生物工程生物技术专业英语翻译(八).doc

第八章 动物细胞培养获得的产品及生产过程
8.1历史
尽管很多研究者很早以前曾经研究在试管中培养的动物细胞的性质，最早将这类细胞应用于实际生产的是J.F.Eeders，他在1949年发表文献，说明脊髓灰质炎病毒可以在灵长类的神经组织或其它组织中生长。
导致这一开创性成果的出现可以简要概括如下。早在1880年，Annold发现白细胞可以在体外分裂，随后又有人发现，动物离体组织在浸泡在血清、淋巴或腹水等组织液中可以生长。通过R.Harrison发明的悬滴培养法是一个转折点，其方法是将蝌蚪脊髓放入特殊的中空的载玻片，里面装入淋巴液，上面用盖玻片封住。Correl又对这项工作进行拓展，他发展出一种巧妙的方法，可以使培养细胞保持不受外来杂菌的污染，这在当时很少有人能够做到。再后来，培养基中加入促进细胞生长的物质，到了1928年，能够在试管中培养的鸡胚或小鼠的碎组织中使病毒生长，这些方法被Enders借鉴，他和他的同事在培养过程中使用了刚刚在10年前发明的抗生素，这对他的试验大有帮助。在20世纪50年代初期，Salk通过滚管培养猴肾组织或睾丸组织的方法制成了脊髓灰质炎病毒疫苗。这种方法建立起来以后，其它疫苗也通过鸡胚或灵长类胚细胞生产。
8.2 从动物培养细胞中获得产品的类型
动物病毒至今仍然是从动物细胞培养中获得的最多的商业产品。目前，每年大约生产1.5×109剂量的口蹄疫病毒疫苗，针对家禽新城病和马克莱氏病的疫苗数量与之相当。人类病毒疫苗每年的投药量每年不超过108剂量。生产干扰素的方法仍然处于发展中，将来会接近或超过动物疫苗的规模，但是现在而言，从特殊合成的杂交瘤中提取的免疫生物制剂仍然是人们不熟悉的领域，然而，这方面无疑将是未来十年会取得重要进展的领域。
8.3产品获得的方法综述
从动物细胞培养物中获得产品的基本路线已经在图中列出。基本上有三个时期组成。第一个时期是准备期，第二个时期涉及到动物细胞的培养。第三个时期是产品获得。最后一个时期在有些产品的生产中并不涉及细胞的分离，而其它产品可能还要用病毒感染细胞或者加入诱导剂。
在生产过程中，人们做了很多努力来控制各种成分的质量，现在许多产品的生产过程中的参数可以在线或者离线监控。质量监控的目的是，确保培养基中所加入的物质可以促进细胞的生长，而且不会污染细胞培养物。
培养基的配制是相当费力的，并且需要技术熟练。许对确定的物质相对来说比较容易控制，然而水和血清这两种组分并不容易控制。水可以有广泛的获得来源，但是即使通过蒸馏和去离子之后，水中仍然可能含有对细胞生长有害的物质。由于这个原因，将格陵兰冰河深层中冰块的融化水作为对照是有好处的。储存准备好的水也是很困难的，因为蒸馏水在室温下可以产生大量的细菌，它们对细胞的生长是有害的。这可以通过我们将准备好的水放在80摄氏度下保存，在该温度下通常认为蒸馏水是无菌的。
通过处理将抗体出去的血清在细胞培养中是非常有用的，可以避免抗体对病毒的影响。但是，购买和检测血清的费用是高昂的，因此可以在实验室中生产。对血清质量的完全控制是试验可重复的重要因素。一般将血清置于－20摄氏度的环境下，避免血清变质。小牛血清在细胞培养中是比较常用的，但是它比较稀少和昂贵。并且其中有可能含有支原体和噬菌体的污染。
动物细胞可以通过两种基本的方式进行培养。大多数的动物细胞，当它们碰到固体培养基或其它固体表面时，这种环境可以诱导它们进行分类。还有一些细胞，可以在液体中悬浮生长。前者被称为单层细胞，因为尽管在连续培养的条件下它们可以形成几层细胞，但是通常它们只能形成一层细胞。不用通过固体培养基的细胞称为悬浮细胞。
一般认为只能进行单层生长的细胞内原癌基因较少，而悬浮细胞中较多，因此，悬浮细胞一般不用于人类免疫制品。很多时候表明，单层细胞与悬浮细胞相比，可以生产更多类型的病毒。然而，一旦病毒可以通过悬浮细胞获得，大规模的生产将更加容易。兽用产品多通过该方法来获得，例如α－干扰素就是通过杂交瘤生产的免疫生物制剂。尽管用于后两种制品的细胞在检测中被证明具有致癌性，但是在生产过程中或者在使用过程中也不具有危险性，因为在使用之前，会把细胞出去。
8.4单层细胞生长系统
