异种肝前体细胞移植治疗急性肝损伤大鼠.doc

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万真，等. 异种肝前体细胞移植治疗急性肝损伤大鼠

异种肝前体细胞移植治疗急性肝损伤大鼠**☆

万 真1，2，张晓刚1，2，郑幸龙1，2，马 锋1，2，马 佳1，2，向俊西1，2，王浩华1，2，吕 毅1，2 (1西安交通大学第一附属医院肝胆外科，陕西省西安市 710061；2西安交通大学先进外科技术与工程研究所，陕西省西安市 710061)

文章亮点：
1 实验行异种肝前体细胞移植，就其治疗急性肝损伤的作用，及移植细胞在大鼠脾脏内的植入和肝细胞分化做一探索。
2 发现异种肝前体细胞移植能改善肝功能，促进肝细胞修复，移植的异种肝前体细胞能有效植入脾脏实质，并在脾脏微环境调控下向肝细胞分化。
关键词：
器官移植；细胞移植；肝移植；急性肝损伤；分化；植入；肝前体细胞；脾脏； Alb；CK-19；异种；微环境；国家自然科学基金
主题词：
细胞移植；脾；成体干细胞；细胞分化；细胞，培养的；四氯化碳
基金资助：
国家自然科学基金(30600575；30830099)资助**

摘要
背景：成体肝前体细胞可在受体肝脏内定植并分化为肝细胞。不过，异种肝前体细胞移植能否促进急性肝损伤的恢复，脾脏微环境能否促进移植物的存活和向肝细胞分化，尚没有研究。
目的：评价异种肝前体细胞移植治疗急性肝损伤的作用；监测移植肝前体细胞在大鼠脾脏实质内的定植及向肝细胞的分化。
方法：体外培养雄性小鼠来源的肝前体细胞系肝上皮样前体细胞。通过CCl4腹腔注射联合2/3肝切除构建急性肝损伤大鼠模型，进行肝上皮样前体细胞脾脏移植。在肝切除后1，5，14和21 d，苏木精-伊红染色观察肝脏病理改变，全自动生化分析仪监测血清转氨酶变化，PCR反应检测脾脏组织Y染色体特异性序列Sry，脾脏CK-19和Alb免疫组织化学追踪移植肝上皮样前体细胞的植入和肝细胞分化。
结果与结论：肝上皮样前体细胞可在体外长期培养，保持增殖能力和双向分化潜能。肝上皮样前体细胞脾脏移植后，肝损伤大鼠肝细胞肿胀明显减轻，丙氨酸转氨酶和天门冬氨酸转氨酶下降更明显移植后1，5，14和21 d，脾脏DNA中均能检测到Sry序列。在整个实验期间CK-19阳性细胞在大鼠脾脏实质内始终存在。Alb阳性细胞在移植后5 d在脾脏实质中出现，随后阳性细胞数逐渐增多。实验表明，移植肝前体细胞能在大鼠脾脏实质中植入，并分化为肝细胞，能有效促进CCl4腹腔注射联合2/3肝切除诱导的大鼠急性肝损伤的修复过程。

Intrasplenic delivery of xenogeneic hepatic progenitor cells ameliorates acute liver injury in rats

Wan Zhen1, 2, Zhang Xiao-gang1, 2, Zheng Xing-long1, 2, Ma Feng1, 2, Ma Jia1, 2, Xiang Jun-xi1, 2,
Wang Hao-hua1, 2, Lü Yi1, 2 (1Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China; 2Institute of Advanced Surgery Technology and Engineering, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China)

万真☆，男，1985年生，江西省南昌市人，汉族，西安交通大学医学部在读博士，主要从事肝干细胞和肝再生的研究。

通讯作者：吕毅，博士，教授，博士生导师，西安交通大学第一附属医院肝胆外科，陕西省西安市710061；西安交通大学先进外科技术与工程研究所，陕西省西安市
710061
luyi169@

中图分类号:R318
文献标识码:A
文章编号:2095-4344
(2013)53-09132-07

修回日期：2013-09-24
(201308032/MWJ·Y)

Wan Zhen☆, Studying for doctorate, Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China; Institute of Advanced Surgery Technology and Engineering, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China

Corresponding author: Lü Yi, Ph.D., Professor, Doctoral supervisor, Department of Hepatobiliary Surgery, First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China; Institute of Advanced Surgery Technology and Engineering, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, Shaanxi Province, China
luyi169@

