第十节 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测定.doc

1.3.6.2 血或组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活力测定
1.3.6.2.1 原理
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。
1.3.6.2.2 试剂和仪器
仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器
试剂：叠氮钠磷酸缓冲液 pH7.0
NaN3
16.25mg
终浓度2.5mmol/L
EDTA-Na2
7.44mg
终浓度0.2mmol/L
Na2HPO4
1.732g
终浓度0.2mol/L
NaH2PO4
1.076g
终浓度0.2mol/L
加蒸馏水至100mL，用少量HCL、NaOH调pH7.0，4℃保存。
1mmol/L谷胱甘肽（还原型GSH）溶液
GSH 30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保存1－2日。
1.25－1.5mmol/LH2O2溶液
取30％H2O2 0.15－0.17mL，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4℃避光保存，临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。
偏磷酸沉淀液
HPO3
16.7g（先用蒸馏水溶解）
EDTA
0.5g
NaCl
280g
加蒸馏水至1000mL，用普通滤纸过滤，室温保存。
0.32mol/LNa2HPO4溶液:
Na2HPO4 22.7g加蒸馏水至500mL，室温保存。
DTNB显色液
DTNB
40mg
柠檬酸三钠
1.0g
加蒸馏水至100mL，4℃避光保存1个月。
0.2M磷酸缓冲液pH7.4
0.9%生理盐水
1.3.6.2.3 实验步骤
1.3.6.2.3.1 样品制备
溶血液：取鼠血10μl加入到1mL双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血1:100待测，4h内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20℃冻存，3d内测定，若4℃存放，28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻。
组织上清液：动物禁食过夜，处死后，立即取出所需脏器，放入冷生理盐水中洗去浮血，剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后，在冰浴上剪成碎块，称取适量组织，加冷0.2M磷酸缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复3次制成5%组织匀浆，操作在冰浴中进行，匀浆以12500×g离心10min（低温高速离心机），以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，上清液用以测胞液中的酶活力，最好当天测，否则加20％（v/v）甘油分装于塑料管，放置-20－-80℃，可保存数周，而酶活力不减。
1.3.6.2.3.2 GSH标准曲线的制作：
取1.0mmol/LGSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀剂8mL，用双蒸水稀释至10mL刻度，即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的 GSH标准液。
取上述不同浓度标准液各2mL，放入试管中，加入0.32mol/L Na2HPO4 2.5mL，比色前加入DTNB显色液0.5mL用光径1cm杯，5min内在可见光423nm波长测OD值，以双蒸水调零点。
以GSH含量（μmol/L）为横坐标，OD423值为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.6.2.3.3 测定步骤：
试剂
样品管（mL）
非酶管（mL）
空白管（mL）
1.0mmol/LGSH
0.4
0.4

样品**
0.4

双蒸水*

0.4

37℃水浴预温5min
H2O2（37℃预热）
0.2
0.2

37℃水浴准确反应3min （严格控制时间）
偏磷酸沉淀液
4
4

3000r/min离心10min
离心上清液
2
2

双蒸水

0.4
偏磷酸沉淀液

1.6
0.32mol/LNa2HPO4
2.5
2.5
2.5
DTNB显色液
0.5
0.5
0.5
显色反应1min后于423nm波长（1cm光径），读OD值，5min之内读数准确。
* 样品为组织上清液时，非酶管改为加热使酶失活的组织上清液。
**溶血液 0.1－0.4mL
组织上清液 1:20稀释，取稀释液0.4mL
注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。
1.3.6.2.3.4 计算
鼠全血GSH-Px活力单位 规定每1mL全血，每分钟，扣除非酶反应的log[GSH]降低后，使log[GSH]降低1为一个酶活力单位。
非酶管log[GSH]-样品管log[GSH]
鼠全血GSH-Px活力单位（U/mL全血）= ────────────────
3min×0.004mL
log[非酶管OD－空白管OD]-log[样品管OD-空白管OD]
= ────────────────────────
3min×0.004mL
组织GSH-Px比活力单位 规定每毫克蛋白质，每分钟，扣除非酶反应，使GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活力单位。
（非酶管OD－样品管OD）×A**×5
组织GSH-Px比活力单位（U/mg蛋白） = ───────────────────
3min×样品蛋白质的mg数 *
* Folin法或双缩脲法测样品蛋白质含量
标准GSH浓度（μmol/L）
** A= ─────────── 即标准曲线斜率。
标准GSH光密度（OD）