培养细胞系统所需的培养基可以分为两种类型。增加设备数量可以扩大处理规模。获得细胞需要多个处理步骤通过增加设备的规模，也可以扩大处理的规模。
8.4.1单层细胞培养的多步处理
通常，可以在静止玻璃瓶中或培养皿中生产单层细胞。这些瓶子具有不同的结构，分别以以Brockway，Rorx，Carrel，Baxter或医用flat命名。这些瓶子可以使用苏打玻璃，但是最好使用硅硼玻璃，因为尽管后者价格较高，但是硅硼玻璃较为结实并且易于修补。这些瓶子可以单独使用，但是为了运输方便，它们通常堆放在瓶架上。
固定瓶培养系统已经有了一些发展，可以确保细胞在瓶子所有的内表面而不是瓶子的底部生长，这需要转瓶系统。在这种系统中，尽管固定在夹子上的方形瓶子也可以转动，但是在该系统中通常采用圆柱形的瓶子。在该种培养系统中，有许多不同规格的瓶子，有些瓶子的长度达到了180cm。这些瓶子放置在可以通过机械方式转动的瓶架上。一个标准的转瓶设备可以放置72个瓶子，6～10个这样的瓶架可以组成一个适宜规模的生产单元。转瓶系统已经在意大利的Zooprofilattico Sperimentale研究所发展到了极至，在那里，每四个培养箱中可以同时转动培养7000个瓶子。向这么多瓶子中间添加培养基、细胞和病毒的同时又要保证培养不被细菌污染，这是一个困难的但并不是不可克服的问题，该研究所的高度自动化控制也提高了这种方法的经济活力。
8.4.2单层细胞培养产物的处理单元
单层细胞培养处理单元的发展始于20世纪60年代中期，现在已经成为被广泛接受的实用技术。近年来各地许多作者对这方面许多发展的细节被做了回顾。下面我们将要讨论的是不同系统中的最粗略的框架和最新进展。
处理单元是在多步处理可信成功的操作之后发展起来的，设计单处理的目的是取代多步处理步骤。因此，单元处理是在平皿固定架子上发展起来的，使人联想起固定瓶子的架子。这些平皿是由一次性的聚苯乙烯或聚碳酸酯做成的，而不是钠玻璃。后来，平皿架有了改进，通过垂直转动平皿，近年来，通过水平方向转动平皿。后者已经实现了规模化，目前被广泛应用于β－干扰素或呈纤维干扰素的生产。这种生产系统的规模化在细胞培养和清洗等方面面临着工程和操作上的困难。 容器内的表面积的是受到限制的，这将导致两方面的后果：
（a） 圆盘的两面都要被利用
（b） 产品以很稀的方式得到，因为所有的平皿中的培养基是充满或者至少是半充满的状态。
滚管技术的发展可以从多管细胞繁殖器中得以展现。这种系统已经达到了200L体积的规模。Gyrogen，一个具有很大表面积的细胞培养仪器，是由很多平行的管子组成，这些管子通过额外的驱动力在100L体积的圆柱形外壳内旋转。这种昂贵的设备可以工作，但是用这种设备生产是否经济上可行还没有讨论。
利用纤维中空管的收缩性质取得了很多具有独特优势的进展。在小规模条件下，它可以模拟动物组织生长，营养基通过纤维腔渗透过来。这种系统在两个方面具有优势，废物和产物都能够从生产细胞中借助半透膜加以分离。该系统中半透膜的孔径已经发展到0.21个尺度，并且已经用于商业生产，其自动化与检测系统都已比较完善。
旋转膜或者旋转袋也已经被使用了，但是这些系统只能在小规模得以应用，商业规模应用的计划还没有启动。
目前很多公司利用填充床生产细胞或相关产品如β－干扰素或者口蹄疫病毒和猪水疱病毒。填充材料有所不了同，有的采用包有聚苯乙烯的不锈钢小球，有的采用玻璃珠。通过采用填充床，培养基可以循环使用，许多控制动作可以方便的集中在辅助培养基贮池，它在大多数系统中都是常见的。它们相对来说容易操作，便于扩大规模，因为操作统一的填充柱的机械问题很好解决。由于玻璃常用作基质，操作的可信性提高，并且细胞和玻璃表面的亲和性与在实验室中没有变化。更重要的是，当从这种细胞熟悉的基质上生产某一生物产品时，在控制产品散播方面几乎不会遇到问题。
显然，固定填充床培养也不是没有自身的问题。沿着填充床存在着一定的梯度，并且培养物如果不放在显微镜下进行观察，很难对培养进行监控。虽然后一个问题可以通过检测更容易检测的循环培养基来克服，但是系统中的不均一性的问题仍然存在。