Accepted: 2013-09-24

Abstract
BACKGROUND: Adult hepatic progenitor cells transplanted into the liver can engraft and differentiate into hepatocytes. However, little evidence was available concerning whether heterogeneic hepatic progenitor cells can promote the restoration of acute liver damage and whether the microenvironment of spleen can promote the graft survival and differentiation into hepatocytes.
OBJECTIVE: To evaluate the effect of hepatic progenitor cell transplantation on acute liver injury and monitor the engraftment and hepatocytic differentiation of transplanted hepatic progenitor cells in the splenic parenchyma.
METHODS: Adult mouse derived progenitor cell line liver epithelial progenitor cells were cultured in vitro for long term. The acute liver injury model was established by intraperitoneal injection of CCl4 in combination with 2/3 partial hepatectomy, for transplantation of liver epithelial progenitor cells. The liver pathological changes were observed by hematoxylin-eosin staining at 1, 5, 14 and 21 days after hepatectomy. Serum transaminase levels were monitored using automatic biochemistry analyzer. The Sry sequence in the spleens was tested by PCR.

3
P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083@
Immunohistochemistry staining against CK-19 and Alb was performed to analyze the engraftment and hepatocytic differentiation of transplanted hepatic progenitor cells in the splenic parenchyma.
RESULTS AND CONCLUSION: Liver epithelial progenitor cells maintained normal proliferation and bipotential differentiation capacity after long-term culture in vitro. Compared with model group, hepatocyte edema was alleviated significantly, and serum alanine aminotransferase and aspartic transaminase levels were decreased remarkably after cell transplantation group. The Sry sequence was tested in spleen DNAs at 1, 5, 14 and 21 days post-transplantation. CK-19 positive cells existed in the splenic parenchyma throughout the study period. Alb-positive cells emerged at 5 days post-transplantation and the number of Alb-positive cells was gradually increased over time. Results show that hepatic progenitor cells engraft and differentiate into hepatocytes in rat splenic parenchyma successfully, and the transplantation can promote the recovery process from CCl4/partial hepatectomy induced acute liver injury.

Subject headings: cell transplantation; spleen; adult stem cells; cell differentiation; cells, cultured; carbon tetrachloride
Funding: The National Natural Science Foundation of China, No. 30600575*, 30830099*

Wan Z, Zhang XG, Zheng XL, Ma F, Ma J, Xiang JX, Wang HH, Lü Y. Intrasplenic delivery of xenogeneic hepatic progenitor cells ameliorates acute liver injury in rats. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(53):9132-9138.

9137
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

0 引言 Introduction

急性肝功能损伤多由乙肝病毒感染[1]、酒精或药物中毒等引起[2-3]，是临床常见的问题。肝功能在短期内急剧恶化，肝脏再生受抑制，可进展至急性肝衰竭，并伴发脑水肿、败血症而导致死亡[4]。当肝细胞增殖受抑制时，肝前体细胞活化增殖，并进一步分化为肝细胞和胆管上皮细胞修复受损肝脏[5]，提示可移植肝前体细胞治疗急性肝损伤。移植的肝前体细胞能在受体内定植并分化为肝细胞[6]，这可能改善肝功能，缓解急性肝功能损伤[7-8]。肝前体细胞增殖能力较强，呈现双向分化潜能，而且直径较小，仅是成熟肝细胞的1/3-1/2，能促进植入过程[9-10]。此外，近年来肝前体细胞的分离纯化，表型鉴定方面的研究进展迅速，为移植应用奠定了基础[11-13]。肝前体细胞移植治疗急性肝功能损伤应用前景广阔，值得广泛研究。
脾脏是理想的细胞移植部位。经脾内注射的移植细胞滞留于血窦腔内，进一步穿越血窦内皮细胞定植于脾实质内[14]。移植的肝细胞在脾实质内长期存活，发挥代谢、合成等功能，并大量增殖[15-16]。此外，肝细胞经脾移植后表达外源基因的能力也远远高于经腹腔或皮下移植途径[17]。
从倒千里光碱腹腔注射联合2/3肝切除处理的小鼠肝脏中可分离获得肝上皮样前体细胞系，在体外培养条件下可被诱导分化为肝细胞和胆管上皮细胞[18]。实验建立CCl4腹腔注射联合2/3肝切除诱导的大鼠急性肝损伤模型，评价小鼠肝上皮样前体细胞经脾移植改善肝功能的作用，监测移植细胞在大鼠脾脏实质内的定植及分化成肝细胞的情况。

