乳腺癌-基因治疗.docx

乳腺癌基因治疗之综述【摘要】乳腺癌是一种常见的妇科肿瘤，约占全身恶性肿瘤的7%10%，近20年来在我国的发病率逐渐升高，已严重威胁女性健康，仅次于宫颈癌。针对早期（、期）乳腺癌的治疗方法有外科手术切除、放疗、内分泌治疗以及使用抗肿瘤药物进行治疗（如紫杉醇、维甲酸类等），但对晚期乳腺癌的治疗效果不佳。由于肿瘤是一种多基因参与的分子疾病，基因治疗乳腺癌应能取得较好的疗效。基因治疗的方式有两类 ：（1）基因矫正和置换；（2）基因增补。目前研究的基因治疗方法主要有免疫基因治疗、癌基因拮抗治疗、化学基因治疗（多药耐药基因治疗和自杀基因治疗）、抗肿瘤血管形成基因治疗、使用溶瘤病毒的治疗等措施。关键词：乳腺癌、分子机制、癌基因拮抗治疗、抑癌基因治疗、免疫基因治疗、自杀基因治疗、多耐药基因治疗、抗肿瘤血管形成基因治疗、溶瘤病毒的治疗一、乳腺癌发病的分子机制乳腺癌的发生是以多个原癌基因在不同的时间和空间上，经不同途径激活或不同的抑癌基因失活为基础的多步骤过程。1、原癌基因的改变(1) HER-2（c-erbB-2,neu)大量研究结果表明c-erbB-2的扩增及蛋白表达与组织学分级、淋巴结转移度、死亡率、复发率呈正相关，与ER、PR的水平及患者生存期呈负相关，因此为临床提供了更有说服力的判断乳腺癌预后的指标Ras基因 乳腺癌组织与正常乳腺组织ras激活水平时发现过半数乳腺癌患者ras活性高于正常(2) C-myc基因 有25%的乳腺癌患者有C-myc基因表达的改变，主要是表达水平的异常增高，可能与乳腺癌的发展有关。Naidu1等发现C-myc基因的过度表达与缺乏雌激素受体和乳腺癌不良预后有关。2、抑癌基因的改变(1) P53，参与细胞周期和细胞增殖的调节，与乳腺癌的发生、发展关系密切，与乳腺癌组织细胞类型、分化程度、临床分期、术后复发有明显相关性。(2) BRCA-1， 抑癌基因BRCA-1 常存在突变，在大多数散发性乳腺癌中表达往往过低。(3) ING1 ，乳腺癌组织中ING1 mRNA的表达水平癌旁正常组织。ING1 mRNA表达水平低下可能与乳腺癌的发生有关。二、乳腺癌的基因治疗1 癌基因治疗癌基因参与细胞的生长与代谢，这些基因在正常情况下不表达或仅限量表达，当其被激活过表达时引起细胞癌变。目前研究表明，癌基因c-myc、erbB-2、bcl-2、成纤维生长因子等在乳腺癌中表达增高，它们的过表达与乳腺癌的发生发展密切相关。针对癌基因的治疗策略主要是抑制其表达。目前常用的方法有:( 1) 反义核苷酸、核酸或siRNA 阻止癌基因mRNA 转录和翻译。有研究表明，对乳腺癌细胞株MCF-7 转染ER-siRNA 48h 后，给予KGF( Keratinocyte growth factor)处理24h，结果显示siRNA 转染后ER- 的表达显著降低，KGF 介导的乳腺癌细胞的增殖也显著降低，同时提示ER- 的表达与KGF 介导的乳腺癌的增殖有关。( 2) 以显性负突变体干扰肿瘤细胞内信号转导。研究称在雌激素受体( + ) 的乳腺癌细胞中转入雌激素受体显性负突变体后能显著抑制乳腺癌细胞的生长。( 3) 使用细胞内抗体预先占据胞内定位系统，隔离胞内生长因子受体，从而阻止癌基因蛋白到达其适宜的细胞内靶位。2抑癌基因治疗 抑癌基因是指正常细胞内存在的、能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。目前已分离克隆的抑癌基因主要有p53、Rb、ERBA、WT1、DCC、MCC、APC、nm23、MTS、TIMP、FHIT、BRCA1和 BRCA2等。