IVF实验室精液处理.doc

IVF实验室精液操作规程

精液样本采集

患者取出精液后，直接交给相关实验室人员，不得由第三人转送。实验室人员应做到：
1. 询问患者夫妻双方姓名并与精液杯上双方姓名核对。
2. 检查精液杯中是否有精液样本，样本是否外泄，颜色是否异常，容器是否破损，容器内是否有明显异物等。如发生异常，应立即询问患者，并采取相应处理措施（如：重新取精）。

上游法分离优选精子
一、精液处理前的准备工作：
1．将精液处理液（HTF/G-IVF）分装至5ml试管内，每份精液样本使用2支小管，分别分装1.5 ml（A管）和2.5 ml（B管）培养液, 放入培养箱预热平衡过。
2．耗材：巴斯德吸管，5ml试管，载玻片，盖玻片，橡胶吸头，无菌镊子。

一、正常精液：密度≧20x106 /ml，活力a+b≥30%的精液样本
1. 将精液置于室温15-20min液化。
2. 将混匀的精液取1滴滴于清洁载玻片上于生物显微镜下观察并纪录精液密度、形态、活力等相关数据。
3. 精液的收集：在巴斯德吸管和含1.5ml培养液的试管（A管）上填好相应的姓名标签，并在其后的每一步操作之前核对姓名。吸取1.5ml精液加入试管中与培养液1:1充分混合，如液化不全可多次吹吸至混匀，500g离心10min。
4. 精液的洗涤：吸弃上清，用一支新的巴斯德吸管从含2.5ml培养液的试管中（B管吸取1.5ml液体加入含精液沉淀的管中。吹吸重悬精液沉淀，400g离心8min。
5. 上游：吸弃上清，将试管B中剩余的1ml培养液吸出，沿含精液沉淀的试管A管壁缓慢加入。两管均贴好标签，将试管A倾斜45°角放于培养箱中静置30min。
6. 分离优质精子：上游结束后，用巴斯德吸管将试管A中的上游液小心吸出，转入试管B中混匀，取一滴滴于一载玻片上，压片镜检。报告上游液中精子密度、活力和形态等相关数据，将分离好的精子置于培养箱中待用。
7. 分离结束后关闭超净台，整理并丢弃相应污物。精液沉淀须保存至移植日，精液杯盖好后置于物品台上，待当日受精结束后丢弃。

二、轻度少弱精：密度5x106 /ml 至20x106 /ml之间，活力a+b:<30%
处理方法与正常精液处理基本一致，但注意在精液收集步骤可采用多管同时收集，并在上游时依据精液情况减少上游培养液的使用。

三、重度少弱精：密度＜5x106 /ml
上游之前的步骤与轻度少弱精的精液处理一致，上游时仅加少量的培养液。如果上游结束之后分离的上游液中未见精子，则将精液沉淀中加入0.2ml培养液混匀使用。

四、逆向射精精液：注意精液取出后应立即处理，1:1加入Earle’s缓冲液中和精液。基本处理方法与少弱精处理方法一致。

密度梯度离心法分离优选精子
原理：Percoll 密度梯度离心法是以二氧化硅胶体外包裹以聚乙烯吡咯烷酮为介质，具有分
离活动精子的作用。目前多采用两层不连续Percoll密度梯度离心法。

一、精液处理前的准备工作：
所需的耗材：巴斯德吸管，5ml及50ml试管，载玻片、盖玻片，无菌橡胶吸头及镊子

1. 提前一天准备好精液处理液，每个患者约4ml,放于培养箱中预热平衡过夜。
2. 分别配制浓度为90%和45%的密度梯度离心液（以SpermGrad（VITROLIFE）为例，采用精液处理液稀释）
3. 在精液处理前吸取1.5ml浓度为90%的密度梯度离心液加于5ml试管底部，再将同体积浓度为45%的密度梯度离心液轻轻置于其上，试管中可见明显的界面分层。

