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猪伪狂犬病毒快速检测方法研究进展2023 年 第 9 期猪伪狂犬病毒快速检测方法研究进展张众1，王新茹2，殷健3，陈彤3，庄林林2，申秋平2*（1.沛县畜牧兽医站，江苏 徐州 221600；2.江苏农林职业技术学院，江苏 镇江 212400；3.国药集团扬州威克生物工程有限公司，江苏 扬州 225127）摘 要：猪伪狂犬病（pseudorabies，PR）给我国养猪业造成了巨大的经济损失，因此快速准确地检测猪伪狂犬病毒对于净化PR具有重要意义。文章总结了猪狂犬病毒快速检测方法的研究进展：基于免疫学的检测技术包括酶联免疫吸附试验、免疫层析技术、荧光微球免疫检测方法；基于核酸的检测技术包括常规聚合酶链式反应（PCR）、定量PCR、数字PCR、基于PCR的新型分子诊断方法、环介导等温扩增、重组酶聚合酶扩增以及重组酶介导核酸等温扩增技术。文章对上述方法的研究与应用进行展望，旨在为有效防控PR和科学净化PR提供参考。关键词：猪伪狂犬病毒；酶联免疫吸附试验；PCR方法；等温扩增技术中图分类号：S 852.65+9.1 文献标识码：A 文章编号：1672-9692（2023）09-0092-05Advances in rapid detection methods for porcine pseudorabies virusZhang Zhong1,Wang Xinru2,Yin Jian3,Chen Tong3,Zhuang Linlin2,Shen Qiuping2*(1.Peixian Animal Husbandry and Veterinary Station,Jiangsu Xuzhou 221600;2.Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry,Jiangsu Zhenjiang 212400;3.Sinopham Yangzhou ac Biological Engineering Co.,Ltd.,Jiangsu Yangzhou 225127)Abstract:PR caused huge economic losses to the pig industry in China,so rapid and accurate detection of porcine pseudorabies virus is of great significance for the purification of PR.In the paper,the research progress of rapid detection methods of rabies virus is summarized.The detection techniques based on immunology include enzyme-linked immunosorbent assay,immunochromatography and fluorescence microsphere immunoassay.Nucleic acid-based detection techniques include conventional PCR,quantitative PCR,digital PCR,novel PCR-based molecular diagnostic methods,ring-mediated isothermal amplification,recombinant polymerase amplification,and recombinant enzyme-mediated isothermal amplification of nucleic acid.In the paper,the research and application of the above methods are prospected,aiming at providing reference for effective prevention and control of PR and scientific purification of PR.Key words:Pseudorabies virus;ELISA;PCR method;Isothermal amplification techniques伪狂犬病是由伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的一种急性、接触性传染病1-2。PRV感染会导致猪的生长及繁殖指标严重下降，给我国养猪业造成了一定经济损失。我国将猪伪狂犬病列入需要进行净化的疫病的行列，并通过PRV糖蛋白基因（gE）缺失疫苗有效遏制了疫情蔓延。但近年来有研究发现，PRV野毒株已发生新变异（PRV 型）且毒力强于经典毒株（PRV 型），现有的疫苗难以提供有效保护。目前，国内外临床中均有人感染PRV的案例，主要表现为视网膜炎或眼内炎，严重者可表现为急性脑炎，甚至发展为神经系统症状3。