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银杏叶提取黄酮及分离纯化
组员：李佳辉、黄埔、赵超武

一、 实验目的
1.掌握传统的溶剂提取法并对银杏中的黄酮进行提取
2.掌握紫外分光光度计的应用，以及相关溶液的配置
3.学会自主设计实验，培养团队合作精神
二、实验原理
⑴关于黄酮：银杏中最具药用价值的成分，有提高人体免疫力的作用；并且抗衰老、调节内分泌，还具有抗炎、抗真菌的作用；
⑵实验需设置空白参比液，由文献资料可知芦丁标准液的最大波长大概为510nm;
⑶本实验采用硝酸铝（氯化铝）法测定银杏叶总黄酮的质量浓度，因为黄酮类化合物可以与铝盐发生络合显色反应。
其主要原理为：在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在的条件下，黄酮类化合物与铝盐发生螯合反应，加入氢氧化钠溶液后，溶液显橙红色，在510nm（左右）处有吸收峰，且符合定量分析的朗伯—比尔定律（即A=kbc）一般与芦丁标准溶液比较定量。先用亚硝酸钠还原黄酮类化合物，再加铝盐络合，最后加氢氧化钠溶液使黄酮类化合物开环，生成2-羟基查尔酮而显色。显色原理发生在黄酮醇类邻位无取代的邻二酚羟基部位，不具有邻位无取代的邻二酚羟基的黄酮类成分加入上述试剂时是不显色的。（如二氢黄酮类化合物就不发生该显色反应）
目前银杏叶黄酮的提取方法主要有：溶剂提取法、超临界流体萃取法（SFE法）、高速逆流色谱技术提取法HSCCC)微波提取法、超色波提取法、酶提取法、分子烙印技术。因溶剂提取法操作简单，所需试剂廉价易得，故通常使用此法来进行大规模生产。
其工艺流程如下：
银杏叶—→粉碎—→NaOH-60%乙醇回流提取—→离心—→过滤—→滤液收集—→二次醇提—→合并两次滤液—→树脂吸附—→脱吸—→浓缩—→干燥—→提取物
由于银杏叶黄酮中的类黄酮主要为芦丁，故用芦丁为对照物绘制标准曲线，并采用分光光度法进行测定。
三．实验材料及器材
1. 材料
酸银杏叶、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、95％乙醇、磷酸氢二钠、磷二氢钠、D101大孔吸附树脂、盐酸
2. 相关溶液的配制和树脂预处理
0.20mg／mL芦丁标准溶液（500mL）、5％NaNO2（500mL）、10％AI(NO3)3（500mL）、1mol／LNaOH 、0.4mol／LNaOH（500mL）、0.4mol／L HCl(500mL)、30%乙醇（500mL）30%乙醇
（1）D101树脂预处理(500g)：商品树脂均残留惰性溶剂，故使用前根据应用需要，必须进行不同深度的预处理，在提取器内，加入高于树脂层10-20厘米的乙醇浸泡3—4小时，然后放净洗涤液，为一次提取过程。用同样方法反复洗至出口洗涤液在试管中加3倍量水不显浑浊为止，后用清水充分淋洗至无明显乙醇气味，即可进行一般使用。
（2）芦丁标准溶液：精密称取在105℃常压干燥至恒重的芦丁对照品20mg，置于100 mL容量瓶中，加30％乙醇约30mL，置水浴微热使之溶解，放冷，加30％乙醇稀释至刻度，摇匀得芦丁标准溶液（0.20mg/mL）
（3）、5% NaNO2的配制：准确称取5g NaNO2加入到95g蒸馏水中溶解。 
（4）、10% AI(NO3)3的配制： 准确称取10g AI(NO3)3加入到90g蒸馏水中溶解。
（5）、1mol/L NaOH的配制：称取5g NaOH 于一定量蒸馏水中溶解，再定容至100mL。
（6）、0.4mol/L NaOH 的配制：称取1.6gNaOH 于一定量蒸馏水中溶解，再定容至100mL。
7)、0.4mol/L HCl的配制：取4ml的36.5%的HCl溶于100ml蒸馏水中
3.仪器
紫外可见光分光光度计、干燥箱、旋转蒸发仪、离心机、回流装置、恒温水浴锅、中药粉碎机、容量瓶
四、实验步骤
1.原料准备：称取200g银杏叶洗净，于80℃下干燥，干燥后于中药粉碎机中粉碎，备用。
2.黄酮的提取(银杏叶每组10g)
(1)一次醇提：准确称取银杏叶粉末10g，放入索是氏提取器中，用浓度为60%乙醇溶液按1:8（g/ml）混合均匀，在80℃下回流1.5h，
(2)离心：在3500r/min下离心10min；
(3)过滤：真空抽率，滤液收集；
(4)二次醇提：滤渣用浓度为60%乙醇溶液按1:8（g/ml)混合均匀,进行二次醇提，方法同上
(5)合并两次滤液，将滤液置于100ml容量瓶中，加入60%乙醇溶液稀释至刻度
3.黄酮的纯化
层析柱制备：
(1) 准备：D101大孔吸附树脂预处理并充分吸涨
(2) 湿法装柱：将吸涨后的树脂与溶剂的混合物倒入色谱柱中，让其自行沉积。(50ml)
(3) 上样：将样品溶液从柱的上端以较快速度加入
(4) 洗脱：待样品完全上柱后，用30%乙醇进行洗脱，并在下端收集洗脱液。
(5) 浓缩：将洗脱下来的样品进行浓缩
(6) 干燥
(7)得到产品
(8)样品浓度测定
操作方法：
3.1装柱
将D101大孔吸附树脂用丙酮浸泡过夜（大约15-18h），用水浴回流8h,过滤（或抽滤），用水洗至溶液：水（1:2）不产生混浊为止，浸泡在水中，再进行装柱，并在柱顶加少量氧化铝，制成预处理柱，备用。
3.2样品预处理
精密吸取样品5ml(固体样品制成相当浓度的溶液)，加入已处理好的D101大孔树脂层析柱中，用100ml水洗脱（含蔗糖样品用300ml水），洗液弃去（流速1.5ml/min)。再以原流速用30ml无水乙醇分次洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用无水乙醇溶解，定量转移至5ml容量瓶中，稀释至刻度，作为供试品溶液。
4.黄酮含量的测定
（1）标准曲线绘制
精密量取0.2mg/ml芦丁标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置于10.0 mL容量瓶中，各加30％乙醇至5mL，加5％亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀；放置6min，加10％硝酸铝溶液0.3mL，摇匀；再放置6 min，加4％氢氧化钠溶液2mL，加30％乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以第1管作空白对照，在波长510nm处测各试管中溶液的吸光度（1号做空白），以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制出标准曲线，并得到回归方程。
葡聚糖标准曲线的测定结果
编号 1 2 3 4 5 6
芦丁浓度（mg/ml）
吸光值（A510nm）
(2)样品含量的测定
取1.0ml样品液于10.0容量瓶中，，加30％乙醇至5mL，加5％亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀；放置6min，加10％硝酸铝溶液0.3mL，摇匀；再放置6 min，加4％氢氧化钠溶液2mL，加30％乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，在波长510nm处测吸光度。代入线性回归方程，算出黄酮提取液中黄酮的质量浓度。
银杏叶总黄酮提取率（%）=[提取物所含黄铜质量（g)/银杏叶质量（g）]×100%
5.实验结果与分析