1 材料和方法 Materials and methods

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2012年7至12月在西安交通大学医学部实验动物中心完成。
材料：
实验动物：健康清洁级8-10周雌性SD大鼠，体质量 200-300 g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(陕)2007-001。在12 h 白天/12 h晚上更替的清洁环境下饲养，自由进食水、饲料，环境温度维持在25 ℃左右。
细胞：肝前体细胞株肝上皮样前体细胞，从倒千里光碱腹腔注射联合2/3肝切除处理的小鼠肝脏中分离得到，能在体外培养条件下诱导分化为肝细胞和胆管上皮细胞，由解放军第二军医大学细胞生物学教研室提供[18]。
肝前体细胞异种移植治疗大鼠急性肝损伤研究的主要试剂及仪器：

来源
试剂及仪器
胎牛血清
组织基因组DNA提取试剂盒
Sry引物设计与合成
山羊抗小鼠Alb多克隆抗体，
兔抗小鼠CK-19多克隆抗体
SP免疫组化试剂盒及DAB显色剂
CO2培养箱
PCR仪，凝胶成像分析系统
光学显微镜
全自动生化分析仪
美国Hyclone公司
北京天根生化科技有限公司
大连宝生物工程有限公司
美国Abcam公司

北京中杉金桥公司生物技术有限公司
美国Thermo Fish Scientific公司
德国Eppendorf公司
德国徕卡公司
美国贝克曼库尔特公司

实验方法：
细胞培养：肝上皮样前体细胞用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基置于37 ℃，体积分数5% CO2培养箱内培养。当细胞汇合度增大至80%时胰蛋白酶消化、传代。用于移植的单细胞悬液行锥虫蓝染色后倒置光镜下检查，保证细胞活力大于90%。
大鼠急性肝损伤模型的建立：60只大鼠随机分为假手术组，肝损伤组和细胞移植组，每组20只。肝损伤组和细胞移植组大鼠接受一次腹腔注射CCl4(1∶1溶于玉米油中)，剂量是1 mL/kg。3 d后，大鼠禁食12 h，40 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于鼠板。取腹部正中切口，游离肝脏周围的韧带，显露大鼠肝脏，参照Higgins方法行2/3肝切除[19]，包括肝左外叶，左中叶，右中叶。切除肝中叶时，应注意距离下腔静脉3.0-4.0 mm，避免下腔静脉扭曲、狭窄；结扎左外叶应远离第二肝门，以免影响其他肝叶静脉回流；切除肝叶应彻底，避免残留肝组织缺血坏死影响肝再生。3组大鼠均于肝切除前1 d 给予他克莫司灌胃，1 mg/kg，1次/d，连续3周，以抑制免疫排斥反应。
细胞移植：肝切除后，细胞移植组大鼠在无菌条件下接受肝前体细胞移植。清晰暴露脾脏下级及脾门区，用1 mL注射器经脾脏匀速、缓慢地注射0.5 mL DMEM培养液，内含5×106肝前体细胞。注射时用棉签暂时性按压脾门区，使移植细胞更多的保留在脾脏内，同时避免门脉压力过高及血管栓塞的发生。肝损伤组大鼠注射0.5 mL不含肝前体细胞的DMEM培养液。假手术组打开腹腔后仅分离肝叶和脾脏，不行切除或移植。
免疫组织化学检测肝上皮样前体细胞CK-19/Alb表达：取对数生长期肝上皮样前体细胞以每孔1×105细胞数种植于六孔板内。培养36 h后，细胞爬片从培养孔中取出，PBS冲洗后用体积分数10%中性甲醛固定，行免疫组化分析。免疫组化染色采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(streptavidin-perosidase，SP)法，一抗为兔抗小鼠CK-19多克隆抗体(工作浓度1∶50)和山羊抗小鼠Alb多克隆抗体(工作浓度1∶50)，均4 ℃孵育过夜。PBS冲洗后，加相应生物素标记的二抗，室温孵育1 h，后滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，DAB显色。具体步骤参考试剂盒说明进行。免疫组织化学染色之细胞爬片采图应用德国徕卡DM4000B采图系统进行采集，每张爬片随机采集5个视野。