因此，精准检测PRV对有效防控潜在的PRV感染风险具有重要意义。本文就当前国内外已发表的PRV快速检测方法进行综述，以期为我国猪伪狂犬病净化以及科学防控潜在的PRV感染风险提供参考。1基于免疫学的检测方法1.1酶联免疫吸附试验检测方法酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是将抗原或抗体固定到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性反应进行定性或定量检测的方收稿日期：2023-03-14作者简介：张众，本科，研究方向为动物疫病防治。通讯作者：申秋平，硕士，研究方向为畜禽病原微生物快速诊断技术及应用。基金项目：江苏农林职业技术学院青年扶持项目（2022kj32）；江苏省高等学校基础科学（自然科学）研究面上项目（22KJB180001）92现代畜牧兽医2023 年 第 9 期法。袁梦等4通过表达PRV FA株糖蛋白gE制备单克隆抗体，开发了一种特异性的竞争ELISA抗体检测试剂盒，结果表明，该试剂盒效价可达1 5 120。郭忠欣等5以PRV流行株 gE 重组蛋白为包被抗原，建立了一种可快速检测PRV野毒株抗体的间接ELISA方法。经试验验证，间接ELISA方法与PRV疫苗免疫血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2）等无交叉反应性，且检测结果与商品化gE-ELISA试剂盒具有较高的一致性。寇晓晶等6基于PRV gE蛋白建立的ELISA 抗体检测方法与商业化试剂盒总体符合率达89.84%，并具有良好的可重复性。刘旻翾等7以PRV gB蛋白为包被抗原，建立了一种间接ELISA抗体检测方法。研究表明，该方法检测限为血清稀释度1 128，且具有良好的特异性，与口蹄疫病毒、猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）等阳性血清无交叉反应。为简化采样步骤，Cheng等8利用ELISA方法评估了直接从猪口腔液中检测PRV抗体的效果。结果显示，基于口腔液检测的IgG ELISA表现出良好的诊断性能（ROC曲线下面积为93%）和可重复性（R2=99.3%）。研究表明，猪口腔液有望作为可选采样方案用于PRV的快速检测。1.2免疫层析技术检测方法免疫层析技术是一种简单、快速、成本可控的检测方法，能够利用特异性的抗原-抗体反应对靶标进行快速识别，适用于栏边检测9。王华俊等10利用胶体金标记纯化的抗PRV gB单克隆抗体制备出一种可用于PRV即时检测的胶体金试纸条。经测试，该试纸条具有较低的检测限，且与PRRSV、PPV等无交叉反应性。陈辉11使用铕纳米颗粒标记PRV病毒颗粒和羊抗鸡IgY制备出荧光探针，开发出一种快速灵敏的PRV gE抗体阻断荧光免疫层析试纸条。经测试，该方法与其他猪病病毒感染血清的交叉反应率低，批内和批间变异系数均小于15%，且具有较长的保存期限，为PRV现场快速检测提供了新的有力支持。1.3荧光微球免疫检测方法微纳米磁珠具有表面积大、易制备和储存、表面可进行多种修饰、超顺磁性等优点。在免疫学检测中，微纳米磁珠可以快速分离、富集、纯化和检测靶分子，特别是对存在于复杂的生物体系中，且具有浓度低、难以检测特点的分子来说更具优势。Ji等12将PRV gE和gB重组蛋白偶联到磁性微球上，建立了一种可快速检测PRV的双重荧光微球 免 疫 检 测 方 法（fluorescent-microbead immunoassay，FMIA）。结果表明，与ELISA相比，FMIA方法对gE-IgG的特异性、敏感性分别为99.26%和92.30%，对gB-IgG的特异性、敏感性分别为95.74%和96.30%。同时，该方法可准确鉴别PRV野毒株感染和疫苗株免疫应答。曾梦13将PRV gE、gB重组蛋白与磁性微球偶联并将其作为捕获载体，分别建立gE、gB IgG抗体单重及双重FMIA方法。分析表明，FMIA方法具有良好的特异性和临床适用性。免疫学技术作为实验室常规检测技术之一，现已广泛应用于畜禽病原微生物的抗原（抗体）检测。当前，应用于PRV检测的免疫学方法主要包括ELISA、免疫层析技术以及荧光微球免疫检测方法等。其中，ELISA法灵敏度和可重复性较高，且抗体检测结果可以实现定量或半定量分析，在PRV快速检测中表现出良好的临床适用性；免疫层析试纸操作简单、快速，结果可目视判断，适用于现场即时检测；荧光微球免疫检测方法具有灵敏度高、支持抗原/抗体多重检测且可实现靶标快速分离等优势，为PRV快速检测提供了新的支持。但是，上述方法均基于免疫学原理，而抗原抗体具有交叉反应性，所以在特异性方面上述方法仍有待提升。而且动物从感染病原到产生抗体需要时间，因此基于抗体检测的方法具有一定的滞后性，难以实现早期诊断。未来，随着功能性微纳米材料的应用以及多学科的交叉融合，对猪伪狂犬病的检测方法在目标抗体（抗原）捕获、检测时间、结果呈现方式等方面有望得到优化，其灵敏度、特异性以及可重复性等将进一步得到提升。