23株临床分离单核细胞增生李斯特菌菌株的分子特征.pdf

：研究生园地 株临床分离单核细胞增生李斯特菌菌株的分子特征廖希玮，高硕，张燕，纪静茹，沈瀚，周万青，吴超，（南京医科大学鼓楼临床医学院，南京；南京大学医学院附属鼓楼医院 检验科，感染性疾病科，南京）摘要：目的 分析 株临床分离单核细胞增生李斯特菌菌株的分子特征。方法 收集 年 月至 年 月南京鼓楼医院临床分离的 株单核细胞增生李斯特菌，通过全基因组测序技术分析菌株毒力基因、耐药基因、谱系、序列分析（）、克隆群（）；采用多重 进行血清分型；采用 试验和纸片扩散法检测菌株药物敏感性。结果 株菌株分属 个谱系，以谱系为主，共 株（）；分为 个 分型，其中 为优势 型，占；分为 个（、和），优势 型为，共 株（）；所有分离株均携带李斯特菌毒力岛（、和）和、基因；株菌株均检出 耐药基因，其中 株同时携带（）和 耐药基因；血清群分为、及，以 为主，共 株（）；所有菌株对青霉素、氨苄西林、美罗培南和万古霉素等 种抗菌药物敏感，仅 株对复方新诺明和四环素耐药菌株。结论 临床分离单核细胞增生李斯特菌耐药性较低，并具有遗传多样性，携带多种毒力基因是其致病性重要因素。关键词：单核细胞增生李斯特菌；全基因组测序；血清型；毒力因子中图分类号：文献标志码：，（，；，）：，（）（），（），（，）（）（，），（），（），：；单核细胞增生李斯特菌（，）是一种在自然界普遍存在的革兰阳性兼性胞内寄生菌，该菌对外界环境抵抗力强，可在冷藏条件下生存增殖。可经被污染的食物传播导致人畜共患病，造成新生儿、老年人及孕妇等免疫低下人群严重感染后果，例如脑膜炎、败血症、流产临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，基金项目：南京大学中国医院改革发展研究院课题；南京鼓楼医院医学发展医疗救助基金会资助项目（）。作者简介：廖希玮，年生，女，硕士研究生，主要从事感染性疾病研究。通信作者：周万青，副主任技师，博士，：；吴超，教授，：。及死胎等。监测数据显示，在食源性疾病中李斯特菌病的病死率最高，可达，且发病率正不断增加，逐渐引起公众的重视。年，我国建立食源性疾病监测计划，而对于李斯特菌病监测则是自 年开始在部分省份纳入监测计划。目前我国尚缺乏有关李斯特菌病的多中心、纵向和全国性流行病学研究，关于李斯特菌病发生的整体信息尚不完整。本研究对 株临床分离 进行菌株药物敏感性检测、血清分型并基于全基因组测序技术分析菌株的毒力基因、耐药基因、型以及 型分布情况以丰富临床分离菌株分子特征，并为李斯特菌病流行病学研究提供数据。材料与方法 菌株来源从 年 月至 年 月南京大学医学院附属鼓楼医院妇产科、心胸外科及感染科等多个科室收治的临床确诊为 感染住院患者临床样本中分离 菌株 株。女 例，男 例，年龄 岁。其中，血液样本 株、脑脊液样 本 株、分 泌 物 样 本 株。采 用 全自动细菌鉴定药敏系统及配套 鉴定卡对分离菌株进行鉴定，并经 质谱复核。以金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌 为药敏试验质控菌株，上述菌株均为南京大学医学院附属鼓楼医院检验科微生物实验室保存菌株。主要仪器与试剂 全自动细菌鉴定药敏系统、血培养仪、鉴定卡、药敏卡、培养瓶（法国梅里埃公司），型 孵箱、荧光分光光度计、平板、药敏纸片、哥伦比亚血琼脂平板（美国 公司），扩增仪（美国 公司），型凝胶成像系统（上海天能公司），测序系统（美国 公司），小型高速离心机（公司）。平板、试验试剂（郑州安图公司），、（苏州近岸蛋白质科技公司），琼 脂 糖 凝 胶（西 班 牙公司），、磁珠法细菌基因组提取试剂盒（上海生工生物工程公司）。菌株药敏试验分别采用 试验和纸片扩散法检测 药物敏感性。