标本留取：在肝切除后1，5，14和21 d，处死实验大鼠，每个时间点5只。经肝上下腔静脉取全血2-4 mL，用回转半径15 cm 的离心机1 500 r/min离心20 min，取上层澄清血清，置于-80 ℃冰箱保存备用。同时取肝脏标本用体积分数10%中性甲醛固定，24 h后石蜡包埋。另外，取脾脏组织分成2份：一份用体积分数10%中性甲醛固定后石蜡包埋，用于免疫组织化学分析；另一份用于提取脾脏基因组DNA，行Sry序列的PCR反应。
苏木精-伊红染色、血清转氨酶检测观察肝细胞损伤情况：行肝脏组织苏木精-伊红染色评估病理学改变。由2位病理医生双盲读片，重点观察肝切除后不同时间点肝细胞损伤及炎症细胞浸润程度，光学显微镜200×镜下采集代表性苏木精-伊红染色图像。-80 ℃冻存血清采用全自动生化分析仪测定血清丙氨酸转氨酶、天门冬氨酸转氨酶[20]，比较各时间点转氨酶变化。
免疫组织化学法检测大鼠脾脏组织CK-19和Alb表达：取脾脏标本用体积分数10%中性甲醛固定，石蜡包埋， 3 μm切片，分别以抗CK-19抗体(工作浓度为1∶100)和抗Alb抗体(工作浓度为1∶200)4 ℃过夜孵育，后以SP法按试剂盒说明染色。选取每个脾脏标本中段切片3张，每张切片随机选择3个视野采集图像。
PCR法扩增Sry序列：切取小块的新鲜脾脏组织，提取基因组DNA，-20 ℃冻存备用。针对Y染色体特异性Sry序列行PCR反应，以证实雄性小鼠来源的肝上皮样前体细胞在雌性大鼠脾脏实质内存活、定植。以肝上皮样前体细胞的基因组DNA为阳性对照。上游引物是：5’- TGG GAC TGG TGA CAA TTG TC-3’，下游引物是：5’-GAG TAC AGG TGT GCA GCT CT-3’[21]。25 μL的PCR反应体系中含12.5 μL PCR mixture，上下游引物各1 μL (10 mmol/L)，和500 ng基因组DNA。反应条件是94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，最后72 ℃延长5 min。PCR反应产物在含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶上电泳，预计可见402 bp大小的反应产物。
主要观察指标：①各组大鼠肝脏病理表现。②各组大鼠血清转氨酶变化。③Sry序列的PCR扩增。④移植前后Alb、CK-19在肝上皮样前体细胞中的表达。
统计学分析：全部数据采用 SPSS 13.0进行分析，结果以x(_)±s表示，采用单因素方差分析。P < 0.05认为差异有显著性意义。

2 结果 Results

2.1 实验动物数量分析 60只大鼠全部进入结果分析，无脱失。
2.2 肝上皮样前体细胞形态 肝上皮样前体细胞呈上皮样细胞形态，细胞核大而明显。肝上皮样前体细胞生长旺盛，倍增时间平均为24 h，多在贴壁后两三天达到约80%的汇合度，胰酶消化传代。可在体外培养>6个月时间，传代50次以上。连续传代对肝上皮样前体细胞细胞形态和增殖能力无明显影响取对数生长期肝上皮样前体细胞消化重悬得到单细胞悬液，锥虫蓝染色示大于90%细胞拒染呈无色透明状，用于下一步移植实验。
2.3 肝脏病理学表现 在肝切除后1，5，14和21 d取肝脏组织行苏木精-伊红染色检查。假手术组无明显肝组织学异常。CCl4腹腔注射联合2/3肝切除处理诱导的急性肝损伤表现为肝细胞广泛水肿，体积明显增大，肝血窦腔受压变窄，肝细胞胞浆疏松化，可见散在的嗜酸性变性，并有点状坏死伴炎症细胞浸润。细胞移植组大鼠肝细胞水肿较肝损伤组显著改善。在细胞移植后 21 d，肝细胞肿胀消失，大部分肝细胞结构正常，无炎症细胞浸润，见图1。

C：肝损伤组肝切除后14 d
A：假手术组
D：细胞移植组肝切除后14 d
注：肝损伤组肝细胞广泛水肿，体积明显增大，肝血窦腔受压变窄，肝细胞胞浆疏松化，可见散在的嗜酸性变性，并有点状坏死伴炎症细胞浸润。细胞移植组大鼠肝细胞水肿较肝损伤组显著改善。