二、精液的分离优选：
1. 核对取精杯上患者姓名等相关信息并在其后的每一步操作之前核对姓名。
2. 将精液置于室温15-20min液化
3. 将混匀的精液取1滴滴于清洁载玻片上于生物显微镜下观察并纪录精液密度、形态、活力等相关数据。
4. 用巴斯德管吸取液化的精液1-1.5ml置于配制好的梯度液上，500 g离心15min。
5. 用巴斯德吸管吸弃离心管上部的精浆和密度梯度液，将底部的精子沉淀转移至新的含有2ml精液处理液的试管中，400g离心8min。
6. 用巴斯德吸管吸上清弃去，加精液处理液0.5-1ml，轻轻吹散精子沉淀，制成精子混悬液备用。同时滴取制备好的精子混悬液于载玻片上，观察并纪录优选后的精子相关数据。
7. 关闭超净台，整理并丢弃相应废液污物。

附睾睾丸穿刺所得精子的处理
所需的耗材：35mm圆皿，1ml注射器，巴斯德吸管，5ml试管，载玻片、盖玻片
提前一天准备精液处理液，每个患者约3ml,放于培养箱中预热平衡过夜。

（一）PESA（附睾穿刺取精术）样本
1. 取一滴附睾穿刺液滴于载玻片，压片后镜检，观察是精子数量、活力、形态，若有活动精子，则将附睾穿刺液收集于浴盆中（含2ml精液处理液的小圆皿），做好标记，置于培养箱中进行短暂培养，待行ICSI前取出进行处理。若全片均无可用精子，则通知医生进行另一侧附睾穿刺或行睾丸穿刺。
2. 行ICSI前，从培养箱中取出浴盆，用巴斯德吸管将浴盆中的所有液体混匀后吸至干净的5ml试管中，300g离心10min，吸弃上清，另用一个巴斯德吸管吸取少量干净培养液，滴加10滴于试管内备用
（二）TESA （睾丸穿刺取精术）样本
1. 将穿刺取出的睾丸组织置于浴盆中，标记姓名，取两支一次性1ml注射器，在体视镜下将睾丸组织撕碎。
2. 于倒置显微镜下镜检，先在10×20倍镜下观察有无精子，是否易找，有无活动精子。再与10×40倍镜下观察并纪录精子形态。 若全皿均无精子则应通知医生进行另一侧睾丸穿刺，报告无精子时应有两人以上共同确认。
3 若有精子，则置于培养箱中进行短暂培养，其后操作步骤同PESA。
选择受精方式
常规授精： 经诊断因女方因素不孕而男方精液正常者且继往无污染等异常IVF助孕史的患者选择常规受精。
经优选后达到常规受精的最低标准为优质精子数20-30条/HPF，密度80-140万/ml。

单精子注射：所有单精子注射的选择应以取卵日患者的精液情况为最终标准。
1. 少弱畸精子症:
1) 重度少精症：即精液中精子密度≤5x106 /ml。
2) 少弱精症：即精液中精子密度为5x106 /ml 至20x106/ml之间，前向运动精子<30%或精子活动率< 40%。
3) 弱精症：即精液中精子密度>20x106/ml, 精子活动率< 5%。
4) 畸精症：目前对于畸精症是否作为明确的ICSI指征尚有争议。出于安全性考虑，在临床治疗应慎重选择ICSI，避免过度使用，对精子有微小异常和畸形的夫妇不应采用ICSI作为常规治疗方案。对于完全不活动或者顶体缺乏（圆头）的精子，必须采用ICSI的方式受精。完全不活动的精子可以通过低渗等途径挑选存活精子进行单精子注射。
除了原始的精液数据外，在IVF治疗中采用何种授精方式也要着重参考精液处理后所获得的总活动精子数。在考虑是否采用ICSI受精时要结合精液密度、活力、形态和相关功能检查及女方生育史，IVF史等因素综合考虑，尽量严格把握ICSI指征，如果能够采用常规IVF方式，不应该扩大ICSI指征。
2．既往IVF受精失败史或IVF低受精率史 (正常受精率<20%)
常规IVF受精失败的原因有多种，为了预防再次发生受精失败，在新的治疗周期中倾向采用ICSI受精。但是ICSI替代常规IVF不一定能避免受精失败或低受精率的发生．在确定新的方案时应详细分析前一次失败原因。
3．不明原因不孕
不明原因不孕的患者，如果多次IUI未孕，在改行IVF方案治疗时如果获卵数≧12，可采用RT和ICSI受精各半的方式。
4．梗阻性无精子症
5．生精功能障碍
6．IVM
7．解冻卵母细胞
8．解冻精子活力弱
9．污染史
10．免疫性不孕
综上所述，考虑到ICSI安全性和潜在风险，在临床治疗中应当严格保守的选用ICSI方案，除了参考精液原始的密度、活力或形态的参数外，还要结合精液处理后获得的总活动精子数目以及夫妻双方的病史等因素综合考虑以确定合适的受精方式。

