上海交大网络课程检验微生物讲义4.doc

第十三章 弯曲菌属和螺杆菌属一、教学大纲要求（1）弯曲菌属的主要特点及分类、临床意义、细菌特性、实验室检查。（2）螺杆菌属的主要特性、分类。（3）幽门螺杆菌的临床意义、细菌特性、实验室检查。二、教材内容精要（一）弯曲菌属1弯曲菌属的主要特点及分类弯曲菌属(Campylobacter) 是一类呈逗点状或S形的革兰阴性杆菌，广泛分布于动物界，其中有些可引起动物和人类的腹泻、胃肠炎和肠道外感染。目前弯曲菌属共有18个菌种和亚种，引起人类疾病的主要是空肠弯曲菌空肠亚种，其次是胎儿弯曲菌和大肠弯曲菌等。 2细菌特性（1）形态染色 本属细菌为革兰阴性无芽孢的弯曲短杆菌，不易染色，菌体弯曲呈S状或海鸥展翅状等，一端或两端各有一根鞭毛，运动活泼，暗视野显微镜下呈“投标样”运动。（2）培养特性 微需氧菌，最适生长环境是含氧气5、二氧化碳10、氮气85；孵育温度通常取决于所需要分离的菌株，在不同的温度下培养基的选择性也不同，通常绝大多数实验室用42作为初始分离温度，这一温度对空肠弯曲菌、大肠弯曲菌的生长有利，相反其他菌株在37生长良好。营养要求高，在普通培养基上不生长，分离弯曲菌常用的选择性培养基大多含有抗生素（主要为头孢哌酮），以抑制肠道正常菌群。常用的有含血的Skirrow培养基、头孢哌酮-万古霉素-两性霉素琼脂培养基（CVA）和不含血的碳-头孢哌酮-去氧胆酸盐（CCDA）、碳基选择性培养基（CSM）和半固体动力培养基等。（3）生化反应 氧化酶和触酶阳性，可还原硝酸盐为亚硝酸盐，不分解和不发酵各种糖类，不分解尿素，具体生化反应见表131。（4）抵抗力 本属细菌的抵抗力弱，对一般消毒剂敏感，但耐寒，在4冰箱或水中可存活达4周。 表13-1 弯曲菌属的生化特征生化试验空肠弯曲菌空肠亚种空肠弯曲菌多氏亚种大肠弯曲菌胎儿弯曲菌胎儿亚种胎儿弯曲菌性病亚种海鸥弯曲菌乌普萨拉弯曲菌豕肠炎弯曲菌唾液弯曲菌唾液生物型唾液弯曲菌牛生物型唾液弯曲菌粪生物型瑞士弯曲菌粘膜弯曲菌简明弯曲菌屈曲弯曲菌粪弯曲菌昭和弯曲菌氧化酶+V+W+-+-+硝酸盐还原+-+亚硝酸盐还原-+ND+ND需H2-V-+脲酶-V-+H2S-+-+马尿酸盐水解+V-醋酸吲哚酚水解+-+-+-+15生长-25生长-+-+-42生长+-+-+W+3.5%NaCl生长-+-V-1甘油+-+V+V+V麦康凯培养基+-+-+-+ND+NDNDND萘啶酸VSSVRRSRSRRSRRSSR头孢噻吩RSRSSRSSSSSSSRNDNDS注：+，90阳性；-，10阳性；V，可变；ND，未定；W，反应较弱；S，敏感；R，耐药3临床意义弯曲菌的传播途径主要为食物和水，传播方式多为经口传播，食用未煮熟的鸡、饮用未经处理的水和未经消毒的牛奶均可引起弯曲菌肠炎的发生。本菌具有黏附定居和入侵上皮细胞的能力，通过产生的肠毒素、细胞毒素和内毒素等多种毒力因子致病，病变部位通常在空肠、回肠，也可蔓延至结肠。空肠弯曲菌空肠亚种是弯曲菌中最重要也是最常见的的人体致病菌（占弯曲菌腹泻的8090），腹泻是空肠弯曲菌感染最常见的临床表现。除肠炎外，近年来也出现了空肠弯曲菌继发关节炎败血症、脑膜炎和格林巴利综合征。GBS病人分离到的空肠弯曲菌大都具有特殊的血清型O:19，可与人体的神经组织发生交叉免疫反应而致病。胎儿弯曲菌主要引起肠道外感染，其中胎儿亚种和猫、绵羊的感染性流产关系密切，较少引起人类感染，感染人体常引起全身症状。4微生物学检验（1）检验程序 见图13-1。 粪便、肛拭、剩余食物 血液、脑脊液直接检查 卡-布运送培养基 布氏肉汤增菌分离培养动力检查 直接镜检 （弯曲菌选择性培养基） 7天后不生长弃去 微需氧环境 25、37、42 4872h 可疑菌落 （粉红、光滑、半透明） 动力观察 涂片、革兰染色 （投标样运动） 革兰阴性、弯曲菌 氧化酶（+） 生化反应鉴定 报告 图13-1 弯曲菌属的检验程序（2）标本采集 可采集粪便、肛拭子及剩余食物，标本采集后应立即送检，或将标本接种于卡-布运送培养基中送检；对于高烧和患脑膜炎的病人，可于用药前抽取静脉血或脑脊液，注入布氏肉汤中送检。