图1 肝上皮样前体细胞移植对肝损伤大鼠肝脏病理的影响(苏木精-伊红染色，×200)
Figure 1 Effect of hepatic progenitor cells on liver pathological changes of liver injury rats (Hematoxylin-eosin staining, ×200)

B：肝损伤组肝切除后1 d

2.4 血清转氨酶变化 肝损伤组大鼠肝切除后1 d丙氨酸转氨酶升高至(6 808.03±123.36) nkat/L，远远高于细胞移植组(6 024.54±215.04) nkat/L的水平(P < 0.05)。此后，细胞移植组大鼠丙氨酸转氨酶较肝损伤组下降更明显，差异有显著性意义(P < 0.05)。天门冬氨酸转氨酶变化趋势与丙氨酸转氨酶类似，即细胞移植组大鼠天门冬氨酸转氨酶峰值较肝损伤组低，下降更迅速。各个时间点丙氨酸转氨酶和天门冬氨酸转氨酶值及动态变化见图2。
2.5 肝上皮样前体细胞在大鼠脾脏中的定植 提取肝切除后1，5，14和21 d细胞移植组脾脏DNA行PCR反应，PCR产物琼脂糖凝胶电泳可见402 bp大小的条带，提示小鼠Y染色体特异性序列Sry存在于脾脏中。假手术组和肝损伤组未见阳性结果，见图3。
CK-19是肝前体细胞特异性分子标志物，在肝上皮样前体细胞胞浆内表达(图4)，在脾脏内无表达，可用来监测移植的肝上皮样前体细胞在大鼠脾脏实质的定植。细胞移植组大鼠脾脏可见大量CK-19阳性细胞，而假手术组和肝损伤组无阳性细胞，见图5。
2.6 肝上皮样前体细胞在大鼠脾脏实质中分化为肝细胞样细胞 Alb是肝细胞特异性分子标志物，免疫组化显示在肝上皮样前体细胞胞浆内无表达(图4)，在大鼠脾脏内同样无表达，可用来评价移植肝上皮样前体细胞在大鼠脾脏实质中向肝细胞方向分化的能力。Alb阳性细胞在细胞移植后5 d首次出现，而且移植后14 d和21 d阳性细胞数目逐渐增多。假手术组和肝损伤组未见到Alb阳性细胞，见图5。

8 000
6 000
4 000
2 000
0
假手术组
肝损伤组
移植组

a
a
a
a
丙氨酸转氨酶(nkat/L)

1 5 14 21

时间(d)

A：丙氨酸转氨酶

天门冬氨酸转氨酶(nkat/L)
B：天门冬氨酸转氨酶
时间(d)
1 5 14 21
a
10 000
8 000
6 000
4 000
2 000
0

a

a

a

与肝损伤组比较，aP < 0.05。
注：丙氨酸转氨酶与天门冬氨酸转氨酶的变化趋势类似，细胞移植组大鼠天门冬氨酸转氨酶峰值较肝损伤组低，下降更迅速。

图2 肝上皮样前体细胞移植对肝损伤大鼠血清丙氨酸转氨酶的影响
Figure 2 Effect of hepatic progenitor cells on serum aminotransferases levels in liver injury rats

Sry (402 bp)
M 1 2 3 4 5 6 7

400 bp

1：肝上皮样前体细胞；2-5：细胞移植组肝切除后1，5，14和21 d脾脏DNA；6：肝损伤组脾脏DNA；7：假手术组脾脏DNA；M：Marker。
注：肝切除后1，5，14和21 d，细胞移植组脾脏DNAPCR产物琼脂糖凝胶电泳可见402 bp大小的条带，假手术组和肝损伤组未见阳性结果。

图3 肝损伤大鼠进行肝上皮样前体细胞移植后的PCR扩增Sry序列
Figure 3 PCR amplification of Sry sequences in spleen DNAs after transplantation of hepatic progenitor cells

B：肝细胞特异性分子标志物Alb表达
A：肝前体细胞特异性分子
标志物CK-19表达

注：胞浆呈黄棕色为阳性。CK-19在肝上皮样前体细胞胞浆内表达(箭头)，而Alb在肝上皮样前体细胞胞浆内无表达。

图4 肝上皮样前体细胞 CK-19/Alb免疫组化染色(×100)
Figure 4 Immunohistochemical staining of CK-19/Alb in hepatic progenitor cells (×100)

