑制基因 3（dishevelled-binding antagonist of beta-catenin 3，DACT3）在卵巢癌中的表达及其预后意义。方法院从 TCGA 及 GTEx 数据库中收集卵巢癌组织基因测序数据，分析 DACT3 表达与卵巢癌患者总生存期（overall survival，OS）及无进展生存期（progression-free survival，PFS）的相关性。选择 60 例手术切除的浆液性卵巢癌及正常卵巢组织标本，采用免疫组化检测组织中 DACT3 表达，分析 DACT3 表达与患者临床病理特征及OS 的相关性，采用单因素和多因素 COX 回归分析影响卵巢癌预后的危险因素。采用细胞划痕实验观察 siRNA 转染对人卵巢癌腺癌细胞株 SKOV3 迁移能力的影响。结果院TCGA 及 GTEx 数据库数据显示，DACT3 高表达患者的 OS 和PFS 较短（P约0.05），COX 回归分析显示，DACT3 表达是影响卵巢癌预后的独立危险因素（P=0.00051）。对 60 例临床卵巢癌患者分析显示，DACT3 表达与肿瘤分化程度及 FIGO 分期相关（P0.05），DACT3 高表达患者 OS 较短。免疫组化显示，卵巢癌组织中 DACT3 高表达，高级别卵巢癌组织中 DACT3 表达较低级别更强。干扰 DACT3 表达后 SKOV3 细胞迁移能力显著减弱。结论院DACT3 在卵巢癌中高表达，是影响卵巢癌预后的独立危险因素，有可能作为卵巢癌患者的预后指标和分子治疗的靶标。关键词茁-环连蛋白抑制基因 3；卵巢癌；预后中图分类号R737.31文献标志码ADOI10.19767/ki.32-1412.2023.04.003Expression and significance of DACT3 in ovarian cancerXU Hui1袁2,WANG Xuan2,HAN Yong3袁4,SHI Yu3(1Department of Obsetetrics and Gynecology,Huai爷an Second People爷s Hospital,Jiangsu 223002;2Medical College of NantongUniversity;3Department of Radiation Oncology,Affiliated Hospital of Nantong University;4Cancer Center of the First People爷s Hospital affiliated to the Shanghai Jiao Tong University)AbstractObjective:To investigate the expression and prognostic significance of dishevelled-binding antagonist ofbeta-catenin 3(DACT3)in ovarian cancer.Methods:Ovarian cancer tissue and normal tissue sequencing data were down鄄loaded from the Cancer Genome Atlas(TCGA)and GTEx databases to analyze the correlation of DACT3 with overall sur鄄vival(OS)and progression-free survival(PFS)in patients with ovarian cancer.Sixty cases of serous ovarian cancer andnormal ovarian tissue were selected.Immunohistochemistry was performed to detect DACT3 expression in ovarian cancertissues.Univariate and multifactorial COX analyses were performed to test the risk factor affecting the prognosis of ovariancancer.Cell migration ability of SKOV3 was detected by cell scratch assay.Results:TCGA and GTEx database data dis鄄played that OS and PFS were shorter in patients with high DACT3 expression(P0.05);COX analyses suggested thatDACT3 could be an independent prognostic predictor in ovarian cancer(P=0.00051).Analysis of 60 ovarian cancer patientsshowed that DACT3 expression was correlated with tumor differentiation and FIGO stage(P1.5 且P0.01。