（3）检验方法1）显微镜检查 悬滴法动力检查：显微镜下观察有无螺旋状或投标样运动，脑脊液标本经离心沉淀后再制成悬滴标本检查；染色标本检查：取新鲜粪便或脑脊液离心沉淀物涂片、革兰染色，查找革兰阴性、弯曲呈S状或螺旋状杆菌，鞭毛染色见一端或两端单根鞭毛；2）分离培养 可将标本直接接种于选择性培养基上，也可将标本过滤后培养，弯曲菌形成的菌落为灰色、扁平、表面湿润、圆形凸起、边缘不规则，常沿穿刺线蔓延生长的菌落，在血平板上不溶血。本属细菌在布氏肉汤中呈均匀混浊生长。培养时需注意气体环境和适合的温度，空肠弯曲菌最适的温度为4243，胎儿弯曲菌在42不生长。3）鉴定 弯曲菌属的鉴定比较复杂，必须综合多种试验才能确定。通常在弯曲菌选择培养基上氧化酶阳性、革兰染色阴性、弯曲呈S形或螺旋形的细菌初步鉴定为弯曲菌，进一步的鉴定试验有：马尿酸盐水解试验：本试验是鉴别空肠弯曲菌空肠亚种和多氏亚种的重要试验，在弯曲菌选择性培养基上经42孵育，氧化酶阳性、有特征性的弯曲菌形态、辅以马尿酸盐试验阳性即可报告为空肠弯曲菌空肠亚种；醋酸吲哚水解试验：本试验空肠弯曲菌为阳性而胎儿弯曲菌为阴性；萘啶酸、头孢噻吩耐药试验：空肠弯曲菌和大肠弯曲菌对萘啶酸敏感，对头孢噻吩耐药；胎儿弯曲菌对萘啶酸耐药而对头孢噻吩敏感。近来出现了对萘啶酸耐药的空肠弯曲菌和大肠弯曲菌，应结合马尿酸盐水解试验进行鉴定。弯曲菌的其余鉴定试验有：不同温度的生长试验（25、37、42）、触酶试验、硝酸盐还原试验、产H2S试验等（见表13-1）。（4）耐药性 由于弯曲菌感染大多呈轻症和自限性，一般不需特异性治疗。体外试验显示，绝大多数弯曲菌对头孢菌素和青霉素耐药，环丙沙星治疗弯曲菌感染非常有效，但近年来也出现了不少耐药菌株。空肠弯曲菌通常对红霉素敏感，其耐药率小于5；而80以上的大肠弯曲菌对红霉素耐药。胎儿弯曲菌引起的全身感染可用红霉素、氨苄西林、氨基糖苷类和氯霉素治疗。（二）幽门螺杆菌1螺杆菌属的主要特点及分类螺杆菌属（Hilicobacter）是一群氧化酶和触酶阳性、微需氧、37能够生长、在25和42均生长不良的革兰阴性弯曲菌。本属细菌最早根据形态染色、培养条件等归于弯曲菌属，1989年Goodwin根据其超微结构、酶活性、脂肪酸序列、生长特性等的不同，建议将其从弯曲菌属中划分出来而成立一个新的属Hilicobacter（螺杆菌属）。本属中现已鉴定的有19个种，研究得最多、最常见的是幽门螺杆菌（H. pylori，Hp）。2幽门螺杆菌的细菌特性（1）形态染色 HP为革兰阴性、无芽孢、呈螺旋状弯曲的杆菌，尤其在胃黏膜环境中，HP具有典型的螺旋形或弯曲形形态，但在陈旧培养物中菌体可呈圆球状；大多数细菌具有位于菌体一端的多根带鞘鞭毛，运动活泼。（2）培养特性 HP为微需氧菌，在需氧及厌氧环境下均不能生长，在潮湿环境37同时提供510O2 、512CO2的条件下生长良好，510H2可刺激其生长；最适生长温度3537，30和42均生长不良，此点可与其他弯曲菌相区别，pH5.58.5均能生长；营养要求高，普通培养基不能生长，常用的培养基有心脑浸出液琼脂、布氏琼脂、哥伦比亚琼脂等，培养基中需补充一些特殊物质如血液、血清、淀粉、活性炭等，在Campy-BAP培养基上不生长。选择培养基可用改良的Skirrow琼脂培养基加入万古霉素、两性霉素和cefsulodin，本菌在非选择性血平板上经35天孵育后形成小的半透明灰色菌落，有微弱的溶血环，革兰染色很浅。（3）生化反应 生化反应不活泼，氧化酶和触酶阳性，不分解任何糖类，脲酶强阳性，可与本属其他细菌区别，也是检测HP的快速诊断方法之一。具体生化特征见表13-2。