A：假手术组
B：肝损伤组

C：细胞移植组肝前体细胞特异性分子标志物CK-19表达
D：细胞移植组肝细胞特异性分子标志物Alb表达

注：胞浆呈黄棕色为阳性。细胞移植后14 d，细胞移植组大鼠脾脏可见大量CK-19阳性细胞(箭头)和Alb阳性细胞(箭头)，而假手术组和肝损伤组均无CK-19和Alb阳性细胞。

图5 肝损伤大鼠进行肝上皮样前体细胞移植后脾脏CK-19/Alb免疫组化染色(×100)
Figure 5 Immunohistochemical staining of CK-19/Alb in splenic tissues after transplantation of hepatic progenitor cells (×100)

3 讨论 Discussion

急性肝损伤临床多见，治疗较棘手[22-23]，本实验探讨了异种肝前体细胞移植治疗急性肝损伤的效果。实验利用CCl4腹腔注射联合2/3肝切除建立了大鼠急性肝损伤模型。若仅实施2/3肝切除，残存的肝细胞迅速进入增殖状态，经两三次分裂在1周内即可完成肝脏的再生[24]。而在2/3肝切除的基础上辅以肝毒性药物CCl4腹腔注射，则能诱导肝细胞广泛水样变性，点状坏死伴炎症细胞浸润，血清转氨酶水平急剧升高，一般需1个月才能基本恢复肝脏的结构和功能[25]。这有利于评价肝前体细胞移植对急性肝损伤的疗效，另外一方面也可以提供较长时间的增殖刺激，促进移植细胞的植入、存活[26]。
成体肝前体细胞能在受体肝脏内定植并分化为肝细胞。Yasui等[27]将从LEC(Long Evans Cinnamon)大鼠分离得到的肝前体细胞移植入白蛋白缺少症大鼠(Nagase Analbuminemic Rat，NAR)，可见移植的肝前体细胞表现出肝细胞表型并生成白蛋白。Song等[28]从接受DDC(3,，5-diethoxycarbonyl-1，4-dihydrocollidine)饮食的小鼠分离出肝前体细胞，移植入野百合碱腹腔注射联合2/3肝切除处理的受体肝脏。18周后高达40%-50%的肝细胞来源于移植的肝前体细胞，提示肝前体细胞在受体肝脏内的定植，及进一步的增殖和分化。不过，肝前体细胞移植能否促进急性肝损伤的恢复，特别是在非选择性增殖环境下，尚没有研究。理论上，肝前体细胞有很多优点：可较易进一步分化为成熟肝细胞和胆管上皮细胞而改善肝功能；直径较小，经脾脏或门静脉注射不易引起门静脉高压，受体可耐受较高的细胞移植量，也能提高移植细胞的植入效率；与成熟肝细胞相比，肝前体细胞增殖能力强，可更持久、更显著地增殖，参与受体肝脏的再生而促进肝功能的恢复。但是，移植的肝前体细胞尚需在受体中植入并进一步分化为有活性的肝细胞后方可发挥作用，且这一过程需要一定时间。此次研究发现，异种肝前体细胞移植后，血清丙氨酸转氨酶和天门冬氨酸转氨酶逐渐下降，移植后5 d下降约一半，至21 d时基本恢复至基线值，肝细胞肿胀明显减轻，肝细胞增殖活跃。而未移植组大鼠肝功能和肝小叶结构的改善则缓慢得多。这提示移植的肝前体细胞能在受体内迅速、有效植入，并进一步分化为有代谢、解毒功能的肝细胞。
1956年Farber等[29]首次报道在乙硫氨基酪酸、2-氨基乙酰芴及3-甲基-4-二甲基胺苯致癌剂处理的大鼠肝脏门管区发现一类直径较小，细胞核呈卵圆形，核质比高，细胞质轻度嗜碱性着色而细胞核呈淡蓝色的上皮样细胞，并将其命名为卵圆细胞。进一步的研究证实这一类细胞增殖能力强，同时表达肝细胞和胆管上皮细胞的表型并可分化为这两类细胞，是肝前体细胞[30-32]。实验中用到的卵圆细胞由倒千里光碱腹腔注射联合2/3肝切除的小鼠肝脏分离，纯化而来[18]。这类上皮样细胞在门管区活化、增殖，形成管状结构并沿肝板向中央静脉迁徙。