氢氧化钠提取与固相萃取结合的方法测定不同土壤中的灭草松.doc

氢氧化钠提取与固相萃取结合的方法测定不同土壤中的灭草松，
2,4-滴丙酸，2-甲-4-氯苯氧基乙酸

Christian W. Thorstensen and Agnethe Christiansen

挪威农作物研究学会，Plant Protection，Hogskoleveien 7，N-1432 Ås，Norway，和挪威农作物研究学会，Pesticide Laboratory，Osloveien 1，N-1430 Ås，Norway

用一种方法在选择的三块不同质地的挪威土壤上提取灭草松，2,4-滴丙酸，2-甲-4-氯苯氧基乙酸。最初在一个土壤类型中测试三种不同的提取方法所有的方法使农药混合物的回收率大于80%，但是氢氧化钠提取与固相萃取结合的方法用来做进一步的回收率测试以土地添加四个不同除草剂浓度标准品（潮湿的土壤0.001-10μg / g）。此方法迅速、简单并且需要极少的有机溶剂。土壤包含1.4（Hole），2.5（Kroer），和37.8%（Froland）有机碳，回收率分别在82-109%，80-123%，和45-91%范围内。使用气质联用仪检测潮湿土壤中灭草松的最低检测限是0.0003μg/g，而潮湿土壤中2, 4-滴丙酸，2-甲-4-氯苯氧基乙酸的最低检测限为0.0001μg/g。

关键词：土壤提取；固相萃取；苯氧基酸；灭草松

介绍
苯氧基酸自第二次世界大战以来广泛用于农业抑制杂草。尽管这些除草剂以盐或酯的形式被应用，他们水解为原化合物，并且在土壤发现他们是酸性形式。
苯氧基酸经常与灭草松或碘苯腈联合使用。在土壤确定这些农药的存留状态，取决于化合物性质，土壤特性，和环境的条件。在成长的季节期间为获得良好的杂草抑制在土壤中的存留状态是重要的，尽管它可能在地面和地表水轮流产生污染。从农学的观点，除草剂成功地持续足够长的应用给予合意的杂草抑制，然而过长使用并不影响后面的农作物的生长。土壤中的农药残留水平的判定被需要更好的了解这些化合物土壤中的性质。
我主要完成了利用不同的有机溶剂的从土壤中提取苯氧基酸和灭草松，例如丙酮，二乙基醚，亚甲基氯化物，和乙腈或混合溶剂。土壤中的苯氧基酸通过酯化作用使用一种有机增溶剂用提取至他们的甲酯中。使用超临界的流体的提取法也已经被提议了。 然而，超临界的流体提取法经考虑因为仪器费用太昂贵和每个样品太费时间。
这份研究的主要的目标是在挪威的参考土壤上开发一个简单且迅速的步骤测定灭草松， 2,4-滴丙酸，2-甲-4-氯苯氧基乙酸。这个步骤将以后被用来研究同样土壤中灭草松，2,4-滴丙酸，2-甲-4-氯苯氧基乙酸的降解。 此次目的是，如果可能，提取出的土壤提取物经固相萃取（SPE）步骤，最近已经取得进步的灭草松，2,4-D，2,4-滴丙酸，2-甲-4氯苯氧基乙酸，和水中的Z-丙酸。

实验步骤：
化学试剂：甲醇和远-紫外乙腈的高效液相色谱级别，并且二氯甲的农药级别；从Labscan获得所有（都柏林，爱尔兰）。正磷酸（H3PO4）85%，氨水溶液（NH3）25%，发烟盐酸（HCl） 37%，甲酸（HCOOH）98-100%，三水磷酸氢二甲（K2HPO4·3H2O），和无水硫酸钠（Na2SO4），分析纯级别，从Merck被购买（达姆施塔特，德国）。2,3,4,5,6-五氟溴化物和n-癸烷从Fluka（Buchs， 瑞士）。从Sigma获得磷酸二氢钾盐（圣.路易斯, 卫生官员）。灭草松，2,4-D，2,4-滴丙酸，2-甲-4-氯苯氧基乙酸和Z-丙酸的参考标准由Ehrenstorfer博士提供（奥格斯堡，德国）。 表述包括灭草松，2,4-滴丙酸，2-甲-4-氯苯氧基乙酸混合物，商标名Triagran-P, 来自Collet Kjemi a/s（Asker，挪威）。在农药稀释物中添加20mM磷酸盐缓冲剂，pH调至3。所有的溶液4℃避光贮藏。
设备和原料样品前处理：Supelco 的真空复试接头固相萃取仪用于固相萃取。可任意使用的6mL萃取柱柱体添加IST的SDB 500mg用于萃取。从柱体流出的洗出液用Savant Instruments离心蒸发器（Farmingdale，NY）蒸发至干。
土壤样品：这次研究选择的三块土壤的主要特性见表1。土壤中有机物含量不同，土壤pH级别，和粒度分布。土壤充分地表现原材料的变化，侧面图展开（土壤性质），并且陆地使用。从土壤侧面的0-30-cm层收集土壤样品并被通过一个2-mm滤网。
土壤要塞：筛选方法，来自Kroer的含有灭草松，2,4-滴丙酸，2-甲-4-氯苯氧基乙酸和Z-丙酸的10g潮湿土壤添加标准品，并且浓度为5μg/g的潮湿土壤。在参考土壤的提取期间，25g含有草松，2,4-滴丙酸，2-甲-4-氯苯氧基乙酸混合物潮湿土壤。在表2给出浓度标准。土壤在掺加示踪剂以后的水分含量在Hole, Kroer, 和Froland土壤中分别是22，25，和82%（与干燥土壤的百分比计算），分别地，并且相当于60%水分容量（WHC）。 每个添加的样品手动摇荡，并且在萃取之前在4℃冰箱里放置15h。

