H9流感抗原性及免疫原性分析20120222.doc

第一章 引言
1 流感概述
流感病毒（influenza virus）属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），流感病毒属，具有囊膜的分节段负链RNA病毒。病毒内部由单链核糖核酸和核蛋白组成，根据核蛋白(NP)和基质蛋白（M）的抗原性不同，分为A、B和C三种类型，它们之间的抗原差异可以通过可以通过琼脂扩散试验验证。三种类型的病毒由于在结构方面存在较大差异，致病性方面也有不同。
1.1
第二章 27株流感病毒的免疫原性分析
1 材料与方法
1.1病毒分离株
27株H9N2流感病毒分离株均由上海兽医研究所流感实验室鉴定并保存。病毒具体信息见表1
表1 27株H9N2流感病毒分离表
采样地点
病毒名称
采样地点
病毒名称
上海
Ck-Shanghai-1-06
广东
Ck-Guangdong-1214-09
Ck-Shanghai-2-04
Ck-Guangdong-1258-09
Ck-Shanghai-4-06
Ck-Guangdong-1351-09
Ck-Shanghai-5-03
Ck-Guangdong-1494-09
Ck-Shanghai-6-03
Ck-Guangdong-1683-09
Ck-Shanghai-50-09
江苏
Ck-Jiangsu-825-09
Ck-Shanghai-96-09
Ck-Jiangsu-925-09
Ck-Shanghai-169-09
湖南
Ck-Hunan-2106-09
Ck-Shanghai-340-09
Ck-Hunan-2230-09
Ck-Shanghai-441-09
Ck-Hunan-2351-09
Ck-Shanghai-510-09
山东
Ck-Shandong-2552-09
安徽
Ck-Anhu-1-10
Ck-Shandong-2567-09
吉林
Ck-Jilin-3-09
福建
Dk-Fujian-1753-09
F株
Vaccine

1.2 SPF鸡胚和SPF鸡
SPF鸡胚购自北京梅里亚公司，SPF鸡饲养于负压隔离其中。
1.3 H9N2流感病毒的鉴定
血清学鉴定：流感病毒分离阳性血清H3、H4、H5、H9和H10标准阳性血清由本实验室制备并保存。
PCR鉴定：在所收集的尿囊液有血凝，而不能和标准阳性血清进行中和反应的毒株，分别提取尿囊液RNA，反转录形成cDNA后用流感病毒的PCR方法进行鉴定。
1.4 H9N2流感病毒的有限稀释法纯化及EID50测定
实验用27株H9流感病毒分别应用有限稀释法进行纯化，方法：吸取病毒尿囊液50μl加入到含青霉素1000U/ml，链霉素1000U/ml的450μl PBS中，依次进行10倍比稀释，然后以不同稀释倍数的病毒液接种9～11日龄SPF鸡胚，每枚100μl，平行3胚。接毒后鸡胚继续孵化箱中孵育48h后测定血凝，收取并保存最高稀释倍数具有最高血凝价的鸡胚尿囊液，用于下一轮纯化。如此连续经过3次纯化后，把最后收取的尿囊液105稀释，再次以100μl接毒SPF鸡胚，48h收取尿囊液，混匀后分装-80℃保存，分装的H9病毒液经鉴定无污染后用于后续实验。
为防止传代过程中H9流感病毒传代丢失及出现杂病毒的情况，实验中对每一次收取的尿囊液进行了血凝学及PCR鉴定，准确无误后用于下一轮纯化。
EID50测定：吸取分装病毒尿囊液50μl加入到含青霉素1000U/ml，链霉素1000U/ml的450μl PBS中，依次进行10倍比稀释，然后以不同稀释倍数的病毒液接种9～11日龄SPF鸡胚，每枚100μl，平行3胚。接毒后鸡胚继续孵化箱中孵育48h后测定血凝，根据Reed-Muench方法计算EID50结果。
1.5 H9N2流感病毒血清的制备
选择经纯化的25株H9N2流感病尿囊液，以终浓度0.3%甲醛灭活24h，然后以3：7的关系和疫苗用油乳剂剧烈震荡混合制作灭活疫苗。经滴水检验合格后，以0.5 ml/只 颈部皮下免疫4周龄SPF鸡。第21天颈部处死所有SPF免疫鸡，收集血清，分装后于-20℃保存。
1.7 H9N2流感病毒血凝抑制实验
用25株H9N2流感病毒和25种制备的对应阳性血清分别交叉进行血凝抑制反应。实验用体积浓度为0.5%的红细胞，配制的病毒抗原为8～16单位。此实验重复两次。
1.8 代表抗原性差别“r”值的计算
“r”值计算方法参照《动物病毒学》第二版第723页，“r”值代表两毒株之间的抗原差异，等于1表示两毒株抗原性相同，随着值的增加两毒株的差异愈大，亦抗原的相关性愈小，当值大于4时，表示两毒株抗原差异性显著。
