gateway重组技术.docx

  Gateway也可以被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。
     Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
    在Gateway系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1和attL2，大小均为100bp，中间夹着一个自杀基因——ccdB基因。由于ccdB基因的表达产物能抑制普通的E.coli生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因，接入目的基因。ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限（2个），同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题因此Gateway系统提供了5种不同的入门载体以供选择。需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含F附加体的，因为它表达的一种产物能阻断ccdB基因，影响筛选结果。

    同样，目的载体（Destination Vector）也必须和Gateway系统配套，即目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1和attR2，大小均为125bp，同样也夹着一个ccdB自杀基因。
    当需要将目的基因从入门载体（Entry Vector）转移到目的载体（Destination Vector）时，只要将两种质粒混合（线性化能有效提高重组率），加入含有Int、IHF、Xis等重组因子的LR重组酶混合物，attR2序列和attL2序列发生重组，生成一个融合质粒。attL1序列再和attR1序列重组，融合质粒分解为两个新的质粒，目的基因与原来位于目的载体上的自杀基因发生重组置换，得到一个带目的基因的目的载体（生成新的重组位点attB1、B2）和带自杀基因的入门载体（生成新的重组位点attP1、P2）。反应过程需要25度保温1小时（时间越长，重组率越高，特别是较大的质粒，反应过夜能提高5倍重组效率），蛋白酶K37度处理10分钟，转化。由于带自杀基因的载体不能生长，加上抗生素筛选，转化产物重组率高达90%以上。同样，转化用的菌株必须是不含F附加体的。
      由于在这个反应中attL1序列只和attR1序列重组，attL2序列只能与attR2序列重组，这个方向的反应称为LR反应。LR反应生成新的位点称为attP1/2（200bp）和attB1/2（25bp）序列。 在一定的条件下，attP和attB序列也能发生重组，生成attL和attR序列，这个反向反应称为BP反应。
      当用户得到一个含目的基因的Gateway表达载体，希望将目的基因转移到另外几个Gateway表达载体中时，只要先将目的基因从Gateway表达载体中转移到入门载体上，在由入门载体转移到其它的表达载体就行。将含目的基因的Gateway表达载体（attB1—目的基因—attB2序列）与带有attP1-ccdB(自杀基因)-attP2序列的供体载体（pDONR，注意这个载体不同于入门载体Entry Vector）混合，加入含有Int、IHF的BP重组酶混合物，25度保温1小时，37度蛋白酶K处理10分钟，根据与上面相同的原理，attP和attB序列也能发生重组，生成带有目的基因的入门载体（Entry Vector）和带自杀基因的表达载体。同样，由于抗性不同以及自杀基因的作用，只有含目的基因的入门载体能被筛选出来。这即是BP反应。需要特别注意的是表达载体如果也是卡那霉素抗性，就必须选择另外一个供体质粒以便筛选。
    使用Gateway系统的第一步即为入门载体的构建，有以下几种方法：
    A PCR重组克隆
     以下列方式合成PCR引物，即GGGG-attB1或者attB2序列（25bp）-基因特异性序列（18到25个碱基或以上），这样在PCR扩增目的基因时就可以直接得到两端带有attB1/2基因的片断。将PCR产物直接与上述的供体载体（带有attP1-ccdB(自杀基因)-attP2序列）混合，加入BP重组混合酶，25度保温1小时，再37度蛋白酶K处理10分钟，即可转化并得到带有目的基因的入门载体。当然，这个产物最后是需要测序鉴定的，并且，克隆到入门载体的基因不能表达，所以不能用抗体筛选检测。还有一点值得注意的是，由于attB1的末端（第25个碱基）是T，所以跟在后面的基因特异性序列的头两位碱基不能是AA、AG和GA以免提前出现终止密码。得到的入门克隆中，目的基因两侧具有attL重组位点，可以与任何Gateway™目的载体进行重组。
    B 限制性内切酶消化