而以p53、FHIT、BRCA1和BRCA2等实验研究较多。现在常用的方法是以腺病毒为载体，将相应的抑癌基因转染乳腺癌细胞，抑制乳腺癌细胞的生长。p53基因是研究较为深入的一种，野生型可直接抑制DNA复制，使细胞出现G1期阻滞可调控细胞凋亡。乳腺癌患者中有 40%出现p53基因的缺失或突变。将野生型p53基因导入p53基因缺失或变异的乳腺癌细胞，可抑制肿瘤细胞的生长 ,促使肿瘤细胞凋亡。在家族性乳腺癌中发现的与其发病相关的抑癌基因 BRCA1常存在突变 ,在大多数散发性乳腺癌中表达往往过低。这一发现为将野生型BRCA1导入乳腺癌细胞，恢复BRCA1功能的基因修复治疗乳腺癌奠定了理论基础。目前有在乳腺癌动物模型中采用装有BRCA1的逆病毒载体 ,瘤内直接注射的方法，将 BRCA1用于晚期乳腺癌胸壁转移瘤的治疗。Fragile histidine triad（FHIT）基因定位于染色体 3p14.2，是一种新发现的抑癌基因。FHIT基因的大片段缺失常存在于包括乳腺癌在内的许多肿瘤中。研究表明用腺病毒转染 FHIT（Ad-FHIT）后，可激活 caspase-2并释放细胞色素 2，最终导致乳腺癌细胞凋亡。3 免疫基因治疗1.1细胞因子治疗 细胞因子调节多种细胞生理功能，是机体防御和清除肿瘤的重要因子。肿瘤的发生与肿瘤患者的细胞因子表达有关，因此, 通过细胞因子网络增强机体抗肿瘤免疫达到清除肿瘤的目的，一直是该领域研究的一个热点。（1）将细胞因子基因导入肿瘤细胞。将表达人源性肿瘤坏死因子（hTNF-）基因的质粒体外转染不同的乳腺癌细胞株（MDA-MB-361、HCT116、8-M G-BA）。检测结果表明hTNF-在3种细胞株中均有表达, 可显著诱导MDA-MB-361 凋亡、坏死，对HCT116 作用则较弱，而对8-M G-BA 几乎无作用。动物实验表明hTNF-可在裸鼠体内引起MDA-MB-361坏 死。研究发现 DISC-hGMCSF 能够高效转染人乳腺癌细胞，分泌GM-CSF; DISC-hGMCSF、在4T1 中可有效抑制肿瘤生长，与化疗药物联合使用时效果不受影响；（2）将细胞因子受体基因导入肿瘤细胞，使肿瘤细胞表面相应的细胞因子受体表达增多，从而将大大增强细胞因子的抗肿瘤效果。乳腺癌细胞表面表达 IL-13 受体2（IL-13R2） 后, 可提高其对 IL-13 的敏感性。将载有 IL-13R2 的质粒皮下注入乳腺癌荷瘤小鼠体内，再在鞘内注射 IL-13 进行干预，取得了显著的抗瘤效果，且对动物其它重要脏器无影响。病理结果显示，消退的瘤体内有大面积的组织坏死, 伴有巨噬细胞和NK 细胞的浸润。说明IL-13 对肿瘤的直接毒性作用和相关免疫反应的激活有关。1.2 将癌特异抗原基因导入抗原提呈细胞 BA46是乳腺癌相关抗原，存在于多数乳腺癌细胞膜表面,但造血细胞表面无此抗原。自身抗原不能刺激机体产生CTL 反应。实验将载有BA46 基因的重组腺相关病毒载体转染树突状细胞，实验结果表明树突状细胞可表达BA46 抗原；树突状细胞 基因组整合AAV/BA46/Neo 载体；可刺激机体产生强烈、迅速的BA46 抗原特异性、MHC-I限制性CTL 反应，但仅持续1周的时间；产生 IFN-T 细胞数量显著增多而产生IL-4T 细胞数量较低；树突状细胞高表达CD80 和CD86。实验将带有ErbB22neu 基因的腺病毒载体(AdNeuTK)转染树突状细胞，小鼠动物实验发现，经ErbB-2/neu 基因修饰的树突状细胞疫苗能诱导抗肿瘤免疫反应，与IL-12 联合应用抗肿瘤效果则更好。