其中青霉素、氨苄西林、美罗培南和红霉素采用 试验，复方磺胺甲噁唑、四环素、克林霉素、万古霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、利奈唑胺、头孢曲松及庆大霉素采用纸片扩散法。参照美国临床和实验室标准协会（，）单核细胞增生李斯特菌最低抑菌浓度折点和 中葡萄球菌属的抑菌圈直径折点进行结果判读。分别采用肺炎链球菌 和金黄色葡萄球菌 作为药敏试验质控菌株。全基因组测序采用磁珠法提取细菌总，具体操作按照试剂盒说明书进行。所提取 纯度经 荧光分光光度计测定吸光度（）比值在 之间，并置于 保存。委托上海生工生物公司进行全基因组测序。使用 测序系统进行全基因组测序。提取核酸经琼脂糖凝胶电泳及浓度检测合格后进入文库构建，对样本 进行双向测序（，）构建 文库；对测序结果进行质量剪切后，用 软件（：）将序列进行拼接，以得到最优化组装结果。采用 （）工具（：）进行基因组注释。采用 软件进行菌株进化树分析。获得的基因测序组装结果提交至国家生物信息中心（，），得到序列号（，）。毒力基因和耐药基因检测使用 （：；于 年 月 日访问）的“毒力”工具检测所选菌株基因组中的毒力基因。根据基因存在与否，使用 的 矩阵可视化和分析软件生成热图（：；于 年 月 日访问）。采用 检索耐药基因携带情况（：；于 年 月 日访问），核苷酸最小一致性设定为，最小覆盖设定为。谱系、多位点序列分型（，）、克隆群（，）分型和血清分型 菌株的序列分型（，）基于全基因组测序结果，利用 网站（：）分析获得。实验菌株的 分型和谱系均基于全基因组测序结果，利用 数据库（：临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，）确定。参照 等方法，采用多重 扩 增 血 清 分 型 相 关 基 因（、）。引物由上海生工生物工程公司合成，见表。反应体系为 ，包括 ，模板 ，上、下游引物（）各 ，。循环参数：；，个循环；。产物经 琼脂糖凝胶电泳分析产物大小及确定菌株血清分型结果。血清分型结果判读：和 均检出为血清分型；和 均检出为血清分型；、和 均检出为血清分型。表 血清分型 扩增引物信息基因引物序列（）产物大小（）：结果 药敏结果 株 对青霉素、氨苄西林、美罗培南、红霉素、万古霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、利奈唑胺及庆大霉素均敏感，对克林霉素、头孢曲松均耐药，对四环素和复方磺胺甲噁唑敏感率均为（对此 种药物耐药）。其中青霉素和 值分别为 和 ，氨苄西林 和 值均为 ，美罗培南 和 值均为 ，克林霉素和 值均为 。毒力基因和耐药基因结果 株 中共检出 个不同的毒力基因。个分离株有 个毒力基因。所有菌株均携带的主要毒力基因包括、，内化素基因、以及应激调控基因。除 和 外，其余菌株均检出、。仅 株检出 基因（、）；株检出；株缺乏；株存在内蛋白基因、。见图。采用 数据库检索耐药基因携带情况，发现 株菌株均检出 耐药基因，其中 同时携带（）和 耐药基因，基因定位预测分析发现，上述耐药基因均存在于菌株染色体上。注：红色，基因存在；蓝色，基因不存在。图 毒力基因热图 谱系、型、型及血清型分布 株 分属于 个谱系（和），以谱系为主，共 株（）；分为 个 型，分别为 型 株（）、型、型和 型各 株（各），型 株（），型、和 临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，型各 株（各）；分为 个 型，包括、和，优势 型为，共占（株）。见表。表 谱系、分型谱系 型 型菌株数 占比（）经多重 扩增及电泳分析显示，株 被分成 种血清型，包括、及，分别为 株（）、株（）和 株（）。部分菌株电泳结果见图。注：，；，。