     作为PCR克隆的替代方法，有5种Gateway™入门载体可以使用传统的限制酶切和连接的方法产生入门克隆。这些载体配合合适的目的载体，可以用于表达天然蛋白或带有N端或C端融合标签的重组蛋白。为了在真核细胞中有效地翻译蛋白，所有的5个Gateway™入门载体提供了Kozak 序列。此外，pENTR™11提供了SD (Shine-Dalgarno)序列，便于在大肠杆菌中有效的翻译。
      C Gateway™改造过的cDNA文库

    如果您已经有了用Gateway兼容载体构建的cDNA文库，您就可以通过pDONRTM载体和BP ClonaseTM酶混合物进行一个简单的重组反应，很容易地把单个克隆转换成Gateway™入门克隆。这样就不再需要亚克隆和测序，为您节约数小时的时间。SuperScript cDNA文库使用pCMV·SPORT（登录获得更多信息）构建，有几种的人组织来源可供选择，这些文库有很大一部分是全长的插入片段，可以完全代表来源mRNA。

GATEWAY技术：
Gateway克隆技术是invitrogen的专利，基于lambda噬菌体的位点特异性重组反应，在目的片段两端添加重组位点，将PCR产物与含重组位点的目的载体混合重组反应便可直接转化筛选重组克隆，与经典克隆多个步骤相比，该方法只需一步生化反应便能达到目的，是高通量克隆基因的好方法，缺点是通用性不如经典克隆强，对于本身含有重组类似或保守序列的片段或结构复杂的片段应用此法可能会受影响。

摘要： Gateway技术提供以下可能： 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间 同时将您的基因转移到多个表达系统 在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达 一、一种更好的克隆方法 Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达
Gateway技术提供以下可能： 通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间
 同时将您的基因转移到多个表达系统
 在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达
一、一种更好的克隆方法
Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。
图1 Gateway技术的灵活性

目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。
Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。
此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。
二、一项强大而可靠的技术
Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。
Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
表1 反应和术语总结
反 应
反应位点
产 物
产物结构
BP反应
attB×attP
入门克隆
attL1-基因-attL2
LR反应
attL×attR
表达克隆
attB1-基因-attB2

图2 Gateway技术总结

在BP反应中基因转移形成入门克隆，在LR反应中入门克隆可以作为反应物产生最终的表达克隆。
完成构建Gateway表达克隆仅需两步（图2）：
（1）创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。
（2）混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表达克隆。（表达克隆用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析。）
有几种方法可以构建Gateway入门克隆。无论您选择何种方法，创建的入门克隆都是准备用来与各种目的载体进行重组。
（1）PCR克隆（定向TOPO克隆至入门载体或与供载体B×P重组）
（2）限制性内切酶消化和连接进入入门载体
（3）使用pCMV?SPORT6或pEXP-AD502*构建Gateway兼容cDNA文库
（4）Gateway改造过的克隆资源*
* 这些克隆资源和cDNA文库两边加有attB位点。这些克隆可以通过与供载体及BP Gateway酶反应转换到入门载体。获得已有克隆资源的更多信息。
三、PCR定向（PCR-Directional）TOPO克隆
定向TOPO克隆使得克隆PCR产物和其它的DNA分子更加快速和有效。进行5分钟的简单连接，产生>90%的重组子。您不仅会比用连接酶介导的方法更快的获得克隆，而且可以节省因第一次无结果而重复试验所额外浪费的时间。
定向TOPO克隆提供高效的一步法克隆策略，可以定向克隆平端PCR产物到入门载体。平端PCR产物定向克隆的效率>90%，从而简化了筛选。同时不再需要连接酶、PCR后续步骤或者限制性内切酶。
目前有两种定向TOPO克隆载体。pENTR/D-TOPO 和pENTR/SD/ D-TOPO（表2和图3）有以下特点：
 位于PCR产物插入位点两侧的attL重组位点可以与Gateway目的载体进行有效重组
 通用M13位点便于测序
 基于pUC的ori位点提供高产量质粒
 大肠杆菌中卡那霉素（kanamycin）抗性基因筛选
表2 两种pENTR/D-TOPO载体的简单比较 
入门载体
特 点
优 点
pENTR/D-TOPO
无SD （Shine-Dalgarno）位点
真核细胞中天然、N-或C-端融合；大肠杆菌中N-端融合；如果基因包含有SD序列，可在大肠杆菌中进行C-端或天然蛋白表达
pENTR/SD/ D-TOPO
含SD （Shine-Dalgarno）位点
包含基因10和一个SD序列，可以有效的启动天然蛋白和融合蛋白在大肠杆菌中的表达

