HPLC方法开发——流动相的选择.ppt

HPLC方法开发方法开发 流动相的流动相的选择选择1.流动相的一般要求流动相的一般要求 n n流动相对样品具有一定的溶解能力流动相对样品具有一定的溶解能力 n n流动相具有一定惰性流动相具有一定惰性 n n流动相应不改变填料的任何性质流动相应不改变填料的任何性质 n n纯度高纯度高 n n流动相的黏度要尽量小流动相的黏度要尽量小 n n流动相的物化性质要与使用的检测器相适应流动相的物化性质要与使用的检测器相适应 n n流动相沸点不要太低流动相沸点不要太低 n n应选用挥发性溶剂应选用挥发性溶剂 n n流动相配置好后要进行过滤流动相配置好后要进行过滤 n n流动相配制好后要进行脱气流动相配制好后要进行脱气 2.常用溶剂的重要性质常用溶剂的重要性质 n n极性n n黏度n n沸点n n紫外截止波长常用溶剂参数表SolventPolarityViscosity(cp20)Boiling Point()UV CutOff(nm)Hexane(正己烷)0.06 0.33 69210Carbontetrachloride(四氯化碳)1.60 0.97 77265Toluene(甲苯)2.40 0.59 111285Benzene(苯)3.00 0.65 80210Methylenechloride(二氯甲烷)3.40 0.44 40245n-propanol(异丙醇)4.00 2.27 98210Tetrahydrofuran(四氢呋喃)4.20 0.55 66220Ethanol(乙醇)4.30 1.20 79210Chloroform(氯仿)4.40 0.57 61245Acetone(丙酮)5.40 0.32 57330Acetonitrile(乙腈)6.20 0.37 82190Dimethylformamide(二甲基甲酰胺)6.40 0.92 153270Methanol(甲醇)6.60 0.60 65205Ethyleneglycol(乙二醇)6.90 19.90 197210Dimethylsulfoxide(二甲亚砜)7.20 2.24 189260Water1020 1.00 1002103.过滤过滤 n n溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。n n色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。易堵塞。n n仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损杆和活塞的磨损。4.脱气脱气n n氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。n n超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡波振荡10-15min10-15min。n n在线真空脱气法：在线真空脱气法：Agilent1100LCAgilent1100LC真空脱机利用真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气。膜渗透技术，在线脱气。5.溶剂过滤器的防护溶剂过滤器的防护n n溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液。以下几种而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。（1 1）严格执行溶剂过滤）严格执行溶剂过滤 （2 2）勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液）勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液 （3 3）避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶）避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。n n堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在浓硝酸堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在浓硝酸（35%35%）中浸泡）中浸泡1h1h，然后用蒸馏水冲洗干净。，然后用蒸馏水冲洗干净。6流动相的贮存流动相的贮存n n流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯容器内流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯容器内，不，不要贮存在塑料容器中。要贮存在塑料容器中。n n贮存容器一定要盖严贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧及尘埃溶入流动相。化，也防止氧及尘埃溶入流动相。n n磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存制使用，不要贮存超过规定的有效期。超过规定的有效期。n n容器应定期清洗容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。微生物。7HPLC实验用水实验用水n nHPLCHPLC实验用水除满足药典对纯化水实验用水除满足药典对纯化水 一般要求外，还需要满足以下要求：一般要求外，还需要满足以下要求：项目指标电阻率，Mcm，25，最小18.0总有机碳（TOC)，mg/L，最大0.5微粒，m滤器0.22 HPLC级水增加紫外加吸收要求：在1cm池中，用HPLC级水作空白，在190nm、200nm和250400nm的吸收度分别不得过0.01、0.01和0.05。