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果胶酶的综述
【摘要】 果胶酶(Pectinase)是世界四大酶制剂之一，是分解果胶质酶类的总称，它能将复杂的果胶分解为半乳糖醛酸等小分子。主要包括原果胶酶、果胶酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶四大类。天然来源的果胶酶广泛存在于动植物和微生物中，但动、植物来源的果胶酶产量低难以大规模提取制备，微生物则是生产果胶酶的优良生物资源，在微生物中，细菌、放线菌、酵母和霉菌都能代谢合成果胶酶[1]。目前果胶酶在食品、纺织、医药、造纸、环境、生物技术、饲料等领域得到广泛应用。综述了微生物果胶酶生产茵的菌种、选育、鉴定、发酵方法和发酵条件优化，酶的分离纯化、酶学性质和分子生物学方面的研究进展，并介绍了果胶酶的应用进展。 
【关键词】果胶  果胶酶 生产 纯化 固定化研究现状 应用
引言
果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以a一1，4糖苷键聚合而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起。它存在于所有的高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞间层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白(extensin)[2]相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，表现出固有的形态。果胶分子的结构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同，总体可分为光滑区(smooth region)和须状区(hairy region)两部分，主要由HGA、RG-I和RG-II三个结构区域构成，其中RG-II常以二聚体的形式存在。果胶酶是指能够分解果胶物质的多种酶的总称。果胶酶在当前的生物工程领域中起着非常重要的作用，不仅可用于食品工业如水果加工及葡萄酒生产等方面，还广泛应用于麻类脱胶、木材防腐、生物制浆、环境保护、污物软化处理和饲料等行业中。另外，研究表明，果胶酶降解果胶而得到的果胶分解物对食品有很强的抗菌作用，特别是对大肠杆菌有显著的抑制增殖作用 。2O世纪90年代中期，果胶分解物作为天然防腐剂开发成功。目前，国外以果胶分解物为主要成分，配合其它天然防腐剂，已广泛应用于酸菜成鱼、牛肉饼等食品的防腐。
一、果胶酶的分类及作用机理
同纤维素酶类似，果胶酶也是一种有几种酶构成的复杂酶系[3]，一般认为它包括四种酶，这四种酶协同作用破坏植物细胞壁，果胶物质及其对应作用酶的作用机理。
1.1 原果胶酶(Protopectinases）
水溶性果胶，原果胶酶切断聚甲氧基半乳糖醛酸和阿拉伯糖之间的化学键。
1.2 多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases)
该酶能切断果胶酸的α-1,4 糖苷键，促进聚半乳糖醛酸链水解。根据水解作用机理分为两种：聚半乳糖醛酸外切酶(exo-P G1( E C3.2.1.67)、e x o - P G2( E C3.2.1.82))、聚半乳糖醛内切酸酶( E n d o - P G ( E C3.2.1.15) )，内切酶从分子内部无规则地截断α-1,4 键，可使果胶或果胶酸的粘度迅速下降；外切酶从分子末端逐个切断α-1,4 键，生成半乳糖醛酸，粘度下降不明显。
1.3 裂解酶(Lyases)
通过反式消去作用裂解果胶聚合体，裂解酶在C-4 位置上断开糖苷键，同时从C-5 处消去一个H 原子从而产生一个不饱和产物。分为：内切果胶酸裂解酶( e n d o - P G L ( E C4.2.2.2) ) 和外切果胶酸裂解酶(exo-PGL(EC4.2.2.9))、内切聚果胶裂解酶(endo-P L ( E C4.2.2.10) ) 和内切聚甲基半乳糖醛酸酶( e n d o -PMG)。
1.4 果胶酯酶(Pectinesterase，PME(EC3.1.1.11))
果胶酯酶可随机切除水溶性果胶分子中的甲氧基( - O C H2) 与半乳糖醛酸之间的酯键，产生甲醇和游离羧基。