1.3 肿瘤疫苗治疗 目前应用于临床试验的肿瘤疫苗治疗有以下2种：（1）全肿瘤细胞疫苗 即采用转基因手段促进机体对肿瘤细胞的免疫反应。将编码促进免疫反应的细胞因子的基因直接在体内转染到肿瘤细胞内 。或在体外将这些基因转染到肿瘤细胞内，在肿瘤细胞经放射线照射灭活后自身移植于体内，以增强免疫反应。目前用于该方面研究的免疫增强细胞因子包括IL- 2，IL-12，干扰素、粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子(GM - CSF)等；（2）树突状细胞为基础的肿瘤疫苗 具有强烈抗原提呈功能的树突状细胞也是免疫治疗的靶目标，能够有效地将肿瘤抗原提呈传递给CD4+和CD8+细胞，活化特异的 CTLs。四、自杀基因治疗自杀基因疗法的机制有：（1）直接杀伤作用 即转染了前药转换酶基因的肿瘤细胞能将前药转变成细胞毒物质，从而直接杀伤肿瘤细胞；（2）旁观者效应（bystander effect）转染了自杀基因的肿瘤细胞被杀死，其周围大量未被转染的细胞也被杀死的现象称为旁观者效应。旁观者效应明显扩大了自杀基因的杀伤作用。由于基因载体系统在体内的转染效率很低，自杀基因在体内对肿瘤直接杀伤作用比较小，因而旁观者效应起着十分重要的作用。目前用于乳腺癌治疗的自杀基因体系主要有以下几种：（1）单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK)基因/更昔洛韦(GCV)系统 GCV 是阿昔洛韦的衍生物，在HSV-TK 的作用下转化为单磷酸GCV ,继而在哺乳类动物细胞激酶的共同催化作用下转化为细胞毒物质三磷酸 GCV。它可与三磷酸核苷竞争 DNA 多聚酶的结合位点，阻止单链 DNA 的延长，使细胞周期停滞在S期，抑制细胞分裂；（2）大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶基因/5-氟胞嘧啶系统 胞嘧啶脱氨基酶仅存在于细菌或真菌中，哺乳类动物细胞缺乏这种酶。该酶可使5-氟胞嘧啶转化为5-氟尿嘧啶，继而形成单磷酸5-氟脱氧尿苷。它是一种不可逆的胸腺嘧啶核苷酸合成酶抑制剂，使脱氧核苷三磷酸合成受阻从而抑制DNA 的合成；（3）水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-TK)基因/5-(2-溴乙烯)-2-脱氧尿苷（BVDU)系统 实验表明，VZV-TK可作为一个自杀基因，但要以BVDU作为前药。BVDU 三磷酸盐可结合到DNA链中，诱导单链断开。但BVDU 活化后的主要细胞毒性在于阻止细胞内胸核苷酸的合成，使脱氧尿苷（dUMP）转化成脱氧胸苷（dTMP）；（4）suface-tethered bacterial CPG2stCPG2(Q)3基因/4-(2-chloroethyl)、 CMDA系统 CPG2能将CMDA水解产生苯甲酸苯酚和苯胺氮芥，或能过自溶反应产生蒽环类抗肿瘤药，它的最大优点是产生的细胞毒物质为细胞周期非特异性药物。免疫组化试验显示，即使在仅含有很小一部分stCPG2(Q)3表达的细胞中，在前药 CMDA 治疗下大部分细胞凋亡，提示存在着巨大的旁观者效应。五、多药耐药基因治疗 多药耐药(MDR)是指肿瘤细胞接触一种抗癌药物产生耐药同时也对其他结构和作用机制不同的药物获得耐药。肿瘤细胞的多药耐药性及大剂量化疗的严重骨髓抑制是现阶段临床上化疗失败的主要原因。目前已分离了两种多药耐药基因: MDR1、MDR3, 其中MDR1 与肿瘤细胞典型多药耐药有关。