1.9 H9N2流感病毒中和实验
测定27株H9N2流感病毒HA基因序列，对1683bp长度的开放阅读进行遗传进化树分析后，选取各分支中的11株病毒进行鸡胚中和实验。
病毒配制：在无菌条件下，用4℃保存的含有青霉素1000U/ml，链霉素1000U/ml的PBS分别稀释11株流感病毒，使病毒含量为100EID50/100μl，冰上保存。
血清配制：吸取11株流感病毒的阳性血清7.5μl加入到装有1495μl PBS的2ml EP管中，混匀后，吸取以上液体400μl与400μl PBS混合，以实现2倍比稀释，按照以上步骤依次进行2倍比稀释，使血清实现200、400、800、1600和3200倍稀释。
中和过程：吸取配置好的100EID50/100μl的病毒液400μl依次加入不同稀释倍数的400μl血清中，上下颠倒混匀后，将混合液于37℃静置1h，期间混合液上下颠倒混匀2次，以实现病毒和血清更好结合，之后取出置于冰上。
接胚：将37℃恒温箱中取出的液体接种9～11日龄鸡胚，每胚200μl，平行3胚，鸡胚37℃孵化箱中继续孵育48h后，检测并记录血凝结果，根据Reed-Muench方法计算血清对100EID50病毒的半数中和效价。
1.10 代表血清抑制性差别“R”值的计算
“R”值计算方法参照《动物病毒学》第二版第723页方法略作修改。“R”值代表两血清之间的差异，等于1表示两血清对抗原具有相同的抑制效果，随着值的增加血清抑制效价差异愈大，当值大于4时，表示两血清差异性显著。
2 结果
2.1 27株H9N2流感病毒EID50测定结果
在结果中采用了EID50/100μl的记录方式，其中数值分布于7.75～9.50之间，其中Ck-Jiangsu-925-09最高，Ck-Anhu-1-10最低。具体见表2
表2 27株H9N2流感病毒EID50测定结果
病毒编号
EID50/100μl
病毒编号
EID50/100μl
Ck-Jiangsu-825-09
8.75
Ck-Shanghai-5-03
8.50
Ck-Jiangsu-925-09
9.50
Ck-Shanghai-6-03
9.25
Ck-Guangdong-1214-09
9.25
Ck-Shanghai-50-09
8.50
Ck-Guangdong-1258-09
8.75
Ck-Shanghai-96-09
8.50
Ck-Guangdong-1351-09
8.75
Ck-Shanghai-169-09
8.50
Ck-Guangdong-1494-09
9.25
Ck-Shanghai-340-09
9.50
Ck-Guangdong-1683-09
8.50
Ck-Shanghai-441-09
9.50
Dk-Fujian-1753-09
8.75
Ck-Shanghai-510-09
9.25
Ck-Hunan-2106-09
9.25
Ck-Hunan-2351-09
8.50
Ck-Hunan-2230-09
8.25
Ck-Shandong-2552-09
9.25
Ck-Shanghai-1-06
8.75
Ck-Shandong-2567-09
8.75
Ck-Shanghai-2-04
8.25
Vaccine
8.75
Ck-Jilin-3-09
8.25
Ck-Anhu-1-10
7.75
Ck-Shanghai-4-06
8.25

2.2 H9N2抗原性结果
通过交叉血凝抑制结果可以看出，我国2009～2010年间流行的H9N2流感病毒和2006年及以前的抗原性，发生了明显的差异，其中Ck-Shanghai-2-04、Ck-Shanghai-4-06、Ck-Shanghai-5-03、Ck-Shanghai-6-03及Vaccine和新近分离的H9N2流感病毒制备的阳性血清血凝抑制值明显较2009～2010年分离株之间产生的低，而新近分离的病毒阳性血清间，具有良好的血凝抑制反应（假定血清中，每种灭活病毒刺激机体产生的抗体含量相同）。具体见表3
通过“r”值的计算结果可以看出，25株流感病毒大致可以分为2个抗原群，其中Ck-Shanghai-6-03和剩余24株病毒的“r”值差别很大，大部分表现为“r”≥4，独自归为一个抗原群。其余24株病毒“r”值差别不明显，大部分表现“r”≤4，可归为一个抗原群具体见表4