2基于核酸的检测方法2.1基于PCR的检测方法2.1.1常规PCR检测方法PCR技术是由Kary Mullis于20世纪80年代开发出的一种核酸高效扩增方法14。该技术的原理是在DNA聚合酶的作用下，通过变性、退火、延伸等循环变温过程，以引物为起点不断合成与模板链互补的新DNA链。PCR反应完成后，目标序列数量将达到数十亿个拷贝。王豕辰等15研究建立的PRV PCR检测方法经优化后，特异性良好，与非PRV病毒无交叉反应性。王凤求等16根据PRV gB、gE基因设计引物建立了一种可快速检测PRV野毒株的PCR方法。经临床样品验证，靶向gB和gE的PCR检测结果符合率为100%。2.1.2多重PCR检测方法多重PCR（multiplex PCR）技术是在PCR基础上发展出的一种可同时检测多个靶序列的核酸扩增技术。通过在同一反应管中同时添加多对扩增引物，经条件优化后即可以实现多靶标同时扩增，有效提高了PCR的效率和准确性。王颖旺等17根据PRV UL27基因、猪瘟病毒（classical 932023 年 第 9 期Modern Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicineswine fever virus，CSFV）ORF1基因和猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）N基因设计引物，建立了一种可快速检测PRV、CSFV和PEDV的三重PCR方法。结果表明，该方法对PRV、CSFV、PEDV的检测限分别为12.00、0.05和3.50 pg，且特异性良好。此外，为精准区分PRV疫苗株和野毒株，范克伟等18基于PRV gE及gB基因序列设计引物建立了可区分两种毒株的双重PCR方法。基于该方法，PRV野毒株的扩增产物分别为400 bp和582 bp的两条片段，而PRV疫苗株的产物为582 bp的单一片段。经临床样本验证，该双重PCR的检测结果与常规PCR一致。2.1.3荧光定量PCR检测方法荧光定量PCR（qzuantitative PCR，qPCR）是一种可用于精确测定样品中核酸数量的分子技术。与常规PCR不同的是，qPCR可以在反应过程中通过荧光曲线实时反映PCR产物的累积量，具有更高的灵敏度，可以实现靶标定量检测。温书香等19基于PRV gE基因设计扩增引物，建立的qPCR方法显示出良好的特异性和可重复性，可用于PRV快速准确定量。蔡晴霞等20根据gE基因设计特异性引物及探针，能够准确区分PRV野毒株与疫苗株，且与PCV2、CSFV等其他猪源病毒均无交叉反应性，同时具有良好的可重复性。针对同样的靶标，侯月娥等21试验建立的TaqMan qPCR方法可以区别野毒株和基因缺失疫苗株。经检测，该方法可精准检出PRV野毒株感染，且灵敏度比常规PCR高两个数量级。胡铭哲等22通过对PRV全基因组进行分析，在 PRV 型gC基因上筛选出一段不同于PRV 型的47 bp的差异序列并分别建立了单重和双重PRV 分型检测方法。结果显示，该方法能够准确区分PRV 型和型，且针对PRV 型、型的最低检测限均为1104 拷贝/L。此外，qPCR也可应用于准确定量PRV疫苗的病毒含量。李雪峰等23基于PRV gB基因设计引物和TaqMan探针，建立qPCR方法检测PRV灭活疫苗中的抗原含量。经测试，该方法灵敏度高，与其他病毒无交叉反应。华涛等24研究表明，qPCR方法可应用于准确检测PRV弱毒疫苗的病毒含量。2.1.4数字PCR检测方法数字PCR（digital PCR，dPCR）是一种用于核酸精准定量检测的新型分子技术，可检测极低浓度的DNA或RNA分子25。与qPCR技术相比，dPCR无须制作标准曲线，具有更高的灵敏度、特异性和耐受性，可以实现对样品中目标分子的绝对定量分析。数字PCR可分为两种类型：液滴数字PCR和芯片数字PCR。液滴数字PCR通过在液滴中分离DNA分子，每个液滴内只存在1个或0个DNA分子，之后同时进行PCR扩增并采集荧光信号。根据泊松分布和阳性比例即可以计算出初始样品中的DNA分子数；芯片数字PCR是通过将样品加入微型反应室（通常为10100 L）中，每个反应室中有一定数量的DNA分子，之后在芯片上进行PCR扩增和分析。Ren等26开发出一种液滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）方法，可应用于快速准确检测PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株。分析结果表明，ddPCR灵敏度高于qPCR，且样品检测结果与qPCR的检测结果具有较高的一致性。2.1.5基于PCR的新型检测方法随着PCR技术的不断进步以及多学科技术的融合发展，基于PCR的新型检测方法在检测PRV感染方面更加灵敏和高效。乌那尔汗等27将PCR和核酸斑点进行杂交建立了一种可快速鉴别PRV野毒株和疫苗株的检测方法。结果表明，该方法检测出PRV野毒株与PRRSV、PCV2等其他病毒均无交叉反应。张悦勇等28基于gB基因建立了一种可快速检测PRV的纳米PCR方法。结果表明，该纳米PCR方法的检测限为10拷贝/L，比常规PCR低2个数量级，且具有良好的特异性和临床检测适用性。