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利用SRAP分子标记分析种质资源
1 SRAP分子标记
相关序列扩增多态性（SRAP）是由美国加州大学Li和Quiros于2001年发展的一种基于PCR反应的新型标记。该技术是基于正向和反向引物对模板DNA的PCR扩增，引物具有3个明显不同的序列框(motif)：5’端存在的10-11个随机碱基序列，紧跟着CCGG（正向引物）或AATT（反向引物）的碱基序列，最后是位于3’端的3个选择性碱基。从技术的可操作性来看，每个引物5’端的10个随机碱基序列可以促进任意序列的扩增，即类似于RAPD标记的结果。正向引物的CCGG序列可以优先与具有丰富GC碱基的外显子序列退火结合，而反向引物的AATT序列可优先与具有丰富AT碱基的内含子和启动子序列退火结合，引物3’端的3个选择性碱基可以对模板DNA进行选择。SRAP标记自开发以来，已在多种植物的遗传多样性分析、指纹图谱构建和物种亲缘关系分析研究等领域得到广泛应用。该标记具有操作简便、快速，多态性丰富，重复性好，不需预知物种序列信息以及成本较低等优点，具有RAPD简单快捷之优点，同时还具有AFIP的稳定性和多态性，是简单又经济、有效又可靠的分子标记系统。

2.1 材料和试剂
2.1.1 材料
从各种中各随机选取5-15株个体采集叶片用于提取基因组DNA。
2.1.2 仪器与试剂
研钵、冷冻高速离心机、水浴锅、紫外分光光度计、电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统、PCR仪
液氮、离心管（1.5 mL、10mL）、PCR管、烧杯、容量瓶、试剂瓶、量筒
氯化钠、EDTA二钠盐、醋酸钠、Tris、CTAB、盐酸、β-巯基乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇、冰醋酸、无水乙醇、PCR试剂、琼脂糖
（1）2×CTAB提取液配制
2×CTAB提取液配制
2×CTAB提取液终浓度
母液
5ml
10ml
15ml
20ml
1.4 mM NaCl
5M NaCl
1.4
2.8
4.2
5.6
20 mM EDTA
0.5M EDTA
0.2
0.4
0.6
0.8
100 mM Tris-HCl (pH8.0)
1M Tris-HCL, pH 8.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2% (w/v) CTAB
10% (w/v) CTAB
1.0
2.0
3.0
4.0
0.2% (v/v) β-mercaptoethanol
β-mercaptoethanol
0.01
0.02
0.03
0.04
H2O
H2O
1.89
3.78
5.67
7.56
（2）5 M NaCl
（3）0.5 M EDTA-Na2（pH 8.0）
（4）1M Tris-HCL（pH 8.0）
（5）10% (w/v)CTAB
（6）0.2% (v/v) β-mercaptoethanol
（7）氯仿、异戊醇混合液（24:1）
（8）3M NaAc
（9）TE：10mM Tris-HCl，1mM EDTA, pH7.4
（10）50×TAE电泳缓冲液（1L）：
Tris 242g
冰醋酸 57.1 ml
0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 100 ml
工作液为1×TAE（40 mmol/L Tris-HAc, 1 mmol/L EDTA）