常规精液冻存的指征：
1． 手淫取精极度困难：尤其是前次IVF助孕时因手淫取精失败最终行TESA取精的患者。
2． 取卵日男方因特殊原因不能到医院取精的患者。
3． 等待赠卵的患者。
备注：乙肝、丙肝、梅毒等传染性疾病患者不予冻存精液。

精子冷冻

1 常规精子冷冻

[1] 精液取出后，于37℃恒温台液化完全，同时取出1ml已预分装好的精子冷冻液（WEN）于恒温台上解冻并使其恢复至室温。
[2] 镜检，取一滴精液压片，于生物显微镜下镜检，方法同常规精液镜检，报告原始精液质量，记录于精液处理单上。
[3] 确认精液适合冻存后，与患者谈话并签写《精子冻存协议书》。本实验室留去第一联与该病人取精单装订。在精液冷冻登记本上记录：夫妻姓名，冷冻日期，精液质量，冷冻编号，冷冻位置等。
[4] 待冷冻液恢复至室温后，取一支干净巴斯特吸管，贴标签，吸取1ml精液与冷冻液充分混合，分装至3支干净的冷冻管中用Maker笔在每支冷冻管上标记夫妻双方姓名、冷冻日期、冷冻号。室温静置10min。
[5] 选择冷冻位置，制作冷冻管支架。根据液氮罐中的空余位置，选择合适位置存放冷冻精液，根据选定位置给铝制冷冻管支架编号，将冷冻管固定于冷冻支架上。
[6] 室温静置10min后，将冷冻支架转移植4℃冰箱，静置20min。同时制作液氮蒸汽吊桶。取一金属吊桶悬吊于液氮液面上（预冷10min）从4℃冰箱转出标本后置于-20℃冰箱静置3min。
[7] 将冷冻支架从冰箱中取出，迅速（5s内）放至金属吊桶内，静置6min。
[8] 将支架从液氮蒸汽吊桶内取出，迅速放至液氮罐的相应位置上。
[9] 将液氮罐关好并检查确认。
[10] 结束，收拾工具，丢弃废弃精液样本及使用过的试管、吸管、精液杯等物品。
[11] 解冻一管精液样本，确定冷冻是否成功，若解冻后无活动精子则应废弃该批冷冻样本，通知患者重新取精冷冻，并以其他正常精液样本作对照实验，以确认精子冷冻液无问题。如解冻后精子活力正常，则无须通知患者。

2 TESA/PESA精子冷冻

[1] 同TESA/PESA精子处理步骤[1]。
[2] 取一干净巴斯特吸管，将TESA/PESA检查认为有冻存价值的睾丸组织或附睾穿刺液收集至一干净圆底试管中，贴标签，600G离心10min。
(离心同时，取一支已分装好冷冻液的冷冻管（10d/管），一支干净冷冻管，用Maker笔分别标记夫妻姓名，冷冻日期，冷冻号。并将其置于恒温台，使其恢复至室温。与患者夫妇谈话，签写《精子冷冻协议书》。）
[3] 离心后吸去上清液，另取一支巴斯特吸管吸取少量培养液，向试管中滴加10d，充分混匀后加入含冷冻保护剂冷冻管中，与冷冻液充分混匀。取10d分装至另一冷冻管中，拧紧冷冻管盖。室温静置10min。
[4] 室温静置10min后，将冷冻支架转移植4℃冰箱，静置15min。同时制作液氮蒸汽吊桶。
[5 ] 将冷冻支架从冰箱中取出，迅速放至金属吊桶内，静置15min。
[6] 将支架从液氮蒸汽吊桶内取出，迅速放至液氮罐的相应位置上。

6