表13-2 螺杆菌属各菌种的生化特征菌种触酶硝酸盐还原碱性磷酸酶脲酶醋酸吲哚酚水解谷氨酸转肽酶42生长1甘油萘啶酸头孢噻吩幽门螺杆菌+-+-RS毕氏螺杆菌+-RS犬螺杆菌-+-+ND+NDSI同性恋螺杆菌+-+SI菲氏螺杆菌+-+-+-+SS幼禽螺杆菌+-ND+NDRSH.westmeadii+-NDND-NDSR注：+，90阳性；-，10阳性；ND，未定；S，敏感；R，耐药；I，中介（4）抵抗力 HP对酸敏感，尿素对HP可起到保护作用，1胆盐可抑制HP生长。2临床意义HP有较强的鞭毛动力和对胃黏膜/黏液有较强的黏附力，使HP能在接近中性的黏膜层中定植，产生强活性的尿素酶，分解尿素，在菌体周围形成保护性氨环境，以抵抗胃黏膜上皮细胞分泌的胃酸；HP产生的蛋白酶能有效分解黏液蛋白，提供营养。HP在胃内定植后，通过对胃黏膜上皮细胞的黏附性、胃肠激素的作用、细胞壁脂多糖中脂质A的致炎作用、产生多种酶（包括：尿素酶、蛋白酶、过氧化氢酶、脂酶和磷脂酶等）以及产生的细胞毒素等等，这些因素的共同作用导致临床疾病的发生。在临床上主要引起消化性溃疡（十二指肠溃疡、胃溃疡）、慢性活动性胃窦炎等，长期感染易发展为萎缩性胃炎、胃腺癌和胃黏膜淋巴组织淋巴瘤。3微生物学检验（1）检验程序 见图13-2。 胃、十二指肠活检标本 血清、胃液显微镜检查 PCR 分离培养 血清检测 快速尿素 微需氧 高湿度革兰 病理 免疫 酶试验 30、 37、42 IgG SIgA染色 切片 组化 37d 特殊 染色 初报 30不长 37生长 42不长 可疑菌落革兰染色、氧化酶（） 触酶（）动力（） 生化反应 报告图13-2 幽门螺杆菌检验程序（2）标本采集 多部位采集胃、十二指肠黏膜标本，标本要新鲜，保持湿润，置2ml无菌等渗盐水中保存，在运送途中不超过3h，在4下最多保存5h。流行病学调查和检测治疗效果时可取血清检查。（3）检验方法1）显微镜检查 直接镜检：取胃、十二指肠黏膜活检标本作革兰染色，在油镜下查找细长弯曲或呈海鸥展翅状排列的菌体；由于涂片是在HP定植部位的黏膜进行观察，阳性率很高，是简便、实用、准确和较快速的诊断方法；组织学切片：可行Warthin-Starry银染色、改良Giemsa染色、甲苯胺蓝染色、石炭酸复红染色等。2）分离培养 用含5绵羊血的布氏琼脂或加入7马血的心脑浸液作为非选择性培养基，用改良的Skirrow琼脂（加入万古霉素10mg/L、两性霉素B10mg/L、甲氧苄啶5mg/L）作为选择性培养基，在含5O2、10CO2、85N2的微需氧环境中37孵育35天，长出细小、灰白色、半透明、不溶血的菌落。3）快速检查 快速脲酶试验：取一小块新鲜活检标本置于含尿素的培养基中，由于幽门螺杆菌产生大量的细胞外尿素酶（相当于普通变形杆菌的2070倍），可分解尿素产大量的氨，使培养基pH升高，指示剂变色，能在5min30min内检测出幽门螺杆菌；这是一种简便实用、快速灵敏且较为准确的检测Hp方法，适合胃镜检查的病人；核素标记试验：本试验的敏感性和特异性均很高，但操作起来稍繁琐；PCR：是一种高度敏感和特异的方法，但由于实验条件要求较高，目前仅用于实验研究；抗原检测：可用已有的商品化试剂盒，用ELISA法直接检测HP的菌体抗原。4）鉴定 本菌的鉴定主要通过典型的菌体形态，生长缓慢，仅于37生长。氧化酶和触酶阳性，脲酶强阳性，对萘啶酸耐药，对头孢噻吩敏感，在1甘油和1胆盐中均不生长。具体生化特征见表13-2。4耐药性 HP对多粘菌素、三甲氧苄氨嘧啶、磺胺、万古霉素和萘啶酸天然耐药。在体外药敏试验中，HP对许多抗生素都很敏感，但体内用药效果并不满意，主要因为HP寄生在黏液层下的胃上皮细胞表面，抗生素不能渗入胃黏膜深层。临床上治疗HP的药物有阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素、四环素、呋喃唑酮等。