在划分的第二个抗原群中，2009～2010分离的病毒除Ck-Guangdong-1214-09外，和实验中早年分离毒株存在一定的抗原差异。有趣的是Ck-Shanghai-4-06是个例外，此病毒和所有的实验病毒抗原差异均不明显。
在实验病毒中，Ck-Shanghai-441-09既能对2009～2010年病毒分离株产生理想的血凝中和效果，也能有效中和早年分离的病毒，可做为现实疫苗生产的候选疫苗毒株。
2.3 H9N2中和实验结果
通过HA基因遗传进化树的分析结果（后续实验），在鸡胚上进行了中和实验，结果见表5，通过“R”值的计算可以看出血清对病毒中和的效果大致可分为3类，第一类，包括3株病毒，分别为Ck-Shanghai-441-09、Ck-Hunan-2230-09和Dk-Fujian-1753-09，第二类，包括6株病毒，分别为Ck-Jilin-3-09、Ck-Guangdong-1258-09、Ck-Guangdong-1494-09、Ck-Shanghai-1-06、Ck-Guangdong-1214-09和Ck-Shanghai-2-04。第三类，包括2株病毒，分别为Vaccine Ck-Shanghai-6-03。
在“R”值大小的关系角度看，第一类血清之间差异极小，第二类血清间较第一类之间差异大，第三类血清之间差异较第二类之间更大。第一类和第二类之间血清差异存在不确定性，有大有小，同样第二类和第三类之间也存在不确定性，但第一类和第三类血清之间血清的中和效果存在明显的差异。具体结果见表6
由于第一类血清相对于其它组血清对病毒具有更好的中和效果，可以候选作为疫苗生产的候选毒株组。

表3：25株H9N2流感病毒的交叉血凝抑制结果
病毒
血清
Ck-Jiangsu-825-09
Ck-Jiangsu-925-09
Ck-Guongdong-1214-09
Ck-Guangdong-1258-09
Ck-Guangdong-1351-09
Ck-Guangdong-1494-09
Ck-Guangdong-1683-09
Dk-Fujiang-1753-09
Ck-Hunan-2106-09
Ck-Hunan-2230-09
Ck-Shanghai-1-06
Ck-Shangha-2-04
Ck-Jilin-3-09
Ck-Shanghai-4-06
Ck-Shanghai-5-03
Ck-Shanghai-6-03
Ck-Shanghai-96-09
Ck-Shanghai-169-09
Ck-Shanghai-340-09
Ck-Shanghai-441-09
Ck-Shanghai-510-09
Ck-Hunan-2351-09
Ck-Shandong-2552-09
Ck-Shandong-2567-09
Vaccine
Ck-Jiangsu-825-09
13
13
11
14
14
14
14
11
13
12
10
10
10
8
7
9
13
15
13
13
12
12
12
12
10
Ck-Jiangsu-925-09
14
15
15
15
16
15
12
12
14
14
11
11
12
9
8
10
15
16
13
15
15
16
12
13
11
Ck-Guongdong-1214-09
11
14
15
13
15
14
13
13
15
14
10
8
10
7
7
7
13
13
12
14
13
12
12
12
8
Ck-Guangdong-1258-09
14
15
16
15
15
15
15
13
15
14
10
8
9
6
5
9
14
16
13
14
13
14
14
14
8
Ck-Guangdong-1351-09
13
14
13
15
15
14
13
13
14
13
10
7
9
5
5
8
14
13
12
12
12
11
12
11
7
Ck-Guangdong-1494-09
14
15
15
15
15
15
14
13
15
14
12
8
13
10
8
9
12
12
10
13
15
12
12
12
8
Ck-Guangdong-1683-09
14
13
14
14
15
14
14
13
13
13
10
11
9
9
7
8
14
14
13
13
13
12
11
10
11
Dk-Fujiang-1753-09
14
15
15
15
14
15
14
14
15
15
9
10
9
8
8
11
13
16
14
14
15
13
13
13
10
Ck-Hunan-2106-09
12
14
14
15
15
15
14
13
15
15
9
7
9
6
7
7
12
16