二、果胶酶的生产技术
2.1 生产果胶酶的微生物
2.1.1 果胶酶生产菌种 
目前生产微生物果胶酶的菌种很多，来源极其广泛，包括细菌、霉菌、酵母菌和放线菌。如芽孢杆菌属、青霉属(Penicillum)、欧文氏菌(Erwinia)、根霉属(Rhizopus)、曲霉属( pergillus)、克鲁维酵母属(Kluyveromy—ces)。侧孢霉属(Sporotrichum)、多子菌属(Pol—yporus)、密螺旋体菌属(Treponema)、酵母(Saccharomyces)、刺盘孢属(Colletotrichum)、螺孢菌属Spirillospora)、假单胞菌属(Pseudomonas)、毛霉属(Mucor)、毕赤氏酵母属(Pichia)等[4]。 
2.1.2 果胶酶生产茵的选育 
菌株品质好坏直接关系着能否产生高质量的酶液，优秀的菌株不仅能提高酶制剂的品质、产量以及发酵原料的利用率，而且还能增加品种，缩短发酵生产周期，改进发酵和提炼工艺条件等[5]。李瑜等从腐烂苹果中定向分离筛选出适合液态发酵生产聚半乳糖醛酸酶的菌株YL-9，鉴定为扩展青霉选出一株产碱性果胶酶活力较高的菌株和一定量的Bacillus(PeniciUiumexpansum)。从碱性土壤中筛gibsoniiS-2。Souza等从土壤样品中筛选到一株产内切聚半乳糖酸活力较高的菌株Peacilomyces2A．UMIDA．1。Noomen等以野生型菌株Penicillium occitanis CLIO0为出发菌株，经亚硝酸诱变育种后得到一株产果胶酶较高的突变株Peni—cillium occitanis Po16，其果胶酶活力高达原始菌株的50倍。诸葛斌等对基因工程育种得到的产碱性果胶酯裂解酶(PL)的基因工程菌Pichia pastoris进行了研究，使碱性果胶酯裂解酶(PL)表达量达到一定量。
2.1.3 果胶酶生产菌的鉴定 
目前，果胶酶生产菌多采用经典法和分子生物学方法相结合对新分离菌株进行鉴定。 基于形态学与ITS序列分子系统进化分析，将新分离的高产果胶酶菌株EIM一6鉴定为AspergiUusniger。Li等 结合经典方法和分子生物学方法将株新分离的产碱性果胶酶活力较高的菌株S-2鉴定为Bacillus gibsonii。柯崇榕等 基于18S rDNA序列的系统发育进化分析将果胶酶高产菌EIM．4鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)。 
2.2 微生物果胶酶的发酵 
2.2.1发酵方法 
目前，微生物果胶酶的发酵方法主要有3种方法，包括液态发酵法、固态发酵法和固定化细胞法[6]。 
（1）液态发酵法
Tari等采用AspergillusSO—heATCC20235经液态发酵生产聚半乳糖醛酸酶。Sharma等采用Bacillus pumilus dcsrl经液态发酵生产高碱性和热稳定性果胶酶。Patil等以葵花盘作为基质，分别接种Aspergillus niger DMF 27和Aspergillus niger DMF45进行液态发酵和固态发酵生产果胶酶。 
（2）固态发酵法
采用葡萄皮渣为基质，接种一定数量Aspergillus awamori 2B．361 U2／1经固态发酵生产外切聚半乳糖醛酸酶。采用pergillus niger经固态发酵生产果胶酶。Silva等以农产品加工废弃物柑橘皮渣和麸皮为基质，采用菌种Penicillium viridicatum RFC3经固态发酵生产果胶酶。 
（3）固定化细胞法 
Almeida等研究显示带循环流动填充床生物反应器更适合固定化Kluyvero—myces marxianus CCT 3172细胞生产果胶酶。Almei—da等 研究表明在带循环流动填充床生物反应器中，多空玻璃载体和纤维素载体均适合固定化Kluyveromyces marxianus CCT 3 1 72细胞生产果胶酶。 
2.2.2 发酵条件优化 
发酵是菌种产生代谢产物的主要环节，除菌种固有的遗传因素外，发酵条件是影响产酶的重要因素。Patil等以葵花盘作为基质，分别接种Asper—gillus niger DMF 27和DMF 45进行液态和固态发酶，结果表明液态和固态发酵的适宜温度和pH均分别为34~C和pH5．0，最佳接种量分别为1×10 g／mL和1 X 10 g／mL[7]，最大产酶率分别为12．6 U内切果胶酶／g和34．2 U外切果胶酶／g。采用响应面分析对Geotrichum klebahnii ATCC42397产原果胶酶的发酵条件进行了优化，结果显示pH和Fe“对原果胶酶产率有显著影响，在较优条件下原果胶酶产率达到236 U／mL。 