它仅有一个开放性阅读框架, 可编码1280 个氨基酸的高度糖基化的跨膜蛋白P- 糖蛋白( P- gp) , 其中分子量为170 103, 故又称为p170。Taka- hashi 等在乳腺癌的MDR1 基因治疗临床研究中发现, 进展期乳腺癌和复发性乳腺癌患者行大剂量化疗的同时, 移植已转入MDR1 基因的自体同源外周干细胞,而后再用多西他奇化疗, 能明显抑制肿瘤生长改善预后, 无其他明显的不良反应。六、抗肿瘤血管形成基因治疗肿瘤的生长和转移是一个依赖于血管生成的过程。血管形成是包括内皮细胞的激活、增殖、迁移、血管基底膜的破坏、血管和血管网的形成，以及先前存在的血管网的连接等复杂过程。肿瘤血管生成是由肿瘤细胞和肿瘤浸润炎症细胞如巨噬细胞或肥大细胞产生的促血管生长因子所介导的。促血管生长因子是肿瘤生长所必需的，不少细胞因子与肿瘤血管形成密切相关，其中内皮抑素、血管抑素和干扰素d是目前研究的重点。人们利用各种基因治疗载体将抗血管生成因子包括内皮抑素、反义血管内皮细胞生长因子(VEGF) 、血管抑素和干扰素一仅等运送到体内，以期望抑制肿瘤的生长。Chen等用编码内皮抑素和血管抑素的质粒在体内有效地抑制了血管的生成，瘤内注射PCIEndo和PCIAngio能分别使肿瘤体积缩小36和49。Gyorfy等 分别使用鼠源性血管抑素和IL一12瘤内注射(AdAnglo和AdIL12)治疗乳腺癌动物模型，结果AdAngio显著抑制了肿瘤的生长，65 的肿瘤退化；AdIL一12引起20 肿瘤退化，l3 肿瘤完全消失。二者联合注射使96 的肿瘤退化，54 完全消失，并且提高了动物对再次接种的肿瘤细胞的免疫力。目前所知作用最强的促血管生长因子是VEGF，学者们正致力于研究开发VEGFVEGFR的抗血管生成潜力。张淑华等 通过RNAi抑制VEGF表达的抗血管生成疗法，也发现可以明显抑制乳腺癌细胞的增殖。7 应用溶瘤病毒的治疗溶瘤病毒不是靠携带外源基因转染肿瘤细胞杀伤肿瘤细胞，而是通过直接感染肿瘤细胞后“溶解”肿瘤细胞。常见的溶瘤病毒包括突变的腺病毒 ONYX-015(dl1520) 、HSV-1 突变体G207、人类逆转录病毒- 3、水泡性口炎病毒(VSV)和 EB 病毒等。为了提高溶瘤毒素的靶向性，将组织和肿瘤特异性启动子插入溶瘤病毒的基因组以控制基因表达。Hernandez 等将对低氧和雌激素反应的双特异启动子插入人类腺病毒-5型基因组的E1A 和E4 区，利用该系统构建了AdEHT2 和AdEHE2F，从而杀死低氧条件和雌激素受体阳性的乳腺癌细胞。同理，因端粒反转录酶和E2F-1启动子在肿瘤细胞中常被激活，将其分别插入AdEHT2和AdEHE2F的E4 区，能杀伤肿瘤细胞。八、面临的问题和前景展望目前, 乳腺癌基因治疗尚存在以下问题: (1) 用于研究和临床的基因转染方法有多种, 但转染效果仍不令人满意。腺病毒所携带的基因不整合到宿主细胞的染色体上, 且具有较高的转染率但表达不稳定; ( 2) 缺乏特异性和高效性载体。若仅部分肿瘤细胞被导入基因, 治疗效果会受到影响, 而载体特异性差则会导致癌旁组织及骨髓等其他重要组织被累及。 (3) 容易复发旁观者效应虽有助于进一步杀死肿瘤细胞, 但其又有选择性及局部区域性。不能保证所有肿瘤细胞都能被杀死, 经丙氧鸟苷治疗, 肿瘤消退后停药, 则肿瘤又迅速复发; (4) 寻找更为有效的目的基因; (5) 基因治疗及与其它治疗方法联合应用有待完善。随着乳腺癌基础研究的不断深入和分子医学的不断完善，相信在未来几年乳腺癌基因治疗的研究将会取得更大的进展，彻底治愈乳腺癌也将成为可能。10