2.2 基因组DNA的提取(CTAB法)和检测
采用改良CTAB法提取基因组DNA，具体步骤如下：
（1）取干燥叶片0.1 g左右于研钵中，加液氮研磨成粉末，待液氮挥发完毕，将粉末迅速转移至离心管中；
（2）加入65 °C预热的3 mL 2×CTAB提取液，65 ºC水浴30 min，期间稍加混匀；
（3）加入等体积氯仿、异戊醇混合液（24:1，4 mL），摇匀静止3 min后室温离心10 min（10000 r·min-1）；
（4）取上清液转移至新的离心管，用0.8 V冷异丙醇（或2V预冷的无水乙醇）/ 0.1V 3M NaAc沉淀DNA，-20℃下放置30 min以上；
（5）4 °C离心15 min（12000 r·min-1）；
（6）弃上清，沉淀用70%预冷乙醇洗涤两次，自然风干，加适量TE溶解；
（7）加RNase A至终浓度10 µg/ml，37 ºC消化30 min；
（8）加等体积氯仿、异戊醇混合液（24:1），翻转充分摇匀，室温离心10 min（12000 r·min-1）；
（13）取上清液转移至1.5 mL离心管，加入.8 V冷异丙醇（或2V预冷的无水乙醇）/ 0.1V 3M NaAc沉淀DNA，轻轻翻转摇匀，-20 °C冰箱过夜；
（14）4 °C离心15 min（12000 r·min-1），弃上清，70%预冷乙醇洗涤沉淀两次，无水乙醇洗涤一次，并自然风干；
（15）加入100 μl TE 溶液，冷冻备用。
基因组DNA浓度检测
用紫外分光光度计（日本岛津UV-2401PC）测定260 nm/280 nm处的光吸收值，根据A260/A280确定DNA的纯度，根据260nm处的光吸收值估测样品DNA的浓度；用1.0%琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的纯度和浓度来检测其纯度和浓度，根据电泳条带的整齐度、点样孔中荧光的有无估计DNA的纯度，根据条带的亮度估测DNA的浓度。
2.3 PCR反应体系及程序
用于PCR扩增的DNA模板的浓度稀释至20 ng/µl，用于SRAP分析。
在0.2ml RCR管内配置20ul反应体系
H2O 12.4 µl
10× PCR Buffer 2.0 µl
50× dNTP Mix (10 mM each) 0.4 µl （0.2 mM each）
PCR Primer 1 (10 µM) 1.0 µl （0.5 µM）
PCR Primer 1 (10 µM) 1.0 µl （0.5 µM）
DNA Template (~10 ng/µl) 3.0 µl （30 ng）
Taq DNA Polymerase（10U/µl） 0.2 µl （2 U）
Final volume 20.0 µl
Mg2+浓度为2.0mM，混匀后略为离心，将内容物收集到管底。
按照以下程序执行PCR反应。
• 94°C 1 min
• 5 cycles: 94°C 1 min
33°C 1 min
72°C 1 min
• 35 cycles: 94°C 1 min
55°C 1 min
72°C 1 min
• 72°C 7 min
• 4°C 保温
反应结束后取 5 µl 在1.1% agarose/EtBr 胶 1× TAE 中电泳，，用DL2000作为标准相对分子量对照。
2.4 引物筛选试验
随机挑选1个DNA样品，参照2.3的原始反应体系进行引物初步筛选。SRAP引物见表1和表2，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，从正向引物和反向引物随机组合中，筛选出适于金银花遗传分析的引物8对，并从中中选取条带适中且清晰的引物组合，进行SRAP-PCR反应体系优化实验。
表1 SRAP正向引物及其序列
引物代号
Primer code
序列（5’-3’）
Sequence(5’-3’)
引物代号
Primer code
序列（5’-3’）
Sequence(5’-3’)
Me1
TGAGTCCAAACCGGATA
Me6
TGAGTCCAAACCGGTAA
Me2
TGAGTCCAAACCGGAGC
Me7
TGAGTCCAAACCGGTCC
Me3
TGAGTCCAAACCGGAAT
Me8
TGAGTCCAAACCGGTGC
Me4
TGAGTCCAAACCGGACC
Me9
TGAGTCCAAACCGGTCA
Me5
TGAGTCCAAACCGGAAG
Me10
TGAGTCCAAACCGGTAG
表2 SRAP反向引物及其序列
引物代号
Primer code
序列（5’-3’）
Sequence（5’-3’）
引物代号
Primer code
序列（5’-3’）
Sequence（5’-3’）
Em1
GACTGCGTACGAATTAAT
Em12
GACTGCGTACGAATTATT
Em2
GACTGCGTACGAATTTGC
Em13
GACTGCGTACGAATTACG
Em3
GACTGCGTACGAATTGAC
Em14
GACTGCGTACGAATTATG
Em4
GACTGCGTACGAATTTGA
Em15
GACTGCGTACGAATTCGG
Em5
GACTGCGTACGAATTAAC
Em16
GACTGCGTACGAATTGAT
Em6
GACTGCGTACGAATTGCA
Em17
GACTGCGTACGAATTAGC
Em7
GACTGCGTACGAATTCAA
Em18
GACTGCGTACGAATTTAG
Em8
GACTGCGTACGAATTCTG
Em19
GACTGCGTACGAATTTCG
Em9
GACTGCGTACGAATTCGA
Em20
GACTGCGTACGAATTGTC
Em10
GACTGCGTACGAATTCAG
Em21
GACTGCGTACGAATTGGT
Em11
GACTGCGTACGAATTCCA
Em22
GACTGCGTACGAATTTCC

2.5 PCR反应体系的优化
为了确定PCR反应中5个因素的最佳水平，采用正交设计L16（45）在 4个水平上进行试验。参与PCR反应的因素水平见表3，L16（45）正交设计方案见表4。
表3 SRAP-PCR反应因素水平
因素
Factors
水平（20µL体系终浓度）
Level（final concentration）
1
2
3
4
Taq酶Taq polymerase（U·20µL-1）
0.5
1.0
1.5
2.0
Mg2+（mM）
0.5
1.0
1.5
2.0
模板DNA Template DNA（ng·20µL-1）
20
40
80
100
dNTPs（mM）
0.1
0.25
0.5
1.0
引物Primer（uM）
0.25
0.5
0.75
1.0

表4 SRAP-PCR反应因素水平L16(45)正交设计
编号
No.
Taq酶
Taq polymerase （U·20µL-1）
Mg2+
（mM）
模板DNA
Template DNA （ng·20µL-1）
dNTPs
（mM）
引物Primer（uM）
1
0.5
0.5
20
0.1
0.25
2
0.5
1
40
0.25
0.5
3
0.5
1.5
80
0.5
0.75
4
0.5
2.0
100
1.0
1.0
5
1.0
0.5
40
0.5
1.0
6
1.0
1
20
1.0
0.75
7
1.0
1.5
100
0.1
0.5
8
1.0
2.0
80
0.25
0.25
9
1.5
0.5
80
1.0
0.5
10
1.5
1
100
0.5
0.25
11
1.5
1.5
20
0.25
1.0
12
1.5
2.0
40
0.1
0.75
13
2.0
0.5
100
0.25
0.75
14
2.0
1
60
0.1
1.0
15
2.0
1.5
40
1.0
0.25
16
2.0
2.0
20
0.5
0.5

2.6 SRAP--PCR扩增及产物检测
根据筛选的引物对所有样本进行扩增。SRAP标记每条带记录为1个位点，以有带记为“1”，无带记为“0”，形成0/1矩阵。数据统计利用POPGENE version 1.32 和 NTSYS-pc2.1等软件计算：多态带数NP、多态位点百分率PPL；等位基因平均数Na、有效等位基因数Ne；Nei’s基因多样性指数H（gene diversity）；Shannon信息指数I；Nei’s的遗传距离D、遗传一致度，并进行UPGMA（非加权算术平均聚类）分析。应用Nei基因多度法计算遗传分化系数Gst，Gst= Dst /HT，其中Ht= Hs + Dst，HT为总遗传多样性，HS为群体内的遗传多样性，Dst为群体间遗传多样性（Nei，1973）；计算反映基因流强度的群体每代迁移数（Nm），Nm = 0.5（1-Gst）/Gst。