用丙酮、水、醋酸提取：用25ml丙酮、水、醋酸（80：19：1）萃取一份10g的土壤样品24h，再离心10分钟（7600r/min）。用10mL相同的混合溶剂反萃取样品1h，再离心。使表层物质混合，用500mL蒸馏水稀释，在一个固定相容器上预浓缩至低于描述。
氢氧化钠提取和二氯甲烷分离：一份10g土壤样品1h用25mL氢氧化钠（0.01M）提取两次并且以7600转离心10分钟。混合上清夜用6M HCl变酸到pH值为1并且用50mL二氯甲烷分离（1h）。再用25mL 二氯甲烷重复分离10分钟。混合萃取液用无水硫酸钠干燥，脱水至干燥，并且用在1mL 的20mM磷酸盐缓冲剂再溶解，pH值3。
氢氧化钠的萃取：一份10g土壤样品1h用25mL 的0.01M NaOH萃取两次，然后7600转离心10min。联合的wupernatants在固相柱被变酸。为参考土壤的萃取，土壤和氢氧化钠的数量分别被增加到25g和100mL。
SPE（固相萃取）步骤：吸取5ml甲醇至容器中清洗萃取柱，再用10mL的水调整PH至2.5±0.5。样品在抽滤流动速度低于30mL/min条件下填装。吸附剂不允许在清洗过程中抽干，不断添加样品。抽取之后，柱用氮气慢慢吹干。洗涤重点是用2mL甲醇和5%氨气，在洗脱之后真空旋转。洗出液蒸发干。浓度参见标准1和2（见表格2），残余物再用1mL的20mM磷酸盐/酯缓冲液溶解，调PH至3，用HPLC-UV（高效液相色谱-紫外检测法）法检测分析。再浓度参见标准3和4，残余物用4mL磷酸盐/酯缓冲液溶解，调PH至8。农药由五氟溴化物衍生而来，用气质联用仪检测。
高效液相色谱分析：液相色谱由一个光谱物理学模型SP8000泵的，一个SP4270 intgrator（圣何塞，CA），一个Gilson自动取样器（米德尔顿，WI）， 和一个米尔顿罗伊200nm紫外探测器（Staffordshire，英国）。一个不锈钢C8分析柱，25cm×4.6mm i.d，自相分离激光目标指示器的充以Spherisorb 5μm粒子（Deeside， 英国）被使用。流动相是20mM磷酸盐缓冲剂，pH3/乙腈（65:35 v/v）以流动速率1mL/min，并且注射量50μL。数量由外部标准峰面积测量。
GC-MS（气相色谱-质谱联用仪）检测：所有的GC-MS检测是用Hewlett-Packard（惠普）5971A MSD组合Hewlett-Packard 5890A GC（Palo Alto，CA），合体用一根CPSIL 5GB MS毛细管柱，50m×0.25mm i.d. ×0.40μm覆以一层薄膜，由色谱图（Middelburg，尼德兰-荷兰）。载气氮（Ultra Plus 6.0，Hydro gas-氢气，奥斯陆，挪威）在80℃注入柱顶压力18psi（直线速率=29.9cm/s）。无分流操作注入（60s），注入体积2μL。注入器和检波器温度各为240℃和260℃。炉温在80℃保持1分钟，然后以20℃/min升高到160℃，接着再以5℃/min升高到280℃，并在最后保持5分钟。质量选择检测器运转选择性离子检测器（SIM，70eV）。两特征离子被各自化合物选择：灭草松，质核比378和420；2,4-滴丙酸，质核比414和416；2-甲-4-氯苯氧基乙酸，质核比380和382。用外标法测量定量。

