高效液相色谱法测定兔血浆中注射用纳米羟基喜树碱的浓度.doc

高效液相色谱法测定兔血浆中注射用纳米羟基喜树碱的浓度
陈渝军1, 易以木2(1.武汉市妇女儿童医疗保健中心，湖北武汉 430016；2.华中科技大学同济医学院药学院，湖北武汉 430030)
[摘要]目的：建立家兔血浆中注射用纳米羟基喜树碱含量的HPLC测定方法。方法：血浆样品酸化后，提取分析。色谱柱C18 （10 µm， 250 mm×4.6 mm ID），流动相为 10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH4.0）-甲醇（50：50），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长384 nm。以5.0 mg/kg剂量给大白兔耳缘静脉推注纳米羟基喜树碱针，于不同时间点采血测定药物浓度。结果：羟基喜树碱保留时间为8.7 min，定量线形范围为20-8000 ng/mL。血浆中羟基喜树碱的回收率为96.92%-103.51%，日内精密度 ≤ 7.87%，日间精密度 ≤ 11.55%。纳米羟基喜树碱注射后符合三室模型。结论：本法简便实用，定量准确，可满足纳米羟基喜树碱动力学研究的需要。
[关键词]羟基喜树碱；纳米；高效液相色谱；血药浓度
Determination the concentration of injected-nano-hydroxycamptothecin in plasma of rabbits by HPLC
CHEN Yu-Jun1 YI Yi-Mu2 (1. Wuhan medical and health center for women and children, Hubei Wuhan, 430016; 2.School of pharmacy, Tongji medical college, Huazhong university of science and technology, Hubei Wuhan, 430030)
[Abstract] Objective: To establish a HPLC method for the determination of injected-nano-hydroxycamptothecin in plasma of rabbits. Methods: After acid treatment, plasma samples were injected and measured by abstraction. The Chromatographic column was C18(10 µm， 250 mm×4.6 mm ID). Methannol-10mmol/L phosphate buffer (pH4.0) (50:50) was served as mobile phase at 1.0 mL/min . Detection wavelength was 384 nm. Determination the concentration of injected-nano-hydroxycamptothecin in plasma of rabbits after iv. administration with the dosage of 5.0 mg/kg. Results: The retention time of hydroxycamptothecin was 8.7 min. A good linearity was shown in the concentration range of 20-8000 ng/mL. The recovery was between 96.92% and 103.51%. The intra-day RSD was less than 7.87% and the inter-day RSD was less than 11.55%. The concentration-time curves of injected-nano-hydroxycamptothecin mainline conformed to three-compartment model. Conclusion: This method was simple, practical and accurate. It could be applied in pharmacokinetic study of nano-hydroxycamptothecin.
[Key words] hydroxycamptothecin; nano; HPLC; drug concentration in plasma

喜树碱(camptothecin,CPT)是从我国特有的珙垌科植物喜树的树千、树皮和果实中提取的一种具有抗肿瘤作用的生物碱，但由于毒性大而限制其临床应用。10-羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin,HCPT)是喜树碱的半合成衍生物，体外和动物实验显示它比CPT的抗肿瘤作用强和抗瘤谱宽且毒性较低。
纳米技术的出现，使保留内酯结构的HCPT进入体内成为可能，为充分发挥其抗肿瘤活性带来希望。本研究将从HCPT纳米针静脉注射后在家兔血浆药物浓度随时间变化规律方面考察HCPT纳米针的药动学特性，评价其临床应用前景。
1 仪器、试药与实验动物
1．1 仪器 Lab Alliance高效液相色谱仪（包括 Lab Alliance PC3000HPLCSystem和Model 500型UV检测器），色谱柱为Irregular-HC18柱（10 µm，Φ4.6 mm×250 mm，天津市色谱科技有限公司提供），Heraeus高速离心机（德国），LDZ5-2型低速离心机北京医用离心机厂），BRANSON 3510型超声振荡仪（美国）。
1．2 药品、试剂与实验动物 HCPT内酯标准品（批号：20020501，含量：98.6%）和HCPT注射用纳米针（批号：20030501，含量：97.0%）由武汉李时珍药业有限公司提供。甲醇和乙腈为色谱纯（天津市运盛化学试剂科技有限公司），磷酸和其它试剂均为分析纯（天津化学试剂三厂）。日本大耳兔，天津市动物中心提供（实验动物质量合格证号：WJ津实动质R-A准字第001号），雌雄兼用，体重2.5~3.0 kg。
2 测定方法及条件
2．1 色谱条件：色谱柱C18 （10 µm， 250 mm×4.6 mm ID），流动相为 10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH4.0）-甲醇（50：50），流速1.0 mL/min，检测波长384 nm，柱温30 ℃。
2．2 血浆样品的采集 ：实验用家兔禁食12小时，于给药后按设计的时间点，经耳缘静脉取血2 mL，置于5 mL肝素化试管，3000 r/min离心10 min，取血浆，-20 ℃冷冻保存。
2．3 血浆样品的处理：精密量取0.5 mL血浆样品于2 mL离心管，加85%磷酸2 µL，室温避光环合2小时以上。环合后的样品加乙腈1 mL，充分混匀，超声振荡5 min，13000 r/min离心10 min。取离心后上清液1.1 mL，置于10 mL离心管，50 ℃水浴，氮气流吹干液体，残渣以80 µL流动相溶解，20 µL进样环进样。
3 分析方法考察结果
3．1 方法专属性
取家兔空白血浆，除不加标准品溶液外，其余按“血浆样品处理”顶下方法处理并分析，获得空白血浆的色谱图，将一定浓度HCPT内酯标准溶掖加入空白血浆中，同法操作，获得相应的色谱图。血浆色谱图中HCPT保留时间为8.7 min，血浆中内源性物质不干扰HCPT的测定。
A B 1 C 1