13
12
11
11
12
11
7
Ck-Hunan-2230-09
11
12
12
13
13
14
12
13
13
15
9
9
10
6
6
7
14
12
12
12
11
12
12
11
9
Ck-Shanghai-1-06
15
15
15
16
16
15
13
14
16
16
14
10
13
9
8
9
15
15
13
14
14
14
14
14
10
Ck-Shangha-2-04
12
13
14
13
13
14
11
13
13
13
12
11
10
9
8
9
13
13
12
12
12
10
11
11
11
Ck-Jilin-3-09
14
14
15
15
15
15
14
14
15
16
10
10
10
8
7
9
14
13
12
13
13
13
14
14
10
Ck-Shanghai-4-06
15
15
16
16
16
16
15
14
15
16
12
12
12
10
11
12
15
14
13
13
14
14
14
14
12
Ck-Shanghai-5-03
14
13
15
14
14
14
13
12
13
14
11
11
11
10
9
10
14
14
11
12
13
12
12
13
11
Ck-Shanghai-6-03
13
14
12
14
14
14
13
13
14
14
9
11
11
9
8
13
14
13
12
12
13
12
12
12
11
Ck-Shanghai-96-09
14
14
16
16
16
16
14
16
16
16
10
10
11
9
8
10
15
15
14
13
14
14
14
13
10
Ck-Shanghai-169-09
14
15
16
16
16
16
15
16
15
16
12
11
12
8
8
11
15
15
13
14
14
15
14
14
11
Ck-Shanghai-340-09
13
13
14
14
14
14
13
13
13
14
9
10
10
7
8
11
13
13
12
12
12
12
13
12
10
Ck-Shanghai-441-09
14
16
16
16
16
15
16
14
15
16
11
11
11
8
8
11
15
14
13
14
13
13
14
14
11
Ck-Shanghai-510-09
14
15
15
15
16
15
14
15
14
15
10
10
10
7
6
10
13
16
14
13
15
14
13
13
10
Ck-Hunan-2351-09
14
15
15
15
16
16
16
14
15
16
10
11
10
8
8
9
14
16
13
13
14
14
14
14
11
Ck-Shandong-2552-09
13
14
15
15
15
14
14
13
14
14
9
10
12
8
8
10
14
15
12
13
14
12
12
11
10
Ck-Shandong-2567-09
13
15
15
15
15
15
14
13
15
15
10
9
10
7
6
8
14
16
12
13
13
13
8
12
9
Vaccine
12
13
13
14
14
16
13
13
15
13
9
11
11
8
8
6
13
12
12
12
13
12
12
12
11
表4：25株H9N2流感病毒的抗原“r”值结果
病毒
血清
Ck-Jiangsu-825-09
Ck-Jiangsu-925-09
Ck-Guongdong-1214-09
Ck-Guangdong-1258-09
Ck-Guangdong-1351-09
Ck-Guangdong-1494-09
Ck-Guangdong-1683-09
Dk-Fujiang-1753-09
Ck-Hunan-2106-09
Ck-Hunan-2230-09
Ck-Shanghai-1-06
Ck-Shangha-2-04
Ck-Jilin-3-09
Ck-Shanghai-4-06
Ck-Shanghai-5-03
Ck-Shanghai-6-03
Ck-Shanghai-96-09
Ck-Shanghai-169-09
Ck-Shanghai-340-09
Ck-Shanghai-441-09
Ck-Shanghai-510-09
Ck-Hunan-2351-09
Ck-Shangong-2552-09
Ck-Shandong-2567-09
Vaccine