1.3.6.2.4 注意事项
1.3.6.2.4.1 由于H2O2易分解导致浓度改变，临用时取贮备液用分光光度计测其浓度，取贮备液3mL，测定1cm光径的240nm处OD值。
OD
浓度（mmol/L）＝————————
0.036（消光系数）
若OD值为0.45，则表明H2O2浓度为12.5mmol/L。
1.3.6.2.4.2 5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子的显色不仅与整个反应体系中氢离子浓度有关，还受反应时间限制。加入显色剂后，反应体系pH为6.5时，11min开始显色，此时比色5min内读数准确。
1.3.7抗氧化物质还原型谷胱甘肽（GSH）测定
谷胱甘肽是一种低分子清除剂，它可清除O2-、H2O2、LOOH。谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的一种三肽，是组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，是GSH-PX和GST两种酶类的底物，为这两种酶分解氢过氧化物所必需，它能稳定含巯基的酶，和防止血红蛋白及其它辅助因子受氧化损伤，缺乏或耗竭GSH会促使许多化学物质或环境因素产生中毒作用，GSH量的多少是衡量机体抗氧化能力大小的重要因素。
1.3.7.1血或组织中还原型谷胱甘肽（GSH）测定方法
1.3.7.1.1原理
GSH-和5，5'-二硫对硝基甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基甲酸阴离子，于420nm波长有最吸收峰，测定该离子浓度，即可计算GSH的含量。
1.3.7.1.2仪器和试剂
仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器
试剂：0.9％生理盐水
4％磺基水杨酸溶液
0.1mol/L PBS溶液（pH=8.0）：
称取Na2HPO4 13.452g，KH2PO4 0.722g，加蒸馏水至1000mL。
0.004％DTNB溶液：
称取DTNB 40mg溶于1000mL的0.1mol/L PBS溶液（pH=8.0）中。
叠氮纳缓冲液：
NaN3
16.25 mg
EDTA-Na2
7.44 mg
Na2HPO4
1.732 g
NaH2PO4
1.076 g
加蒸馏水至1000mL，用少量HCl、NaOH调pH7.0，4℃保存。
标准溶液：称取还原型GSH 15.4mg，加叠氮纳缓冲液至50mL，终浓度为 1mmol/L，临用前配制。
1.3.7.1.3 实验步骤
1.3.7.1.3.1 样品制备：
溶血液上清液：取0.1mL抗凝全血加双蒸水0.9mL（1：9溶血液充分混匀，直至透亮为止。取溶血液0.5mL加4%磺基水杨酸0.5mL混匀，室温下3500rpm离心10分钟，取上清液备用。
血清上清液：取0.1mL血清加4%磺基水杨酸0.1mL混匀，室温下3500rpm离心10分钟，取上清液备用。
组织上清液：取组织0.5g加生理盐水4.5mL充分研磨成细浆（10%肝匀浆），混匀后取浆液0.5mL加4%磺基水杨酸0.5mL混匀，室温下3500rpm离心10分钟，取上清液备用。
1.3.7.1.3.2 样品测定：
溶血液或组织样品测定：

测定管
空白管
上清液
0.5mL
－
4%磺基水杨酸
－
0.5mL
DTNB

4.5mL
4.5mL
混匀，室温放置10 分钟后，420nm处测定吸光度。
血清样品测定：

测定管
空白管
上清液
0.1mL
－
4%磺基水杨酸
－
0.1mL
DTNB
0.9mL
0.9mL
混匀，室温放置10 分钟后，420nm处测定吸光度。
注：该指标检测，需新鲜样品取材后当天完成。用双缩脲法测定血清（或溶血液）、组织匀浆蛋白质含量。如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。
1.3.7.1.3.3 标准曲线
取1mmol/L GSH标准溶液0、10、20、50、100、150、200µL,分别加入生理盐水至0.5mL，即得到0、20、40、100、200、300、400µmol/L的GSH标准液系列，各管加入DTNB4.5mL，混匀，室温放置10 分钟后，空白管调零，420nm处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线。

1
2
3
4
5
6
7
1mmol/L GSH（mL）
0
0.01
0.02
0.05
0.10
0.15
0.20
生理盐水（mL）
0.50
0.49
0.48
0.45
0.40
0.35
0.30
DTNB（mL）
4.50
4.50
4.50
4.50
4.50
4.50
4.50
GSH量（mmol/L
0
20
40
100
200
300
400
1.3.7.1.3.4 计算
样品GSH含量 = 对应曲线浓度值（mmol/L）×溶血液稀释倍数×上清液稀释倍数
（mmol /L全血） = 对应曲线浓度值（mmol/L）×10×2

样品GSH含量 = 对应曲线浓度值（mmol/L）×上清液稀释倍数
（mmol /L血清） = 对应曲线浓度值（mmol/L）×2

样品GSH含量 = 对应曲线浓度值（mmol/L）×上清液稀释倍数÷上清液组织含量
（mmol /g组织） = 对应曲线浓度值mmol/L）×2÷100g组织/L

样品GSH含量 = 对应曲线浓度值（mmol/L）×上清液稀释倍数÷上清液蛋白含量
（mmol /gprot） = 对应曲线浓度值（mmol/L）×2÷匀浆gprot/L
1.4数据处理与结果判定
1.4.1数据处理
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
1.4.2 指标判定
1.4.2.1脂质氧化产物
受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，过氧化脂质（丙二醛或8-表氢氧异前列腺素）含量降低有统计学意义，判定该受试样品有降低脂质过氧化作用，该项指标结果阳性。
1.4.2.2蛋白质氧化产物
受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，蛋白质羰基含量降低有统计学意义，判定该受试样品有降低蛋白质过氧化作用，该项指标结果阳性。
1.4.2.3抗氧化酶活力
受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，抗氧化酶（SOD或GSH-PX）活力升高有统计学意义，判定该受试样品有升高抗氧化酶活力作用，该项指标结果阳性。
1.4.2.4抗氧化物质GSH
受试样品组与模型（或老龄）对照组比较，GSH含量升高有统计学意义，判定该受试样品有升高抗氧化物质GSH作用，该项指标结果阳性。
1.4.3结果判定
过氧化脂质含量、蛋白质羰基、抗氧化酶活性、还原性谷胱甘肽四项指标中三项指标阳性，可判定该受试样品抗氧化动物实验结果阳性。