A：空白家兔血浆样品；B家兔空白血浆+HPCT标准品；
C：HCPT给药后30 min家兔血浆样品；1：羟基喜树碱
图1 HPLC法检测羟基喜树碱家兔血浆样品色谱图
Fig.1 HPLC chromatograms of HCPT in rabbit plasma

3．2 标准曲线制备
取兔空白血浆300 µL，加HCPT内酯标准品的系列标准溶液200 µL，配制成HCPT含量为20，50，250，1000， 2000， 4000，8000 ng/mL的血浆样品。按“血浆样本的处理”项下操作，残渣以80 µL流动相溶解进样。以HCPT标准血浆样品浓度为横坐标，色谱图的HCPT峰面积为纵坐标绘制低浓度标准曲线，取三条标准曲线的平均值（表1），采用加权最小二乘法计算直线回归方程为：Y＝0.003354X＋10.8895，r=0.9990（n=3）。
表1.标准曲线数据（n=3）
Tab.1 Results of HCPT of standard deviation (n=3)
浓度（ng/mL）
峰面积检测值
平均峰面积
SD
RSD%
1
2
3
20
7846
7313
7098
7419.0
385.1
5.19
50
17263
16600
16512
16791.7
410.5
2.44
250
85630
81115

79205
81983.3
3299.3
4.02
1000
305336
258445
227308
263696.3
39278.2
14.89
2000
622120
618728
617460
619436.0
240.3
0.39
4000
1241907
1202490
1135799
1193399.0
63636.0
4.49
8000
2472470
2644773
2151787
2423010.0
250187.0
10.32
3．3 精密度试验
按“标准曲线制备”项下方法配制低、中、高3个浓度的HCPT内酯血浆样品，每个浓度5个样本1日内连续测定，根据标准曲线，计算样品的测得浓度、SD和RSD%；同法配制3个浓度的HCPT内酯血浆样品，连续测定5天，每天连续测定2次，根据标准曲线，计算样品的测得浓度、SD和RSD%，精密度试验结果见表2。
表2. 精密度试验结果（n=5）
Tab.2 Results of HCPT of standard deviation in a day (n=5)
加入浓度（ng/mL）
日内精密度