RNA-seq 数据使用 R 语言进行归一化处理。1.2临床资料收集 2016 年 1 月2017 年 12 月南通大学附属医院 60 例手术切除的浆液性卵巢癌及其癌旁正常卵巢组织标本，年龄 32耀74 岁，平均55依2.02 岁；低级别 33 例，高级别 27 例；FIGO 分期I耀II 期 33 例，III耀IV 期 27 例。本研究获我院医学伦理委员会批准同意。1.3免疫组化检测 DACT3 表达将 60 例手术切除的浆液性卵巢癌及其癌旁正常卵巢组织标本连续切片，4 滋m 厚，免疫组化染色采用 ElivisionTMPlus 法。DACT3 表达水平根据染色强度和范围综合评估。染色强度：未染色计 0 分，淡黄色计 1 分，浅棕色计 2 分，深褐色计 3 分。染色范围：阳性细胞占总细胞75%计 4 分。上述两项得分的乘积为最终分数，逸3 分视为高表达，约3 分为低表达。1.4细胞培养与转染人卵巢癌 腺癌细胞 株SKOV3（ATCC 细胞库）以 DMEM 高糖培养基（含10%FBS 和 1%青霉素-链霉素）于 5%CO2、37 益下培养，当镜下细胞密度达到 80%耀90%时传代，传代后细胞密度达到 70%时进行 siRNA 转染，采用Lipofectamine 2000 试剂（美国 Thermo Fisher）进行细胞转染。分为 DACT3 干扰组和阴性对照组。1.5Western blot 实验收集转染 48 h 的 SKOV3细胞，用 RIPA 裂解液提取蛋白。经 SDS-PAGE 电泳后转移至 PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭。加入一抗稀释液（DACT3 稀释比例 1颐250，GAPDH 稀释比例1颐1 000），4 益孵育过夜。TBST 洗膜，加二抗稀释液（1颐3 000）室温孵育 1 h，TBST 洗膜后，使用 ECL 化学发光检测试剂盒进行信号检测。DACT3 购自 Bio-Techne，GAPDH 及二抗购自碧云天生物技术有限公司。1.6细胞划痕实验收集已转染的 SKOV3 细胞分别接种在 6 孔板上，置于 37 益、5%CO2培养箱中培养。细胞密度达到 90%以上时，采用无菌枪头在培养皿中均匀划痕，PBS 洗涤 3 次，加入无血清培养基继续培养。在划痕 0 h 和 24 h 后显微镜下拍照，通过Image J 图像处理软件计算划痕愈合率。1.7统计学处理应用 SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。计数资料以频数和率表示，组间比较采用字2检验；采用 Kaplan-Meier 法分析患者生存期；单因素及多因素 COX 比例风险回归模型分析 DACT3与卵巢癌预后的关系。以 P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1DACT3 基因与卵巢癌预后相关基于 TCGA数据库卵巢癌组织基因表达及生存数据分析，有 40个基因在卵巢癌组织中差异表达，并与预后相关（图1A），DACT3 表达与卵巢癌患者总生存期（overallsurvival，OS）及无进展生存期（progression free survi原val，PFS）呈负相关（P约0.05）（图 1B）。2.2DACT3 表达是卵巢癌预后的独立危险因素 单因素 COX 回归分析显示，除分期、分级外，DACT3表达、年龄、种族因素与卵巢癌预后相关，具有统计学意义（P约0.05），病理学分期、分级与卵巢癌预后无关（P跃0.05）。多因素 COX 回归分析显示，DACT3 表达是影响卵巢癌预后的独立危险因素（P=0.00051）（图 2）。2.3DACT3 在卵巢癌组织中高表达免疫组化检测显示，正常卵巢组织不表达 DACT3，卵巢癌组织342窑窑交通医学 2023 年第 37 卷第 4 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.4A：TCGA 数据库中与卵巢癌预后相关的差异基因；B：基于 TCGA 数据库分析 DACT3 与卵巢癌患者预后（左图为 OS，右图为PFS）相关性。图 1DACT3 与卵巢癌患者预后相关图 2COX 回归分析影响卵巢癌预后的因素图 3免疫组化显示 DACT3 在卵巢癌组织中高表达临床病理特征DACT3P值低表达高表达年龄（岁）臆6016170.13860819分化程度低级别13200.004高级别225FIGO 分期 I耀II22110.045III耀IV1116表 1DACT3 表达与卵巢癌临床病理特征相关性分析例A：Western blot 验证转染效率；B：细胞划痕实验检测转染 0 h（上）、24 h（下）细胞迁移能力；C：细胞迁移能力定量分析。图 5DACT3 对细胞迁移能力的影响表达 DACT3，高级别卵巢癌组织中 DACT3 表达较低级别卵巢癌更强。DACT3 在癌细胞核浆中均有表达，核内表达强于胞浆（图 3）。2.4DACT3 表达与卵巢癌临床病理特征相关性分析60 例卵巢癌中 DACT3 表达与肿瘤分化程度及FIGO 分期有关（P约0.05）（表 1）。Kaplan-Meier 生存曲线分析显示，DACT3 表达与患者 OS 显著负相关（P=0.001，图 4）。