8.等度洗脱等度洗脱 n n在反相色谱中，极性越强的溶剂洗脱能力越弱。在反相色谱中，极性越强的溶剂洗脱能力越弱。n n等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，组分极性有一定差别定，适合于组分数目较少，组分极性有一定差别的样品，多用于含量测定。的样品，多用于含量测定。n n优点：基线平稳，保留时间重现性好，对流动相优点：基线平稳，保留时间重现性好，对流动相纯度要求低。纯度要求低。n n缺点：较早洗脱出的色谱峰时分离度差，较晚洗缺点：较早洗脱出的色谱峰时分离度差，较晚洗脱出的色谱峰展宽理论塔板数低。脱出的色谱峰展宽理论塔板数低。9.梯度洗脱梯度洗脱 n n梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和组成，如溶剂的极性、离子强度和pHpH值等，用于值等，用于分析组分数目多样品。分析组分数目多样品。优点：缩短分析时间 提高分离度 改善峰形 提高检测灵敏度缺点：增加基线漂移 较长平衡时间 9.梯度洗脱梯度洗脱 在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视：n n要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。的流动相。n n梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高 n n混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化现压力的变化 。要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。液泵或色谱柱能承受的最大压力。n n每次梯度洗脱之后必须每次梯度洗脱之后必须10301030倍柱容积的初始流动相流倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使其恢复到初始状态。经色谱柱，使其恢复到初始状态。10流动相的流动相的pH值值 反相离子抑制技术：反相离子抑制技术：采用反相色谱法分离弱酸或弱碱样品时，采用反相色谱法分离弱酸或弱碱样品时，通过调节流动相的通过调节流动相的pHpH值，以抑制样品组分的解离，值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术。增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术。n n对于弱酸，流动相的对于弱酸，流动相的pHpH值越小，组分的解离平衡常数值越小，组分的解离平衡常数KaKa值越小，当值越小，当pHpH值远远小于弱酸的值远远小于弱酸的pKapKa值时，弱酸主要以分值时，弱酸主要以分子形式存在；子形式存在；n n对弱碱，流动相的对弱碱，流动相的pHpH值越大，组分的值越大，组分的KaKa值越大，当值越大，当pHpH值值远远大于弱碱的远远大于弱碱的pKapKa值时，弱碱主要以分子形式存在；值时，弱碱主要以分子形式存在；n n分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用101050mmol/L50mmol/L磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，0.05%TFA 0.05%TFA；n n分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用10mmol/L10mmol/L三乙胺溶液，三乙胺溶液，0.050.5%NH4OH0.050.5%NH4OH。10流动相的流动相的pH值值n n当溶液当溶液pHpH值等于化合物的值等于化合物的pKapKa时，化合物半解离。时，化合物半解离。n n在在pKa1.5pKa1.5的范围内，保留随的范围内，保留随pHpH值的变化而发生明显变值的变化而发生明显变化。化。n n超过此超过此pHpH值范围，化合物完全解离或不解离，保留随值范围，化合物完全解离或不解离，保留随pHpH值的变化很小。值的变化很小。n n了解化合物的了解化合物的pKapKa值，可在值，可在pKa2pKa2的范围外调节流动相的的范围外调节流动相的pHpH值，使化合物有较好的峰形，保持保留的恒定，使建值，使化合物有较好的峰形，保持保留的恒定，使建立的方法具有耐用性。立的方法具有耐用性。10流动相的流动相的pH值值11.缓冲盐缓冲盐n nHPLCHPLC用缓冲盐时用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现象现象,析出的细小盐粒非常坚硬析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产生划痕容易产生划痕,并磨损密封并磨损密封垫垫,造成漏液等故障现象。造成漏液等故障现象。n n在线在线Seal-washSeal-wash选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。选项能有效的带走可能存在的缓冲盐结晶。n n清洗液配制清洗液配制:90%:90%水水+10%+10%异丙醇异丙醇.该混合液可抑制菌类该混合液可抑制菌类生长和减小水的表面张力。生长和减小水的表面张力。