结果和讨论：
被选择的土壤代表普通的挪威土壤，并且这些挪威土壤环境将为以后服务于ecotoxicological文章参考土壤为杀虫剂的在挪威的环境这些愿望以后用作参考土壤。因此， 伟大的成就在挪威选择最多普通的土壤。 两块农业土壤， 一块洞中的细砂肥土和一块Kroer的肥土， 选择的资料根据为来自挪威协会的土壤数据库的土地详细数据，它普遍覆盖约 2500k㎡ 农业土地。作为选择来自Froland森林的第三块土壤大量腐败有机物质归于它的高有机物。
我们的主要目标是开发一种能用于在挪威参考土壤研究酸性除草剂降解的方法。一个根本目的是这种方法在挪威能被用于常规分析。Kroer的土壤是在农药常用于各种各样的土壤农药的研究行为 并且它也因此决定了在初始的萃取方法筛选使用这个土壤类型。测试的第一种方法是Herber and Stan建议了的一个步骤的修正。修改在浓缩前直接用水稀释土壤萃取物可以节省时间完成，代替土壤萃取物蒸发后的稀释和浓缩。这个修改也包括少数间距可能引起玷污和分析物损失。第二和第三种实验方法有关氢氧化钠的萃取接着均酸化，并且分离二氯甲烷或固相浓缩描述苯氧基酸的分析和水样品中的灭草松。第二方法的一个问题在于在分离过程中有乳状液形成，大部分时间需要打碎乳状液。第三种方法的100mL土壤萃取物能快速30mL/min流速流过 SDB固相柱被浓缩。早期研究已经显示出硅土吸附剂很好的清除土壤萃取水溶液堵塞。

碱的萃取是很少完成，并且据我们所知固相浓缩的有为碱性化合物判定苯氧基酸不能应用于HPLE-UV在筛选方法中的定量农药衍生物在GC-MS的速度相比。
首先回收率实验用三个不同准备方法的Kroer土壤添加浓度为5μg农药每克潮湿土壤的农药混合剂。结果报导在表3。 农药混合剂用所有测试方法的平均回收率在82-90%范围内， 它显示出了他们都是令人满意的。然而，为更深的工作需氢氧化钠的萃取和SPE的选择，因为他容易执行并且相比其他方法要最少有机溶剂。
回收率实验在三种不同参考土壤的大范围浓度执行，它展现在表2（0.001-10μg/g潮湿土壤，相似浓度)。由于方法将以后用于参考土壤中灭草松，2,4-滴丙酸，2-甲-4-氯苯氧基乙酸混合剂的降解研究，仅这三种农药回收率测试。在结果在表4中给出。全部级别灭草松的平均回收率百分比范围为Froland的organicrich土壤80%到Kroer的细砂肥土。2,4-滴丙酸平均级别回收率范围为Froland土壤的65%到Kroer 土壤的103%，并且2-甲-4-氯苯氧基乙酸的范围为Froland土壤的59%到Kroer.土壤的97%。每个的回收率百分比数据，Froland土壤等级最低。酸性化合物的吸附作用到土壤，有机物越多 pH越低认识越多，并且森林土壤回收率说明相比农业土壤较低。苯氧基酸可以和腐殖的化合物组成三维结构或从腐殖的化合物的主基团在存在在空气中的氢氧化钠萃取过程中形成联合体。
所有在Hole和Kroer土壤中的农药的平均回收率均>88%。 不管Kroer土壤的有机物再多，Kroer的土壤比Hole的土壤中的农药有利于更高的回收率趋向。Kroer土壤的高回收率原因可能是另外的土壤要素， 例如泥土， 可能干涉农药的吸附作用从而影响他们的回收率。 若干作者已经注意否定的装料农药能被否定的装料泥土排出。Kroe土壤比Hole土壤有更高的泥土物，并且这说明Kroer土壤比Hole土壤有更高的回收率。有机物质有助于消除pH的电荷依赖。因为酸性除草剂在他们的阴离子在两农业土壤中形成，Kroer土壤的更高的有机物含量可能实际上再土壤基体绑捆减少从而增加回收率。可以因此被假定泥土和有机物在阴离子农药的回收率都有积极作用。
使用GC-MS的最低检测限计算出为样品分析物浓度 信噪比≥10。判定执行注射土壤萃取物低浓度级别（表2），并且潮湿土壤中灭草松最低检测限为0.0003μg/g而潮湿土壤中2, 4-滴丙酸和2-甲-4-氯苯氧基乙酸最低检测限为0.0001μg/g。
这份工作的新颖是有SPE联合碱性萃取。只使用少量的有机溶剂。高含量有机物样品在SDB柱相比C8/C18硅土吸附没有任何堵塞。发展的方法用于土壤中苯氧基酸和灭草松降解，并满意于所有农药和土壤类型的效果。挪威农业土壤中的灭草松，2,4-滴丙酸，2-甲-4-氯苯氧基乙酸的常规分析方法是圆满的，并且农药回收率范围在89-103%之间。