2.5DACT3 对 SKOV3 细胞迁移能力的影响West原ern blot 验证细胞的转染效率，sh-DACT3 组 DACT3表达显著抑制（图 5A）。细胞划痕实验显示，干扰DACT3 表达后 SKOV3 细胞迁移能力显著减弱（P0.001，图5B-C）。200伊400伊低级别高级别正常组织ABCDACT3GAPDH65 kDa36 kDaNCsh-DACT3NCSKOV350403020100*TCGA-OSABTCGA-PFST-NDACT3409190994082253464High exp（N=187）Low exp（N=187）High exp（N=187）Low exp（N=187）1.00.80.60.40.20.01.00.80.60.40.20.0OSPFS051015051015log-rank P=0.021HR=1.36（95%CI，1.051.76）log-rank P=0.024HR=1.32（95%CI，1.041.67）DACT3DACT3图 4DACT3 与卵巢癌患者生存期生存时间（月）0.0020.0040.0060.0080.001.00.80.60.40.20.0DACT3 低表达DACT3 高表达P=0.001sh-DACT3343窑窑交通医学 2023 年第 37 卷第 4 期 Med J of Communications,2023,Vol.37,No.43讨论卵巢癌居妇科肿瘤死亡率首位4，发病机制目前并不十分明确，有研究表明产次、服用避孕药和结扎输卵管是卵巢癌的保护因素，年龄、乳腺癌病史及家族史是卵巢癌的危险因素，环境因素及生活方式对患病率无明显影响5。75%卵巢癌患者初次诊断时已处第三期或第四期，癌细胞已扩散至盆外，无法从单纯的手术中获益6-7。随着治疗方案的进步，目前卵巢癌 5 年生存率提升至 47%左右，但增长幅度仅 2%4%4，8。因此，研究卵巢癌新的分子标志物用以诊断、判定预后和治疗靶点具有重要意义。DACT3 属于 DACT 家族，在多种肿瘤中表达失衡9。乳腺癌中乳腺丝氨酸酶抑制剂（mammary ser原ine protease inhibitor，MASPIN）会引起 DACT3 的高表达；食管鳞状细胞癌中 DACT3 的下调促进细胞自噬和提高肿瘤的恶性程度；此外，DACT3 表达还可能影响甲状腺乳头状癌、结直肠癌的恶性程度10-12。在卵巢癌中 EZH2 引起 DACT3 高表达，其机制还不十分明确3。本研究从 TCGA 及 GTEx 数据库下载有关卵巢癌组织及正常组织基因测序及患者临床数据，发现DACT3 高表达患者的 OS 和 PFS 较短（P约0.05）；单因素、多因素 COX 回归分析显示，DACT3 表达可以作为影响卵巢癌预后的独立危险因素（P=0.00051）。对 60 例临床卵巢癌患者病理特征及随访资料进行分析，发现 DACT3 表达与 FIGO 分期及肿瘤分化程度相关，DACT3 高表达患者预后差，OS 较短。免疫组化检测显示，正常卵巢组织中 DACT3 不表达，卵巢癌组织中 DACT3 高表达，高级别卵巢癌组织中DACT3 表达较低级别卵巢癌更强，提示 DACT3 可能具有促进肿瘤恶性程度的潜力。细胞划痕实验显示，干扰 DACT3 表达后人卵巢癌腺癌细胞株SKOV3 迁移能力显著减弱，提示 DACT3 可能与卵巢癌的侵袭、转移有一定关系。综上所述，DACT3 在卵巢癌中高表达，是影响卵巢癌预后的独立危险因素，有可能作为卵巢癌患者的预后指标和分子治疗的靶标。参考文献1 SUNG H，FERLAY J，SIEGEL R L，et al.Global CancerStatistics 2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence andMortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries J.CACancer J Clin，2021，71（3）：209-249.2 REID B M，PERMUTH J B，SELLERS T A.Epidemiology ofovarian cancer：a review J.Cancer Biol Med，2017，14（1）：9-32.3 LI H，BITLER B G，VATHIPADIEKAL V，et al.ALDH1A1is a novel EZH2 target gene in epithelial ovarian cancer i原dentified by genome-wide approaches J.Cancer Prev Res（Phila），2012，5（3）：484-491.4 SIEGEL R L，MILLER K D，JEMAL A.Cancer statistics，2018 J.CA Cancer J Clin，2018，68（1）：7-30.5 LUKANOVA A，KAAKS R.Endogenous hormones and ovar原ian cancer：epidemiology and current 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