谷胱甘肽化学与酶法合成.doc

谷胱甘肽化学法和酶法合成
1 化学性质
谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽，半胱氨酸上的巯基为其活性基团（故谷胱甘肽常简写为G-SH）分子式为C10H17N3O6S，分子量为307.32348，熔点为189~193℃，晶体呈无色透明细长拉状，等电点为5.93。GSH有还原型（G-SH）和氧化型（G-S-S-G）两种形式，在生理条件下以还原型GSH占绝大多数。谷胱甘肽还原酶催化两型间的互变。该酶的辅酶为磷酸糖旁路代谢提供的NADPH。

图1 GSH的结构式
2 药理作用
GSH可促进糖、脂肪及蛋白质代谢，加速自由基排泄，保护肝脏的合成、解毒、灭活激素等功能。
3 谷胱甘肽的生产方法
1888年，GSH首先从酵母中分离出来。日本1983年进行了含量较多的GSH酵母的生产，其后又研究了GSH提取、分离技术及分析检测方法。目前国外实现了GSH规模生产。世界主要的氨基酸制造商Kyowa，Aji-nomoto和Degussa等都相继投巨资于氨基酸的研究与开发，仅Kyowa 1998年氨基酸的研究与开发就耗费达1.9亿美元，而GSH是其重点之一，Kyowa目前是GSH主要的供应商。目前GSH的主要生产方法有：萃取法、发酵法、酶法和化学合成法。
3.1萃取法
萃取法主要是通过萃取和沉淀的方法从GSH含量比较高的动植物组织中将GSH分离提取的一种方法，GSH的早期生产都是采用萃取法，是生产GSH的经典方法，也是发酵法生产流程中的下游过程基础。其工艺路线如下图：

图2 GSH发酵法工艺路线图
该方法的不足：由于GSH在组织中含量极低，可用原料少，制备的纯度和收率都不高，故在实际生产中应用不广泛。
3.2酶法
在酶催化合成GSH中，几种关键的化合物和条件包括：GSHⅠ和GSHⅡ、氨基酸原料(L-谷氨酸、甘氨酸和L-半胱氨酸)、ATP、保持GSHⅠ和GSHⅡ活性所必需的辅因子(Mg2+)和一个适当的pH值环境。合成中，需求大量ATP，给GSH的工业化生产带来麻烦，大大提高了GSH生物合成的成本，所以只能寻求一个ATP生成系统来藕联ATP消耗系统。两种系统同在一种生物体内的称为自藕联系统，在多种生物体内的称为共藕联系统。自藕联系统研究的比较少，因为很难找到一种生物体同时含有ATP生成系统和ATP消耗系统。
Murata等人发现酒酵解菌(s.cerevisae)中的葡萄糖是最简单的ATP生产系统之一，可以提供足量的ATP用来GSH的生物合成。酶催化法合成GSH的浓度可以达到99/l，但是所用的氨基酸原料比较贵，提高了GSH生物合成的成本。
3.3发酵法
生物发酵法是利用廉价的糖作为原料，利用微生物体内物质的代谢途径来合成GSH的方法。由于发酵法所使用的细菌或酵母容易培养，加之生产方法及工艺的不断改进和完善，因此微生物发酵法已成为目前GSH工业化生产的最普遍方法。在工业上，生物发酵法一般都选用s.eerevisae和 Candidautilis为原料进行发酵。
一般情况下，微生物细胞中GSH含量不高，仅为细胞干重的0.1~1.0%。过高含量的GSH容易破坏体内业已平衡的氧化还原环境，GSH是胞内产物，实际生产过程中需要进行提取，较低的含量无疑会大大提高生产成本。因此，发酵法生产GSH的关键问题在于如何提高细胞密度以及细胞内的GSH含量。二者的有机结合将有利于GSH产量的大幅度提高。
发酵法己成为目前生产GSH的最通用的方法。但也存在着生产菌株中GSH含量较低，提取困难，成本造价高、产率不稳定等问题。
3.4 化学合成法
化学合成法生产GSH始于七十年代，是将L-Glu、L-Cys和Gly经过一系列化学反应缩合成GSH，大体上是经过基团保护，缩合，脱保护，三个阶段。目前化学合成法生产工艺比较成熟。但是化学合成方法比较复杂，反应步骤多、反应时间长、成本高、操作复杂、可能会发生消旋而影响活性、环境污染等多种不利因素，所以有关GSH的化学合成研究不如生物合成那么广泛。而且由于经济利益的因素，很多有关化学合成GSH的专利和期刊都没有公开报道。
3.5 化学-酶法合成
化学-酶法合成，即先用化学方法合成S-苄基甘氨酰半胱氨酸，再与谷氨酸在生物催化酶谷氨酰转肽酶的作用下生成GSH。