Ck-Jiangsu-825-09
1.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Jiangsu-925-09
1.4
1.0
-
-
-
-

-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Guongdong-1214-09
8.0
1.4
1.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Guangdong-1258-09
1.0
1.0
1.4
1.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Guangdong-1351-09
1.4
1.0
2.0
1.0
1.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Guangdong-1494-09
1.0
1.0
1.4
1.0
1.4
1.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Guangdong-1683-09
0.7
4.0
2.0
1.0
1.4
1.4
1.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Dk-Fujiang-1753-09
2.0
2.0
1.4
1.4
1.4
1.4
2.0
1.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Hunan-2106-09
2.8
2.0
1.4
1.0
1.4
1.0
2.0
1.4
1.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Hunan-2230-09
5.6
4.0
4.0
2.8
4.0
2.0
4.0
1.4
2.0
1.0
-
-
-
-
-
-

-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Shanghai-1-06
2.0
2.8
4.0
2.8
2.8
2.0
5.6
5.6
4.0
4.0
1.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Shangha-2-04
2.0
2.0
4.0
5.6
8.0
4.0
2.8
2.0
8.0
4.0
2.8
1.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Jilin-3-09
0.7
1.4
1.0
1.4
1.4
035
1.4
1.4
1.4
0.7
1.4
1.4
1.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Shanghai-4-06
1.0
2.0
2.0
2.8
4.0
0.7
1.0
2.0
4.0
2.8
2.8
1.0
1.0
1.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Shanghai-5-03
1.4
4.0
2.0
5.6
5.6
2.0
2.8
2.8
4.0
4.0
4.0
1.4
1.4
0.5
1.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Shanghai-6-03
4.0
4.0
22.4
5.6
8.0
5.6
8.0
2.8
11.2
11.2
22.4
4.0
2.8
2.0
4.0
1.0
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Shanghai-96-09
1.4
1.4
1.4
1.0
1.0
2.0
1.4
1.0
2.0
1.0
4.0
2.8
1.0
1.4
2.0
4.0
1.0
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Shanghai-169-09
0.7
0.7
1.4
0.5
1.4
2.0
1.0
0.35
0.7
2.0
2.0
2.0
1.0
2.8
2.0
4.0
1.0
1.0
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Shanghai-340-09