检测浓度（ng/mL）
SD
RSD%

20
28.29
2.23
7.87

2000
2245.89
122.81
5.47

8000
9154.41
559.06
6.11

3.3.2 日间差 按“标准曲线制备”项下方法配制低、中、高3个浓度的HCPT内酯血浆样品，连续测定5天，每天连续测定2次，随行标准曲线，计算样品的测得浓度、SD和RSD%，求得测定方法的日间差，数据见表3。试验数据表明，生物样本的分析方法符合有关规范要求。
表3.标准曲线日间差考察（n=5）
Tab.3 Results of HCPT of standard deviation inter-day (n=5)
加入浓度（ng/mL）
检测浓度（ng/mL）
平均检测浓度
SD
RSD%
1
2
3
4
5
20
30.31
24.61
23.36
26.94
26.22
26.29
2.64
10.06
2000
2185.36
2528.71
2256.10
2142.50
2307.95
2284.12
150.82
6.60
8000
9205.20
9206.75
8222.12
7374.06
7234.12
8284.45
952.34
11.55
3．4 回收率试验 按“标准曲线制备”项下方法配制低、中、高3个浓度的HCPT内酯血浆样品，每个浓度测定5个样品，以测定浓度与配制浓度之比计算回收率，见表4。结果表明分析方法符合有关规范要求。
表4标准曲线回收率考察（n=5）
Tab.4 Recovery of HCPT of standard deviation (n=5)
加入浓度（ng/mL）
检测浓度（ng/mL）
回收率%
SD
RSD%
20.00
19.38
96.92
0.06
6.23
2032.00
2084.97
102.61
0.01
0.67
8128.00
8413.42
103.51
0.09
8.72
3.5 静脉注射纳米羟基喜树碱的药动学试验
参照《化学药品和治疗用生物制品研究指导原则（试行）》的有关内容，选择2.5~3.0 kg的日本大耳兔5只，按5.0 mg/kg剂量[1]一侧耳缘静脉推注进入HCPT纳米针。每只兔子均在实验前禁食12小时，称重后分别根据所在组剂量换算给药量，单剂量，并按规定时间（2 min，5 min，10 min，15 min，20 min，30 min，45 min，1 hour，1.5 hour，2 hour，4 hour，8 hour，12 hour，24 hour和36 hour）于另一耳缘静脉取血，按“血浆样品的处理”项下操作，代入相应标推曲线的回归方程计算血药浓度，数据见表5。将所得药物浓度-时间数据输入3p97药代动力学计算程序，首先根据主数据计算结果选择最佳房室模型和权重，然后对全部数据作批处理计算，确定药代动力学参数。综合分析比较后，认为而HCPT纳米针以三室模型和1/C2权重计算的药时曲线拟合最佳。药代动力学参数见表6。
表5家兔血浆药物浓度在各时间点检测结果（n=5）
Tab.5 Results of the drug concentration of HCPT in rabbit plasma in every time (n=5)
T(min)
2
5
10
15
20
30
45
60
90
120
240
480
720
1440
2160
平均浓度（ng/mL）
SD
5761.57
27.31
3477.35
129.22
1326.65
70.34
946.36
156.20
818.66
163.88
645.05
213.55
459.29
35.09
255.34
14.12
145.24
35.29
65.51
12.12
36.22
7.59
0
-
0
-
0
-
0
-
表6家兔单次静脉注射羟基喜树碱后的药动学参数
Tab.6 Pharmacokinetic parameters of HCPT in rabbit plasma

参数
数值
T1/2α(min)
17.578±14.564
T1/2β(min)
43.114±21.133
Vc(L/kg)
0.513±0.105
K21(L/min)
0.415±0.607
K12(L/min)
0.089±0.082
K10(L/min)
0.122±0.016
CL[L/(kg.min)]
0.062±0.009
AUC(min.μg/mL)
81.930±12.310
4 讨论
本研究考察的HCPT纳米针是利用纳米技术和材料将HCPT内酯包合成200 nm左右的颗粒，使其能在水中混悬并经静脉注射进入血液，从而保护了具有活性的HCPT内酯结构[2] 。另一方面，纳米颗粒进入血液循环后可能与血浆蛋白、糖蛋白等多种成分结合，进而作为异物被网状内皮系统(RES)，尤其是肝脏的Kupffer细胞所吞噬，致使肝脏药物浓度大大增加，从而达到靶向给药 。
考虑到HCPT在血浆中可能为闭环和开环两种结构并存[3]，导致两种异构的紫外最大吸收波长和保留时间都不同，我们对血浆样品进行酸化处理(pH4.0)并将样品避光环合2小时以上，使样品中的HCPT均还原成闭环内酯结构进行检测。
与文献[4]比较，HCPT 纳米针的血药浓度显著低于同剂量注射液。产生这一现象的因素可能存在于两个方面：1. HCPT纳米针的体内消除速度明显高于注射液，导致药物很快从体内排除；2. HCPT纳米针比注射液更快、更多的分布到组织器官内。进一步计算药动学参数结果表明：1. 纳米组中央室表观分布容积(Vc)均大于同剂量注射液，如果把中央室粗略的理解为血液和血液灌注充沛的组织器官，Vc就表示药物进入血液和这些组织器官中的量。纳米组Vc较大而血浆中药物量较少，提示药物可能更多的进入了组织器官；2. 纳米组消除半衰期（T1/2β ）较注射液延长，提示纳米针在体内存留时间更长。
对于HCPT纳米针是否确实较注射液更多地进入组织，需要通过进一步开展药物组织分布研究，对给药动物组织样本的实际检测加以证明。
参考文献:
[1]张志荣，路伟.肝靶向羟基喜树碱缓释毫微粒的研究[J].药学学报，1997，32（3）：222.
[2]HoRJY,Ting-BeallHP,RouseBT,etal.Kineticandultra2structuralstudiesofinteractionsoftarget-sensitiveimmuno2li2posomeswithHerpesSimplexVirus[J].Biochemistry,1988,27(1)B2850-2855.
[3]张力，李苏，廖海，等.羟基喜树碱I期药动学及人体耐受性临床研究[J].癌症，2001，20（12）：1391.
[4]陈军，方芸，黄莉莉，等.RP-HPLC法测定兔血浆中羟基喜树碱的浓度[J].广东药学院学报，2003，19（4）：319-321.