Quasi均质系统是由Wezel开发的生产动物细胞产品的系统。在1967年他阐明细胞可以在直径为0.2mm的包有火棉胶的DEAE葡聚糖颗粒上生长。这些颗粒可以在搅拌很轻的情况下悬浮在溶液中，因此细胞可以附着在这些微载体上生长。从这以后，许多研究者证明这些微载体上培养细胞规模可以达到500L。最近的类似报道是利用绿猴肾细胞系的现代微载体，它们用聚苯乙烯，聚丙烯或者玻璃珠制成。然而，似乎葡聚糖微载体更适合作为微载体。
8.4.3悬浮细胞产物的处理
悬浮动物细胞产物的处理与细菌培养物的处理几乎相同。进来的一些综述描述了控制的一些参数。所用的设备是标准的发酵设备，稍加改动，使搅拌强度和通气量有所下降。这样的系统已经是传统的方法，可以扩大规模到8000L。在这样的规模下，可以通过仓鼠肾细胞或者其它的仓鼠细胞系，IFFA－3，商业化生产口蹄疫病毒。并且，α－干扰素也是通过淋巴细胞系Namalwa通过近似的设备和规模进行生产的。这些设备的搅拌系统做了一些改变，与气体搅拌发酵类似。原料的混合通过发酵罐底部的气泡来实现，因为这对移动液体非常有效，并且不会对细胞造成损害。常规喷雾，可以增加气泡的表面积，会对动物细胞造成严重的损害。溶氧水平本身不会有害，除非它低于在标准温度和压力下培养基溶氧量的15％或者高于标准温度压力下培养基中的溶氧量，但是细胞在气液界面的相互作用降低细胞的活性。奇怪的是，快速的物理搅拌似乎对细胞并无多大影响，但是，这些参数对质量影响的明确的研究仍需继续进行。
8.5下游处理
许多应用于通过动物细胞生产稀有物质的下游处理技术已经应用，这些技术与蛋白质技术领域的有些技术类似，下面我们要详细讨论动物细胞下游处理技术中独特的地方。一些操作在其它的领域也是常用的，比如过滤，离心，沉淀，色谱等，在此不做讨论。
8.5.1灭活
尽管许多疫苗是通过有感染性的病毒颗粒制成的，但是还有一些是通过杀死的活灭火的病毒制成的。在第二种情况中，保证接受者不会被疫苗中残留的病毒感染是非常重要的。用于灭活的常用的试剂有甲醛，β－丙酸内酯用于灭活狂犬病毒。最近，亚胺用于灭活口蹄疫病毒。亚胺可以稍稍瓦解口蹄疫病毒的结构，甲醛可以使衣壳粒发生交联，使基本结构更加稳定。其它的灭活方法，比如紫外辐射或者利用缩水甘油醛也被采用，在所有的应用中，要保证待处理的病毒单分散，否则失活剂无法到达病毒簇的内部。

8.5.2亚基形成
如果灭后不彻底，病毒疫苗对于接受者来说是危险的，因此我们通过利用去垢剂将病毒分解，可以制造亚基病毒疫苗，最终的疫苗通过病毒均有免疫原性的部分制得。制备这种亚基病毒的最好候选者是狂犬病毒疫苗和乙肝疫苗，疱疹疫苗，巨细胞病毒疫苗和流感疫苗。目前为止，对分离的流感病毒的凝血素糖蛋白抗原试验表明，这种疫苗是有效的，虽然没有天然病毒引起免疫反应有效，到那时如果注射足够的剂量，也可以得到足够强度的免疫反应。
8.5.3产品阐述
活体病毒疫苗通常含有1～4种不同的病毒类型，每一种代表约1000个活的病毒颗粒。这些物质在有生物保护剂的条件下被冻干，如蔗糖，牛血清或者白蛋白和磷酸根离子。死体病毒疫苗与之不同，改种疫苗每剂量含有1011病毒颗粒并和称为佐剂的物质混合，佐剂可以增加抗原的效果。佐剂由不同的化学物质组成，比如强心甘皂素，各种铝盐和各种含油物质，病毒的水相悬液可以乳化形成油包水的乳化液，在含有去垢剂的盐溶液存在的情况下，随后转变成水包油的乳化液。这些物质在激发免疫系统时会产生协同效应，使抗原激发出最激烈的免疫反应。
8.6基因工程动物细胞和细菌
将限定序列核酸片段插入到原核细胞或者真核细胞中，然后收集产品，比如蛋白质，这种能力将对细菌和动物细胞的生物工程产生深远的影响。但是现在还看不出以动物细胞为基础的活体病毒疫苗生产技术将会被基因工程细菌加工过程完全取代，很明显，动物细胞产品，如胰岛素和α－干扰素将会通过原核生物生产。其它的死体疫苗如口蹄疫病毒和脊髓灰质炎和其它类型的干扰素可以通过两种细胞任意一种来完成商业化生产。然而，动物细胞基因工程，能够生产糖化蛋白，是生产人类生长激素、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂的最佳底物。
我们正在见证一个生物技术飞跃发展的一个新时代，确信的预言发展前景还为时尚早，但是，可以确定的是，多潜能的方法将会对未来我们生产生物制品产生重要的影响。