0.7
1.4
1.4
1.0
1.4
2.8
1.0
0.7
1.4
1.4
4.0
1.4
1.0
2.0
2.0
2.0
1.0
1.4
1.0
-
-
-
-
-
-
Ck-Shanghai-441-09
1.0
0.5
0.7
0.7
1.4
1.4
0.7
1.0
2.0
1.4
2.8
2.0
1.0
2.8
2.8
4.0
1.4
1.4
1.4
1.0
-
-
-
-
-
Ck-Shanghai-510-09
2.0
1.0
2.0
2.0
2.0
1.0
2.0
0.7
4.0
4.0
5.6
4.0
2.0
4.0
5.6
5.6
2.8
1.0
1.4
2.8
1.0
-
-
-
-
Ck-Hunan-2351-09
1.4
0.5
2.0
1.0
2.0
1.4
1.0
1.4
2.8
1.4
4.0
4.0
1.4
2.0
2.8
8.0
1.4
0.5
1.4
2.0
1.4
1.0
-
-
-
Ck-Shandong-2552-09
1.0
0.7
1.0
0.5
1.0
1.4
1.4
1.0
1.4
1.4
2.8
2.0
0.25
1.0
1.4
2.8
0.7
0.5
0.7
0.7
1.0
1.0
1.0
-
-
Ck-Shandong-2567-09
1.0
0.7
1.0
0.5
1.4
1.0
2.0
1.0
1.4
1.4
2.0
2.8
0.5
1.4
2.0
5.6
1.0
0.35
1.0
0.7
1.4
0.7
5.6
1.0
-
Vaccine
2.0
2.0
5.6
4.0
5.6
2.0
1.4
2.0
4.0
4.0
8.0
1.0
1.0
1.4
1.4
11.2
2.8
2.8
1.4
2.0
2.8
2.0
1.4
2.0
1.0
表5：11株H9N2流感病毒中和实验结果
病毒

血清
Ck-Shanghai-441-09
Ck-Hunan-2230-09
Dk-Fujian-1753-09
Ck-Jilin-3-09
Ck-Guangdong-1258-09
Ck-Guangdong-1494-09
Ck-Shanghai-1-06
Ck-Guangdong-1214-09
Ck-Shanghai-2-04
Vaccine
Ck-Shanghai-6-03
Ck-Shanghai-441-09
7610
﹥9050
﹥9050
3806
5380
5380
﹥9050
﹥9050
1346
637
1132
Ck-Hunan-2230-09
1346
1132
2690
952
952
952
﹤200
1132
366
﹤200
﹤200
Dk-Fujian-1753-09
3806
5380
5380
3806
4524
7610
3806
7610
1132
476
672
Ck-Jilin-3-09
5380
1902
2263
2263
2263
1132
1132
2262
566
566
476
Ck-Guangdong-1258-09
3806
5380
2690
672
3806
1902
1902
4524
﹤200
﹤200
672
Ck-Guangdong-1494-09
2263
2690
3806
1132

7610
7610
2262
2690
672
﹤200
952
Ck-Shanghai-1-06
3806
4524
7610
1902
7610
4524
﹥9050
3806
1132
336
﹤200
Ck-Guangdong-1214-09
672
952
4524
336
1902
1902
476
2262
﹤200
﹤200
﹤200
Ck-Shanghai-2-04
1346
952
1346
566
476
952
1132
1132
672
952
672
Vaccine
2262

1132
1132
﹤200
4524
952
﹤200
566
672
1132
336
Ck-Shanghai-6-03
476
476
476
﹤200
1132
﹤200
566
566
1902
1346
3806

表6：11株H9N2流感病毒中和实验抗原“r”值的计算结果
病毒
血清
Ck-Shanghai-441-09
Ck-Hunan-2230-09
Dk-Fujian-1753-09
Ck-Jilin-3-09
Ck-Guangdong-1258-09
Ck-Guangdong-1494-09
Ck-Shanghai-1-06