图3 Gateway定向TOPO克隆

四、构建入门载体的各种选择
1、限制性内切酶消化
作为PCR克隆的替代方法，有5种Gateway入门载体可以使用传统的限制酶切和连接的方法产生入门克隆。这些载体配合合适的目的载体，可以用于表达天然蛋白或带有N端或C端融合标签的重组蛋白。为了在真核细胞中有效地翻译蛋白，所有的5个Gateway入门载体提供了Kozak 序列。此外，pENTR11提供了SD （Shine-Dalgarno）序列，便于在大肠杆菌中有效的翻译。
2、PCR重组克隆
重组是从PCR产物创建Gateway入门克隆的另一种方法。这种方法是通过合并attB位点到上游和下游引物上，然后共同孵育PCR扩增产物和pDONR载体（包含attP位点）以及Gateway BP Clonase酶混合物。接着转化进大肠杆菌中您将会获得包含目的基因的入门克隆，同时目的基因两侧具有attL重组位点。这个入门克隆可以与任何Gateway目的载体进行重组（参看图2）。
3、Gateway改造过的cDNA文库
如果您已经有了用Gateway兼容载体构建的cDNA文库，您就可以通过pDONR载体和BP Clonase酶混合物进行一个简单的重组反应，很容易地把单个克隆转换成Gateway入门克隆。这样就不再需要亚克隆和测序，为您节约数小时的时间。
SuperScript cDNA文库使用pCMVSPORT构建，有几种人组织来源可供选择，这些文库有很大一部分是全长的插入片段，可以完全代表来源mRNA。
4、入门克隆的切入点——克隆资源
您可以从与10000个人类基因相关的35000个克隆中进行选择，这些克隆的70%以上是全长序列的。这些克隆来源于使用特殊的高级cDNA文库构建技术、oligo dT引物以及SuperScript II 反转录酶所构建的文库。许多克隆来源于I.M.A.G.E.协会，NCI CGAP 项目，ResGen库或UltimateORF库。
克隆资源因为已克隆到Gateway改造过的载体，所以可以快速地将基因转到各种表达系统中。
图4 进入Gateway系统的各种路线

* 目前的克隆资源带有attB位点，需要与pDONR质粒重组
五、触手可及的最高级表达系统
一旦您构建好Gateway入门克隆，蛋白表达和分析的大门就会向您敞开。使用Gateway技术，您可以进入到几乎是无数种的表达系统。因为没有一个单一的表达系统蛋白适合于每一种蛋白，优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析您的蛋白（图5）。
图5 在Gateway系统表达全长开放阅读框

大肠杆菌GUS基因、人类MAP4和Eif-4E基因平行转移进目的载体，在Sf9昆虫细胞（杆状病毒）或大肠杆菌BL21-SI菌株表达天然蛋白、N-端His或N-端GST融合蛋白。在所有的系统中均观察到GUS良好的表达，而MAP4只在昆虫细胞中表达，Eif-4E只在大肠杆菌中表达。在Hartley， J.L.et al. (2000) Genome Research 10(11):1788-95 可以找到更多的细节。
为了扩展表达的选择，Invitrogen 已将Gateway技术合并到部分最高级的表达系统中。无论您选择哪个系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――都可以获得Gateway目的载体。此外，你可以很容易地把您自己最称手的表达载体转换成Gateway目的载体。