胡轻轻29基于PRV TK和gE基因建立的 PCR 介导的 CRISPR/Cas12a荧光检测报告系统具有灵敏度高、特异性好等优点，而且将侧向层析试纸条与CRISPR/Cas12a结合，无须设备即可实现检测结果快速判读。结果表明，该方法适用于现场快速检测。2.2核酸等温扩增方法2.2.1环介导等温扩增技术环 介 导 等 温 扩 增 技 术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种高效、灵敏、操作方便的核酸扩增技术，可在单一温度条件下对目标基因序列进行快速扩增30。陈珍金等31根据PRV gB基因序列保守区域设计LAMP扩增引物，并对其灵敏度、特异性进行评估。经临床样品验证，建立的LAMP方法具有良好的特异性，且样本检测结果与qPCR结果具有高度一致性。En等32建立的LAMP方法可在63、1 h内完成PRV DNA扩增。同时，通过Hinc 酶对LAMP产物进行消化，验证了方法的准确性和特异性。此外，经临床样本验证，LAMP结果与PCR具有良好的相关性。2.2.2重组酶聚合酶扩增技术重 组 酶 聚 合 酶 扩 增 技 术（recombinase polymerase amplification，RPA）是近年来发展起来的一种核酸等温扩94现代畜牧兽医2023 年 第 9 期增技术33。该技术利用重组酶酶促作用启动扩增反应，并基于聚合酶链式反应原理，能够在常温下迅速扩增目标核酸片段。与PCR相比，RPA具有更短的反应时间、更高的灵敏度和特异性。因此，Yang等34基于PRV gD基因分别建立实时 RPA 方法和联合免疫层析试纸（lateral flow dipstick，LFD）应用的 RPA-LFD 检测方法，RPA 可在39、20 min内完成靶基因扩增。上述两种方法检测限分别为100和160 拷贝/反应，且均具有良好的特异性。为快速鉴别PRV野毒株和疫苗株，刘立兵等35基于gB和gE基因设计出特异性扩增引物，建立了一种双重RPA方法，可在20 min内完成对PRV野毒株和疫苗株的区分。同时，该方法具有良好的特异性，针对PRV gB和gE基因的检测限均为102 拷贝，与qPCR方法相当。2.2.3重组酶介导等温核酸扩增技术重组酶介导等温核酸扩增技术（recombinase-aided amplification，RAA）是一种近年来发展的核酸扩增方法，利用该技术可在等温条件下快速、准确地扩增 DNA 或RNA。该方法基于重组酶、聚合酶和单链DNA结合蛋白等的协同作用，可以实现对目标序列的高效扩增。Tu等36根据PRV gE基因设计引物和探针，建立了一种实时荧光RAA方法以快速检测PRV。结果表明，该方法灵敏度与qPCR相当，且可特异性检出PRV野毒株，与gE基因缺失疫苗株以及其他猪源病毒无交叉反应性。经206份临床样本验证，该方法检测结果与qPCR具有较高的符合率。基于核酸的检测方法已经成为实验室检测PRV的常用方法。其中，PCR方法因其灵敏度高、特异性好、支持高通量和早期检测等优势，已广泛应用于PRV检测。但是，常规PCR需要使用琼脂糖凝胶电泳观察结果，易造成气溶胶污染；荧光定量PCR和数字PCR虽然简化了检测流程并且具有更优异的检测性能，但目前其相关试剂及仪器成本依然较高，难以推广给资源条件有限的用户；等温扩增技术不同于PCR，无须依赖特殊设备进行循环变温扩增，且结果呈现方式多样，为现场快速检测PRV提供了新的可选工具支持。但目前，核酸等温扩增技术在引物设计、反应体系成熟度以及可重复性等方面仍有待提升，现有方法难以兼顾灵敏度和特异性。随着分子技术的不断进步和多学科技术的交叉融合，期待未来相关技术能不断发展，为实现PRV快速、精准检测提供有力工具支持。3结论目前，在不同场景及应用需求下，基于免疫学的检测方法（包括酶联免疫吸附试验、免疫层析技术以及荧光微球免疫检测方法等）以及基于核酸的检测方法（包括基于PCR的方法以及等温扩增技术等）为PRV检测提供了多种可选工具支持。基于免疫学的检测方法简单、易于操作，可以监测抗体水平。但这类方法容易受到抗原抗体交叉反应影响，存在潜在的误判率。基于PCR的检测方法灵敏、特异，结果可靠。但这些方法对样品的预处理和设备检测等具有一定要求，且不适用于栏边检测。核酸等温扩增方法对设备要求大为简化，且快速便捷，但在技术成熟度等方面仍有待进一步提升。随着科学技术的不断发展和多学科的融合创新，相关技术将不断进步，同时，基于免疫学和核酸的检测方法也将不断实现优势互补，为快速、精准地检测PRV提供更加灵敏、特异、便捷的方法，以便更好地满足临床实践中多样化的实际检测需求。参考文献1 胡铭哲,董伟仁,颜焰,等.猪伪狂犬病毒基因分型PCR检测方法的建立J.中国兽医科学,2021,51(8):983-992.2 王春芳,付琦媛,郑宾宾,等.伪狂犬病毒跨物种感染与传播J.病毒学报,2022,38(4):1001-1006.3 Liu Q Y,Wang X J,Xie C 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