在体外培养下高表达CK-19、Thy-1、c-kit等分子标志物，可诱导分化为肝细胞和胆管上皮细胞，因此被命名为肝上皮样前体细胞。大鼠脾脏微环境与肝脏类似，不仅能保证移植细胞的植入、存活及增殖，还能调节、促进基因表达。定植于脾脏的肝细胞具有代谢、合成功能，而且定植位置不同能诱导基因差异表达[16, 33-35]。脾脏植入的肝细胞表达外源基因的能力也远远高于经腹腔或皮下移植途径[17]。另外，经脾移植简便易行，有容纳移植细胞的空间而不易导致门脉压力过高或血管栓塞，安全性高。实验监测了移植后3周内肝前体细胞在脾脏内的植入及向肝细胞方向分化的情况。针对Y染色体特异性Sry序列的PCR反应证实了雄性小鼠来源的肝上皮样前体细胞在雌性大鼠脾脏内的存在。CK-19免疫组化更直观地显示了移植肝上皮样前体细胞在大鼠脾脏实质内大量定植。肝上皮样前体细胞在体外培养条件下不表达肝细胞特异性分子标志物Alb，不过在植入脾脏5 d后有部分细胞显著表达，而且Alb阳性细胞数逐渐增多，提示脾脏微环境能诱导肝上皮样前体细胞向肝细胞方向分化。不过，其确切的分子机制还不明确，需要进一步深入研究。
实验所用的肝上皮样前体细胞是利用胶原酶消化法和胰蛋白酶选择性消化法从倒千里光碱腹腔注射联合2/3肝切除小鼠肝脏中分离、纯化得到的肝上皮细胞系。在单层贴壁培养条件下，而无需额外添加特异性生长因子，肝上皮样前体细胞即可长期、稳定的扩增，同时仍保留双向分化潜能。较成熟肝细胞体外培养多需要3D培养技术及添加特殊的生长因子[36-37]，培养1周内其功能、表型逐步丧失，肝前体细胞的培养无疑更简便易行，经济实用。此外，肝上皮样前体细胞从致癌剂倒千里光碱处理的肝脏中分离得到，表达肝癌标志物AFP等，表现出未分化的细胞形态，提示有可能恶性转化生成肝细胞癌[38]。肝上皮样前体细胞LEPCs可在体外培养长达18个月，传代超过70次，发现仍保持正常核型38+XY，种植入裸鼠皮下未见肿瘤形成。Wang等[39]从接受胆碱缺乏乙硫氨基酪酸补充饮食的大鼠分离出肝前体细胞，在体外培养时间超过2年，传代高达100次，不会抑制肝前体细胞的增殖、双向分化潜能，也不会诱导恶性转化。Piscaglia等[40]研究发现口服2-氨基乙酰芴联合2/3肝切除激活的肝前体细胞在暴露于黄曲霉毒素b1的环境下可发生恶性转变，生成肝细胞癌和胆管细胞癌。这些结果提示肝前体细胞不会自发形成肿瘤起始细胞，不过对致癌因素易感，在肝前体细胞移植实验中需要充分考虑到这一点。
总之，在CCl4腹腔注射联合2/3肝切除诱导的大鼠急性肝损伤模型中，肝前体细胞经脾脏移植后能在脾脏实质内存活、植入并进一步分化为有功能的肝细胞。在这一过程中，移植的肝前体细胞能改善肝功能，促进损伤肝细胞的修复。肝前体细胞移植治疗急性肝衰竭处在研究的早期阶段，是很有前景的新疗法。
作者贡献：万真负责整个课题的实施、实验资料的整理及文稿的撰写，郑幸龙、马佳和向俊西帮忙完成大鼠急性肝损伤模型的制备及细胞移植，马锋和王浩华负责实验资料的分析，吕毅和张晓刚是课题的设计者并对课题负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接地经济或利益的帮助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置完全符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
学术术语：成体肝脏前体细胞-因细胞核呈卵圆形，又称之为卵圆细胞。其位于门管区，在肝严重受损同时成熟肝细胞增殖受抑制时大量活化、增殖，并沿肝小叶延伸，进一步分化生成肝细胞完成受损肝脏的修复。
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4 参考文献 Referen