三、微生物果胶酶的分离纯化 
国内外学者对微生物果胶酶的分离纯化进行了研究，常采用的分离纯化和鉴定方法有超滤、硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、等点聚焦等。Yadav等采用硫酸铵沉淀、DEAE．纤维素和G．100凝胶过滤层析对Aspergillusflavu,MTCC 7589所产碱性果胶裂解酶进行了分离纯化，经SDS-PAGE显示为单一条带；纯化酶的最适温度和pH分别为50℃ 和8．0，Km和kcat值分别为0．59 mg／mL和52．2 S～，酶的分子量为38±01 kD，具有良好的脱胶能力[8]。
四、果胶酶的应用
4.1 果胶酶在果蔬饮料生产中的应用
4.1.1果胶酶能提高果蔬汁的出汁率 
果胶酶是应用于果蔬饮料生产中最主要的酶类,它能较大幅度地提高果蔬饮料的出汁率,改善其过滤速度和保证产品贮存稳定性等。若添加果胶酶制剂,则可降低葡萄汁液的黏稠度,提高出汁率,减轻强度,缩短加工时间,获得色泽清亮、汁液清澈的葡萄汁[7]。
4.1.2果胶酶能使果蔬饮料澄清 
果胶酶作用于果蔬汁时,除降低粘度外,还可产生絮凝作用,使果蔬汁澄清。澄清机理的实质包括果胶的酶促水解和非酶的静电絮凝两部分。果汁中有很多物质如纤维素、蛋白质、淀粉、果胶物质等影响澄清,且果胶物质是造成果汁混浊的主要因素。若果胶酶与明胶结合使用,效果更佳。有时采用复合酶法澄清,如在澄清枣汁时,使用果胶酶和α-淀粉酶[9]。 
4.1.3果胶酶能提高超滤时的膜通量 
利用超滤技术生产清汁及浓缩清汁在果蔬汁加工业中越来越流行。除了可以提高膜通量,果胶酶还可用于超滤膜的清洗。与化学方法相比,利用果胶酶清洗超滤膜能100%地进行生物降解,而且可以在最佳pH、温度下作用,从而可以缩短清洗时间、增加超滤膜的通透量和使用寿命、增加产量、节省能源[8]。
4.1.4果胶酶能改善果蔬饮料的营养成分 
利用果胶酶生产果蔬汁不仅提高了出汁率,而且保留了果蔬汁中的营养成分。首先果蔬汁的可溶性固形物含量明显提高，而这些可溶性固形物由可溶性蛋白质和多糖类物质等营养成分组成,果蔬汁中的胡萝卜素的保存率也明显提高 [10,9]。
4.1.5果胶酶能改善浓缩果汁品质 
果汁浓缩后,不仅流动性差,而且稳定性也差,因此果汁的浓缩也需先澄清和脱果胶,以避免浓缩时产生胶凝。果汁经酶处理去除果胶后再浓缩,所得浓缩汁有较好的流动性,并且重新稀释后仍是稳定的。
4.1.6果胶酶还可用于果实脱皮及净化果皮 
含有纤维素和半纤维素的粗果胶酶制剂能够作用于果实皮层,使之细胞分离、结构破坏而脱落。如柑桔囊衣、莲子肉皮和大蒜膜层经粗果胶酶处理后,可以很快地脱落。此外,果胶酶对杏仁也有一定的脱皮作用[9]。
4.2 纺织行业的应用
随着生物技术的发展和人们对环境的重视，酶在造纸行业的应用越来越受到重视。许多国家已把甘聚糖酶、碱性果胶酶和漆酶用于造纸业中。在热磨机械纸浆过程中，溶解性的胶体物会从真叶木原料中释放出来。这些胶体物质主要是溶解性阴离子多糖（果胶或聚半乳糖醛酸），在造纸过程中严重影响过滤，需要添加大量的阳离子聚合物来消除其危害。纸浆中的聚半乳糖醛酸与阳离子聚合物的结合能力与其聚合度有关，聚合度小于3时消耗阳离子不明显，聚合度大于6时则会大量消耗阳离子。碱性果胶酶可以将果胶或聚半乳糖醛酸降解，减少阳离子聚合物的消耗量，提高纸浆的质量。
4.3 其他方面的应用 
在葡萄酒生产中应用果胶酶,可以提高葡萄汁和葡萄酒的得率,增强葡萄酒的澄清效果,大大提高葡萄酒的过滤速度。果胶酶还可以提高超滤时的膜通量, 还可用于超滤膜的清洗。利用果胶酶清洗超滤膜能100%地进行生物降解,而且可以在最佳pH 值、温度下作用。缩短清洗时间、增加超滤膜的通透量和使用寿命、增加产量、节省能源。果胶酶是应用于果蔬饮料生产中主要的酶类,它可以较大幅度地提高果蔬品种的出汁率,改善其过滤速度和保证产品贮存稳定性。随着果汁和果酒行业的快速发展,果胶酶的需求和应用前景将极为广泛。

参考文献
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