n n当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶当盐溶液与有机溶剂溶液混合时，盐溶液能与有机溶剂溶液完全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点，液完全混溶，而不会出现沉淀。但是在比例阀的混合点，重力作用使盐颗粒沉淀下来，因此此时应该在进液口位于重力作用使盐颗粒沉淀下来，因此此时应该在进液口位于混合器下方放置含盐流动相进液口位于混合器上方放置不混合器下方放置含盐流动相进液口位于混合器上方放置不含盐流动相；含盐流动相；11.缓冲盐缓冲盐缓冲剂缓冲剂pKa缓冲范围缓冲范围UV截止波截止波长nm磷酸盐2.11.1-3.1200(0.1%)7.26.2-8.212.311.3-13.3柠檬酸盐3.12.1-6.4230(10mM)4.75.4甲酸盐3.82.8-4.8210(10mM)乙酸盐4.83.8-5.8210(10mM)氨水9.28.2-10.2200(10mM)三乙胺1110.0-12.0200(10mM)12.离子对试剂离子对试剂n n作用原理：作用原理：离子对试剂与待分析的物质（多为在溶液状态离子对试剂与待分析的物质（多为在溶液状态时显以与离子对试剂相反的电荷）结合成离子对而呈中性，时显以与离子对试剂相反的电荷）结合成离子对而呈中性，这样非极性就表现出来，从而在色谱柱上有保留行为。这样非极性就表现出来从而在色谱柱上有保留行为。n n试剂选择：分析试剂选择：分析酸性酸性（作用基团）（作用基团）样品样品一般一般用用阳阳离子对试离子对试剂剂（四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵四丁基溴化铵、四丁基硫酸氢铵），分析碱性样品，分析碱性样品用用阴阴离子对试剂离子对试剂（己烷磺酸钠己烷磺酸钠、辛、辛烷磺酸钠烷磺酸钠十二烷基十二烷基磺酸钠磺酸钠）n n离子对的分离机制离子对的分离机制-离子对模型离子对模型 样品离子首先在流动相中与离子对试剂的反离子生成不样品离子首先在流动相中与离子对试剂的反离子生成不荷电的疏水性离子对，然后溶解或吸附于非极性固定相上。荷电的疏水性离子对，然后溶解或吸附于非极性固定相上。离子对试剂的烷基离子对试剂的烷基C C链越长，生成的离子对与固定相的亲链越长，生成的离子对与固定相的亲和力越大，因此组分的保留值也越大。和力越大，因此组分的保留值也越大。n n 使用使用离子对离子对试剂试剂浓度尽可能的低浓度尽可能的低（一般（一般0.005mol/L)0.005mol/L)，以以 保证对柱子填料的稳定性影响最小及清洗方便。保证对柱子填料的稳定性影响最小及清洗方便。12.离子对试剂离子对试剂离子对试剂离子对试剂使用使用注意的因素有注意的因素有：n n1 1、离子对的浓度，这个一般情况下在满足要求的前提下离子对的浓度，这个一般情况下在满足要求的前提下 越低越好越低越好。n n2 2、离子对离子对溶液溶液的的pHpH，这个是进行分离的最关键的因素，这个是进行分离的最关键的因素，而只能在缓冲液中测定而只能在缓冲液中测定pH,pH,不要混合不要混合有机相后有机相后测定测定。n n3 3、如果使用离子对试剂，一定注意平衡时间，正常的话如果使用离子对试剂，一定注意平衡时间，正常的话在在60-9060-90分钟才能达到彻底的平衡，还有在实验结束以后分钟才能达到彻底的平衡，还有在实验结束以后要冲洗超过要冲洗超过2 2个小时个小时，否则，否则柱子柱子可能可能会不可逆的损伤。会不可逆的损伤。n n4 4、用离子对用离子对进行进行实验所用的柱子实验所用的柱子尽量尽量和其他的非离子对和其他的非离子对的分开的分开使用。使用。13.各种检测器对流动相的特殊要求各种检测器对流动相的特殊要求 13.1 UV：n n截止波长截止波长:将溶剂装入将溶剂装入1cm1cm的比色皿，以空气为参比，逐的比色皿，以空气为参比，逐渐降低入射波长，溶剂的吸光度渐降低入射波长，溶剂的吸光度A A1 1时的波长。时的波长。n n中国药典对中国药典对UVUV法溶剂的要求是：法溶剂的要求是：以空气为空白，溶剂和吸收池的吸收度：以空气为空白，溶剂和吸收池的吸收度：在在220240nm220240nm范围内不得超过范围内不得超过0.400.40 在在241250nm241250nm范围内不得过范围内不得过0.200.20 在在251300nm251300nm范围内不得过范围内不得过0.100.10 在在300nm300nm以上不得过以上不得过0.050.0513.各种检测器对流动相的特殊要求各种检测器对流动相的特殊要求13.2 ELSDn nELSD对流动相的组成不敏感，可以用于梯度洗脱；n nELSD要求流动相要蒸发掉，因此不能使用不易挥发的物质来调节流动相的pH值。13.各种检测器对流动相的特殊要求各种检测器对流动相的特殊要求13.3 MSDn n由于盐对质谱的损伤很大，故在流动相的选择上，由于盐对质谱的损伤很大，故在流动相的选择上，需避需避需避需避免使用不可挥发性盐，尽量少使用可挥发性盐免使用不可挥发性盐，尽量少使用可挥发性盐免使用不可挥发性盐，尽量少使用可挥发性盐免使用不可挥发性盐，尽量少使用可挥发性盐。故一般。故一般离子对色谱和离子抑止色谱方法的流动相是不能直接用离子对色谱和离子抑止色谱方法的流动相是不能直接用到液质上的。到液质上的。n n对于对于ESIESI（电喷雾电离），需要考虑基质效应：（电喷雾电离），需要考虑基质效应：对于正离子模式的方法，流动相的对于正离子模式的方法，流动相的pHpH最好小于最好小于5.05.0，以，以提高离子化效率，通常在流动相中添加提高离子化效率，通常在流动相中添加TFA,FATFA,FA。对于负离子模式，对于负离子模式，pHpH最好大于最好大于8.08.0，通常在流动相中添，通常在流动相中添加氨水。加氨水。Thank You!