S-苄基-谷胱甘肽的产率受到酶纯度的严重影响，而该酶的分离纯化工作量非常大，成本高。应用谷胱甘肽转肽酶催化合成S-苄基-谷胱甘肽，需要通过基因工程手段提高谷氨酰转肽酶的酶活和转肽反应的选择性。
4 GSH的化学-酶法合成可行性分析
化学-酶法合成GSH步骤：① 用Bzl对半胱氨酸的巯基进行保护；②用Z保护基对半胱氨酸的氨基进行保护；③活化半胱氨酸的羧基；④采用成酯的方式对甘氨酸的羧基进行保护；⑤保护后的半胱氨酸和甘氨酸反应；⑥反应后产物SBCGM与L-谷胱酰胺在酶的作用下发生反应，生成L-谷胱酰SBCGM；
合成路线如下：

图3 化学-酶法合成GSH路线图
由上述合成路线可知，进行GSH的化学-酶法合成需要克服以下几点：
首先，γ-谷胱甘肽转肽酶（γ-GTP）的来源问题：
一是考虑市售商品，γ-GTP价格昂贵，8839元/1000u，成本过高，不适于生产需要；
二是考虑使用菌株生产实验室生产，考虑诱导合适的高产菌株耗时比较长，难度很大，故需购买产γ-GTP的菌株，见表1，例如枯草芽孢杆菌NX-2，不过该类菌株属专利保护菌种，价格比较昂贵；同时，酶的纯化相对复杂，如何得到高纯度以及高活性的酶是试验的重点和难点。
表1 γ-谷胱甘肽转肽酶生产菌
菌种
γ-谷胱甘肽转肽酶（生成量，U/mL）
地衣芽孢杆菌A35
3.020
地衣芽孢杆菌ATOC9945A
1.320
枯草芽孢杆菌Sawa
1.531
枯草芽孢杆菌IF03022
0.461
枯草芽孢杆菌Asahikawa
0.06
枯草芽孢杆菌IF03335
0.009
枯草芽孢杆菌NX-2
2.00
其次，氨基酸来源：
一是采用固相合成的方法合成GSH，Fmoc保护氨基酸，树脂等价格相对比较高，例如Fmoc-Cys(Trt)-OH，10元/5g，Rink树脂100元/5g；另外，该方法生产的GSH容易消旋，并且容易生成分子内、分子间的环化，致使GSH的纯度不高，可以尝试该方法进行合成。
二是通过液相合成的方法合成GSH，可直接购买带保护基的氨基酸，例如半胱氨酸，Z-Cys（Bzl）-OH，价格为800元/5g，远超过GSH的价格（350元/5g），同时该方法在裂解时采用氟化氢，环境污染大，不利于工业生产；或可考虑购买裸露的氨基酸，L-半胱氨酸价格大概为98元/10g，实验室添加保护基，困难点在于得到酶底物需要经过5步反应，每步反应均需要纯化，加大了反应的难度和成本，反应的整体收率也会相应的降低，需要优化反应条件提高收率。
5 实验设计
根据上述分析，可知GSH的化学-酶法合成的实验方案如下：
5.1仪器与材料
高效液相色谱仪；Agilent 1200系列质谱仪；恒温磁力搅拌器；旋转蒸发仪；电热恒温干燥鼓风箱；紫外分光光度计；循环水式多用真空泵；红外光谱仪；圆底烧瓶；铁架台。
γ-GTP；L-半胱氨酸盐酸盐；甘氨酸乙酯盐酸盐；L-谷氨酰胺；无水乙醇；氢氧化钠；溴化氢醋酸溶液；二碳酸二叔丁酯；三氟乙酸；液溴，四氢萘；溴化钠；乙酸乙酯；氯甲酸苄酯；醋酸；浓盐酸；氯化苄；乙醚；乙腈（色谱纯）；纯水为实验室自制。
5.2 实验方法与内容
