mmlv逆转录酶改造小结.docx

逆转录pcr是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。由一条RNA单链转录为互补cDNA称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。对于检测试剂来说，灵敏性非常重要。逆转录pcr过程中，RNA存在二级结构将严重影响反应的灵敏性。
提高逆转录pcr灵敏性的方法很多。可以通过提高逆转录酶的反应温度，使RNA二级结构打开，利于引物结合，并能减少非特异性扩增。可以通过去除逆转录酶的RNAseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链，不利于逆转录的进行。还可以通过添加促进逆转录的添加剂。
莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶是逆转录pcr常用的酶。由671个氨基酸组成，分子量约为75000道尔顿。分子空间结构包括5部分：手指区、手掌区、拇指区、连接区、RNAse H活性区。手指、手掌包括24-275号氨基酸. 拇指区和连接区分别是 276-361和362-474号氨基酸。手指区提供模板-引物结合位点，拇指区与底物结合同时提供持续合成的能力；连接区连接RNAse H活性区与拇指区，维持二者间构象的弹性。
去除RNAse H活性区（H− MMLV RT），不影响逆转录酶活性，并且具有更好的热稳定性。Asp524→Ala, which is known to abolish the RNase H activity and increase the stability.要进一步提高H− MMLV RT的反应温度，可以通过突变的方法。某些突变可以提高H− MMLV RT的最适反应温度是因为这些突变提高了酶与模板-引物的结合能力。改变酶的带电性，增加正电荷，可以有效提高这种结合能力。已报道的突变点有Glu69, Gln84, Asp108, Asp114, Glu117, Glu123, Asp124, Glu286, Glu302, Trp313, Leu435, and Asn454。其中E69K,E302R, W313F,L435G,N454K （H− M5）在55℃下保持30min仍然有50%的活性。文献报道现在可以达到的最高的逆转录温度是60℃，但突变位点没有公开。另，作为商品出售的mmlv逆转录酶逆转录温度达到70℃。
海藻糖可以保护H− MMLV，但是有效浓度是0.6M，对pcr有抑制作用。
Tth聚合酶在Mn2+存在条件下可以作为逆转录酶，但是特异性很差。
添加促进逆转录的添加剂，如二甲基亚砜，可以使RNA的二级结构打开，且不影响MMLV逆转录酶的活性，但浓度高于2%会使Taq酶的扩增出现非特异性。甘油可以提高H− MMLV 逆转录酶的热稳定性，但对pcr有抑制作用。
Invitrogen公司生产的SuperScript® III 反转录酶在 50℃ 下活性最高，可增特异性提高扩增效率。SuperScript® VILO™ cDNA合成试剂盒通过平衡 逆转录酶、RNase 抑制剂、和加入的专有辅助蛋白，提高灵敏度以及cDNA产量，同时对下游 qPCR 的抑制作用更少。

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