Ck-Guangdong-1214-09
Ck-Shanghai-2-04
Vaccine
Ck-Shanghai-6-03
Ck-Shanghai-441-09
1.00
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Hunan-2230-09
0.84
1.00
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Dk-Fujian-1753-09
1.09
0.65
1.00
-
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Jilin-3-09
0.92
1.19
1.19
100
-
-
-
-
-
-
-
Ck-Guangdong-1258-09
1.19
0.92
1.27
2.38
1.00
-
-
-
-
-
-
Ck-Guangdong-1494-09
2.18
1.83
1.19
3.67
1.41
1.00
-
-
-
-
-
Ck-Shanghai-1-06
1.41
3.36
1.27
3.08
1.54
2.59
1.00
-
-
-
-
Ck-Guangdong-1214-09
1.68
1.54
0.59
2.59
1.0
1.83
3.36
1.00
-
-
-
Ck-Shanghai-2-04
1.68
1.54
1.54
2.18
5.19
2.83
2.18
2.59
1.00
-
-
Vaccine
2.38
2.38
3.36
4.75
2.18
4.76
12.34
4.75
0.84
1.00
-
Ck-Shanghai-6-03
7.33
6.17
8.0
9.51
4.36
12.34
19.03
9.51
1.41
3.36
1.00

3 讨论

第三章 H9N2流感病毒对BALB/c小鼠的致病性研究
1 材料与方法
1.1 实验用毒株
分离选定的27株H9N2病毒流感病毒。
1.2 实验动物
180只4～5周龄BALB/c雌性小鼠购自上海莱斯克实验动物有限公司，饲养于正压隔离器中。
1.3 实验过程
在生物安全柜内，以4℃保存的无菌PBS稀释病毒尿囊液至106EID50/50μl后，将稀释液置于冰上，依次稀释27株病毒。小鼠接毒时，将小鼠放入含有干冰的烧杯内，干冰上层覆盖白纸数层，防止小鼠和干冰直接接触。
小鼠放入烧杯内后，开始小鼠在烧杯内活跃，数秒后栽倒于烧杯内，栽倒3秒左右，左手拇指和食指捏住颈部皮肤迅速取出小鼠，同时右手持枪内先前已经稀释好的50μl病毒稀释液缓慢滴于小鼠鼻孔周围，液体随小鼠呼吸吸入鼻孔内，病毒液边吸入边滴下，从小鼠在烧杯内取出到病毒全部被小鼠吸入，整个过程控制在10秒以内为好。左手捏持小鼠颈部皮肤从烧杯取出过程中，避免捏持过紧，因为这样会造成小鼠呼吸不畅，引起接毒失败甚至小鼠窒息死亡。接毒完毕后，迅速将小鼠置于正压隔离其中。
每株H9N2病毒，接毒小鼠6只，接毒当日称取3只小鼠体重，连续进行14天；在接毒后第4天处死每株接毒小鼠3只，采集脾脏、肾脏、肺脏、脑和鼻腔至2ml EP管中，-80℃保存用于病毒含量滴定。
1.4 BALB/c鼠脏器采集
将小鼠置于含干冰的烧杯内，麻醉后迅速用剪刀剪断腋下动脉，将小鼠轻贴于吸水纸上，防止血液滴洒于操作台，待血液放净后，用75%酒精棉球擦拭小鼠腹部至胸部之间。左手持镊夹持腹部皮肤并提起，右手用剪刀剪破皮肤扩大开口至鼠颈部颌下，充分分离左右两侧皮肤和肌肉的连接，为操作方便可以剪开腹部两侧皮肤，以扩大操作空间。此后，剪开腹腔，使腹腔脏器充分暴露，分别采集脾脏和两侧肾脏至2ml EP管中并置于冰上。剪开胸腔，把整个肺脏取出至2ml EP管中。翻转死亡小鼠，用75%酒精消毒浸湿脑部皮肤，左手持镊固定，右手用剪刀从枕骨处剪开脑部皮肤，充分扩大创口后，用剪刀于枕骨部剪开脑盖骨，两边弧线剪开并掀起脑盖，取出完整的脑至2ml EP管中。小鼠鼻腔较短，充分剪除鼻两测皮肤及鼻吻，用剪刀于眼孔下缘剪断鼻骨并至2ml EP管中。标记装有脏器的EP管后置于冰上，整理操作台面后，进行下一只小鼠的实验，从小鼠处死开始至整个实验结束控制在8min以内。所有实验操作均在无菌的状态下操作，所用器具均进行高压灭菌处理，金属器械在采集一个脏器后均用75%酒精浸泡，之后用纸巾擦拭干后用于下一脏器的采集。
1.5 滴定脏器病毒含量
取出-80℃冰箱中含有脏器的2ml EP管，其中加入直径为4mm的钢珠2颗，加入含有青霉素1000单位和链霉素1000单位