5.2.1 S-苄基半胱氨酸（SBC）的合成
操作步骤：
称取7.86g（0.05mol）L-半胱氨酸盐酸盐，溶于125mL 1M的NaOH中，转到250mL三口瓶中，冷却至0~4℃，利用滴液漏斗向其中缓慢滴加7.2mL（0.06mol）氯化苄的乙醇溶液，控制滴加速度为0.5mL/min，电动搅拌器充分搅拌。滴加完毕后，室温反应2h。用稀盐酸调pH 值为5.5，有大量白色絮状物生成，减压抽滤，用蒸馏水洗涤，红外等下干燥，得白色固体。
5.2.2 S-苄基-N-Cbz-半胱氨酸的合成
操作步骤：
称取10.50g（0.05mol）S-苄基-半胱氨酸，用200mL 2 mol/L NaOH进行溶解，3min后完全溶解，将溶液置于500mL三口烧瓶中，利用滴液漏斗向其中缓慢滴加8.6mL（0.06mol）氯甲酸苄酯，控制滴加速度为0.5mL/min，电动搅拌器充分搅拌后进行反应，冰盐浴控制反应温度在-3~3℃，滴完后调pH值为9，继续反应5h。
反应结束溶液分上下层，上层为油层，下层为水层。水层用乙醚洗两次，除去未反应的氯甲酸苄酯，继而用2M的HCI酸化，置于梨形漏斗中乙酸乙酯萃取两次，合并有机层，用饱和NaCl溶液洗涤至中性，无水硫酸钠干燥。最后加
入石油醚固化得到的白色固体组产物。
5.2.3 S-苄基-N-Cbz-L-半胱氨酰甘氨酸乙酯的合成
操作步骤：
称取6.27 g （0.05mol）甘氨酸乙酯盐酸盐溶解于100mL二氯甲烷中，并向该溶液中加入20mL四氢呋喃和7mL三乙胺，形成溶液A，呈淡黄色溶液。将 l7.3 g （0.05mol）S-苄基-N-Cbz-半胱氨酸溶解于100mL二氯甲烷中形成溶液B，无
色透明。
将A，B两份溶液混合均匀后，置于500mL三口烧瓶中，控制反应温度为-4~3℃。另外，称取适量二环己基碳二亚胺（DCC）缩合剂，将其溶解在50mL二氯甲烷中，形成溶液C，利用滴液漏斗将溶液C缓慢滴加到A，B的混合溶液中，电动搅拌器充分搅拌后进行反应，反应时间5h。
反应结束后，三口瓶内清楚地分层且有白色固体。过滤除去固体N,N’-二环己基脲（DCU）。梨形漏斗分液弃水层得油层，用稀盐酸对油层酸化出现白色固体，减压抽滤至干，放入红外灯下干燥，得白色粉末。
5.2.4 S-苄基-半胱氨酰甘氨酸（SBCGM）的合成
操作步骤：
称取4.3g（0.01mol）S-苄基-N-Cbz-半胱氨酸甘氨酸乙酯置于100mL圆底烧瓶中（瓶口接有氯化钙干燥管），加入 25mL 35.5%的溴化氢的醋酸溶液，于室温下磁力搅拌，反应物逐渐溶解并放出气体CO2。5h后，减压抽去部分溴化氢和冰醋酸，得到油状物。加入大量乙醚固化研磨，倾去乙醚后，抽干成粉状物，放置于真空干燥器中进行干燥，得淡黄色粉末。
5.2.5 L-谷胱酰SBCGM的合成
在20 mmol/L的L-谷氨酰胺为供体，20mmol/L的SBCGM为受体，0.1mol/L，pH=8.0的Tris-HCL为缓冲液，加入酶蛋白1U/L，38℃下转化30分钟的体系中，γ-GTP可以催化SBCGM形成谷胱甘肽的前体γ-谷氨酰SBCGM。