图 部分菌株血清分型电泳图谱 菌株进化树分析采用 软件对 株 菌株进行进化树分析，可见 株 菌株基因组进化上分为 个主要分支。见图。讨论 本研究中 株 对氨苄西林、青霉素、美罗培南以及万古霉素均敏感，与其他报道相一致。因此，临床疑似 感染患者可经验性使用氨苄西林和青霉素，亦可根据药敏试验结果调整治疗药物或升级抗生素为美罗培南或万古霉素。本次药敏试验检出 株同时对四环素和复方磺胺甲噁唑耐药菌株（耐药率为），经全基因组测序证实耐药表型分别由（）和 基因介导，提示本院临床分离 耐药率较低，与其他地区报道不同，可能与地域性差异或与研究菌株来源不同有关。图 菌株基因组进化树图谱 根据基因组系统进化，可分为 个谱系。其中谱系 与 临床感染相关，而谱系多与食品污染密切相关。本次调查结果显示，株临床分离 分 为 谱 系（、和）和谱系 （和），其中以谱系为主（株，），表明谱系 也可能是临床主要流行型别。目前全球流行 的 型包括、和，国内多见（）。本研究结果以（）型菌株最多，与报道一致；其他分型包括 （）、（、）、（）、（）、（）和（）等在本院亦有检出，与其他国家或地区分布有所不同，提示临床分离 的 型及 型具有多样性及地区分布差异性。株 分属、和 种血清型，其中 型占比最高（占），其次为（占），与国内多地报道相符，但与国外血清型分布存在一定差异，体现出 的遗传差异性。虽然 型菌株数占比最高，但分离菌株的患者之间缺乏暴发证据，相似的结论与意大利一项研究相同，表明 血清型为散发病例常见的血清型。有文献表明 和 毒力基因分别与 入侵宿主肠上皮细胞和肝细胞有关；基因（包括、和）与黏附侵入细胞、在宿主细胞胞浆中运动以及逃逸宿主细胞吞噬等侵袭能力密切相关。本研究中的 分离株全部携带、和，与文献报道一致，说明菌株能够更好适应宿主环境并且具有临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，较强的致病潜力。由 和 基因编码的内化蛋白 和 均与肠道感染相关，编码 细胞外蛋白，与 在细胞内运动和细胞间扩散有关。本研究中所有菌株均检出上述 种基因，而从各种食品和环境分离的菌株亦携带上述基因。因此，食用被此类菌株污染的食品可能是人类患李斯特菌病的重要风险因素。耐药基因的发现有助于指导临床抗菌药物的选择，本研究中所有菌株均携带 耐药基因，与既往文献相符，其介导磷霉素耐药，故而对于 感染患者不建议使用磷霉素治疗。本研究通过对临床分离 菌株血清分型以及基于全基因组测序技术的毒力因子、耐药基因、型及 型分布进行分析，丰富了临床分离 分子特征的多样性，亦为临床防治 感染及其分子流行病学研究提供了重要基础数据。但由于样本量局限性，本研究未能明确 分离株相关毒力基因和耐药基因与分型之间的关系，后续将加大样本量进一步探究。参考文献，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：侯配斌，陈玉贞，李心朋，等 年山东省食品中单核细胞增生李斯特菌的血清型、耐药性及分子分型分析 中华疾病控制杂志，（）：王筱，王闻卿，丁锦，等 年 年上海市浦东新区单核细胞增生李斯特菌分子流行特征分析 中国卫生检验杂志，（）：，（）：，：程晨，孔子艳，孙闯，等 株单核细胞增生李斯特菌分子特征分析 临床检验杂志，（）：沈伟伟，裘丹红，盛莹，等 台州市食源性单核细胞增生李斯特菌分子特征研究 中国食品卫生杂志，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：炊慧霞，李薇薇，崔箐坡，等 河南省 至 年李斯特菌病分子流行病学特征 郑州大学学报（医学版），（）：（收稿日期：）（本文编辑：许晓蒙）临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，